脂質體包裹熒光受體方法研究a-突觸核蛋白在磷脂膜上的結構和動態(tài)特征*

馬東飛 侯文清 徐春華 趙春雨 馬建兵 黃星榞 賈棋 馬璐 劉聰 李明 陸穎 ?

1) (中國科學院物理研究所, 北京凝聚態(tài)物理國家研究中心, 軟物質物理重點實驗室, 北京 100190)

2) (中國科學院上海有機化學研究所, 中國科學院生物與化學交叉研究中心, 上海 200032)

3) (中國科學院大學, 北京 100049)

a?突觸核蛋白(a?synuclein, a?syn)在帕金森病的發(fā)病機理中起著關鍵的作用, 因而近年來受到了越來越廣泛的關注.a?syn在膜上的動力學過程對理解其功能至關重要.本文使用基于脂質體的單分子熒光衰減方法—LipoFRET, 首次對較高濃度下a?syn與磷脂膜的相互作用的動態(tài)過程進行了單分子層面上的研究.研究發(fā)現(xiàn), 在溶液中a?syn濃度升高時, 其中央NAC區(qū)域可離開磷脂膜表面進入水相中; 而N端部分位于膜表面內的位置變淺, 并有更高的概率脫離膜表面進入溶液中.利用單分子熒光成像對a?syn解離的觀察則發(fā)現(xiàn),隨著溶液中的a?syn濃度升高, 脂質體上的a?syn解離速率加快.因此高濃度下, a?syn在膜上各區(qū)域垂直位置變化促進了蛋白從膜上的解離.結合LipoFRET的實驗結果可以推斷, a?syn的解離可能是由于不同的a?syn分子膜作用位點互相競爭而導致的解離.這樣的特征, 可能是體內環(huán)境中影響a?syn控制其聚集的重要性質.

1 引 言

a?突觸核蛋白 (a?synuclein, a?syn)是存在于神經系統(tǒng)突觸前末梢與核周的一種可溶性蛋白.a?syn的研究近年來備受關注[1?4], 它與神經退行性疾病存在密切的關聯(lián), 是帕金森病患者腦部病理性特征路易小體的主要組成部分[5,6], 其生理功能到目前為止仍不明確.但有研究者認為a?syn與神經可塑性及突觸囊泡的釋放有關[2,7].

a?syn由140個氨基酸殘基構成, 其N端1?95殘基在磷脂膜的存在下容易形成兩親性的a?螺旋,因而是該蛋白與膜相互作用的主要位置.而C端(96?140)在生理條件下則攜帶大量的負電荷, 一般認為此區(qū)域不與磷脂膜相互作用而游離在水相中[8,9].a?syn的C端被認為是其結合金屬離子與其他配體的重要區(qū)域[10,11].在蛋白的中央(61?95殘基)是蛋白的NAC區(qū)域, 該區(qū)域與a?syn的聚集行為密切相關[7,12].在水溶液中, a?syn是舒展的無規(guī)結構[13], 結合至膜上之后, N端則形成富含a?螺旋的結構[14].關于a?syn在膜上的構象, 有研究者認為, a?syn以37?45殘基為分界, 在膜上形成中央斷開的兩段螺旋結構[8]; 也有研究者認為a?syn的1?95殘基在膜上形成一整段較長的a?螺旋[9].進一步的研究指出, 這兩種構象在脂質體上均存在, 而其比例可能受到膜曲率的影響[15].a?syn與含有負電荷的磷脂雙層膜(如含有PA, PS, PG等)具有較強的相互作用[16,17].

關于a?syn與磷脂膜作用的細節(jié), 此前已有一些研究, 一般是利用中子反射、色氨酸熒光的重原子淬滅等方法進行.一種觀點認為a?syn的N端螺旋插入磷脂膜內0.9—1.4 nm處[18], 或是距離磷脂雙分子層中心0.9—1.1 nm[19]; 也有研究者得出了a?syn僅位于磷脂膜頭部的結論[20].然而這些結果均是采用系綜與時間平均的方法得出的, 并未反映a?syn在膜當中的動態(tài)過程.此前, 本課題組開發(fā)了LipoFRET方法, 在單分子層面對a?syn與膜的相互作用進行了研究[21], 結果表明, a?syn T72位點附近的區(qū)域處于膜表面附近.而K10位點附近的區(qū)域可深入膜中, 并且在幾個不同深度之間做緩慢的運動.

到目前為止, 有一些研究指出, a?syn可形成寡聚體并對膜產生破壞[1,22?24], 或者磷脂膜的存在有可能起到降低聚集的濃度閾值(可低至nM級別)的作用[25].這有可能是導致帕金森病發(fā)生的重要因素.但尚未有文獻報道在寡聚濃度條件下的a?syn與膜, 以及寡聚過程啟動初期a?syn分子之間相互作用的單分子水平上的動態(tài)細節(jié).而單分子熒光方法在研究生物大分子的動態(tài)過程中具有獨特的優(yōu)勢[26,27].為了探究一定濃度下a?syn在磷脂膜上的行為與單分子濃度水平上的區(qū)別, 本文采用了一種基于脂質體的單分子熒光衰減方法—LipoFRET, 以及單分子熒光成像的方法研究了溶液中存在較高濃度的a?syn時, 其與磷脂膜之間相互作用的變化.結果表明, 在濃度50 nM (1 M =1 mol/L)的 a?syn存在時, a?syn的 NAC區(qū)域可從膜表面位置脫離并進入溶液中, 而N端第一螺旋位于膜內的概率減小且深度變淺, 并有較大的概率脫離膜表面進入溶液中.這種變化促進了a?syn從膜上的解離.我們認為高濃度的情況下a?syn之間對磷脂膜結合區(qū)域的競爭性占據是導致高濃度促進a?syn從膜上的解離的原因.

2 實驗材料、原理與方法

2.1 LipoFRET方法的原理

LipoFRET是單個熒光供體對包封在脂質體中的多個淬滅劑分子(作為熒光受體)的共振能量轉移[21].在同一時刻, 供體對任意一個受體均有發(fā)生能量轉移的概率, 其速率與各自距供體的距離有關.最終的能量轉移總速率是所有能量轉移速率的總和[21,28,29], 可以寫成

其中, kt為總的能量轉移速率; τD為熒光供體在無受體情況下的熒光壽命; r0i為供體對第i個受體分子的F?rster特征距離, 對于單一組分的淬滅劑而言, (1)式中的r0i均為相同的值r0; ri為供體與第i個受體分子的空間距離.于是, 能量傳遞效率ET可寫為

供體的相對亮度由F/F0= 1 — ET決定, 其中F為供體在有淬滅劑存在時的亮度, F0為供體在無淬滅劑時的亮度.

對于膜蛋白來說, 其熒光標記位點距離膜外表面越近, 或在膜中的位置越深, 標記在膜蛋白上的熒光基團距離淬滅劑越近, 能量轉移效率越高, 熒光基團的相對亮度F/F0越低.LipoFRET就是利用對熒光基團亮度的測量來監(jiān)測膜蛋白特定位置的垂直運動的(圖1(a)).

實驗中, 采用臺盼藍作為淬滅劑, 其與a?syn上標記的熒光Alexa Fluor 555 (Alexa 555)之間的相對亮度與Alexa 555到脂質體磷脂膜內表面上的距離之間的關系如圖1(b)所示.

2.2 LipoFRET的實驗步驟

LipoFRET實驗包括制備包封臺盼藍的脂質體以及熒光觀測兩部分.

1) 脂質體的制備過程

圖1 LipoFRET方法 (a) LipoFRET的實驗體系示意圖;(b) LipoFRET的距離?相對亮度曲線, 其中淬滅劑為臺盼藍, 所用的熒光分子為Alexa Fluor 555 (Alexa 555), 距離是指熒光基團到脂質體磷脂雙層膜的內表面的距離, 曲線分別對應包封2.5 mM (上方曲線)及5 mM (下方曲線)臺盼藍的脂質體.Fig.1.The LipoFRET method：(a) The schematic picture of LipoFRET experiment; (b) the relationship between dis?tance from the inner surface of the liposome lipid bilayer and relative intensity F/F0.The quencher used here is tryp?an blue and the fluorophore is Alexa Fluor 555 (Alexa 555).The curves correspond to liposomes encapsulating 2.5 mM(above) and 5 mM (bottom) trypan blue.

首先, 將所用磷脂以2 mg/mL的濃度溶解在玻璃瓶中的氯仿與甲醇的混合液當中并振蕩均勻,其中氯仿與甲醇的總體積比為2∶1.本文中所用的脂質體磷脂組分為70% DOPC, 30% DOPA, 0.1%的 16∶0 Biotinyl?cap PE (質量百分比).接著, 將玻璃瓶敞口放置于真空干燥器中, 抽真空過夜以抽干溶劑.此時, 磷脂應在瓶壁上形成一薄層.然后,以每毫升0.5—1 mg磷脂的比例, 在瓶中加入5 mM(或2.5 mM)臺盼藍溶液, 并將玻璃瓶封好在搖床上振蕩1 h.此時瓶中磷脂形成了大小不均一的脂質體懸浮液.隨后, 將液體轉移至塑料的小離心管中, 放入液氮中將液體速凍, 接著轉移至37 ℃的水浴中解凍, 反復凍融5個循環(huán), 再使用擠出器(Extruder, 購于Avanti Polar Lipids)將溶液來回擠壓通過孔徑為100 nm的聚碳酸脂膜.收集制備好的脂質體.接下來, 使用填料為Sephadex G?25的脫鹽柱進行凝膠過濾, 將脂質體從未包封的臺盼藍中分離出來; 或將溶液稀釋10倍后, 采用規(guī)格為100 kD的超濾離心管反復進行超濾, 控制轉速與離心時間, 每次留下約一半的液體, 并采用緩沖液補充至原體積, 直到將未包封的臺盼藍稀釋至較低水平.

在制備包封臺盼藍的脂質體的同時, 應制備包封實驗用緩沖液(10 mM PBS, pH = 7.4, 0.9%NaCl)的脂質體, 用于測定F0的值.

2) LipoFRET熒光觀測的步驟

制作可供進液與排液、適合裝載在全內反射熒光顯微鏡上的樣品腔室.其中朝向鏡頭的蓋玻片厚度為0.17 mm.蓋玻片朝向腔室內部的一面預先修飾mPEG以防止實驗中蛋白的非特異性吸附, 同時亦修飾Biotin?PEG以供脂質體向玻片表面的連接.

實驗裝置采用以全內反射熒光顯微鏡和EMCCD為基礎的雙通道熒光共振能量轉移觀測裝置[30?32], 但需要將全內反射場的角度調整為“贗全內反射 (Pseudo?TIRF)[33]”的程度, 以避免光強在脂質體直徑尺度內的衰減而帶來上下光強不一致的情況.使用ImageJ等軟件記錄及分析光強數(shù)據.

實驗中, 首先向腔室中注入緩沖液以潤洗玻片表面.接著, 注入濃度為0.01 mg/mL的Streptavidin溶液, 待其反應5—10 min后, 沖去多余的Strepta?vidin.將包封有臺盼藍的脂質體稀釋注入腔室, 反應約2 min, 再注入一些脂質體以補充反應消耗.進而, 向腔室中注入標記Alexa 555的a?syn (a?syn T72C?Alexa 555 或 a?syn K10C?Alexa 555, a?syn的氨基酸序列見表1), 待視野中Alexa 555發(fā)出的熒光點數(shù)量合適, 則以50 ms/幀的曝光時間對視野進行錄像, 以記錄a?syn在低濃度下的單體行為.記錄足夠的數(shù)據后, 向腔室中注入50 nM未標記熒光的 a?syn (wt?a?syn), 以提高 a?syn 的總濃度, 并繼續(xù)錄像以記錄脂質體上的標記Alexa 555的a?syn在總濃度較高的情況下的行為.包封臺盼藍的脂質體的實驗完成后, 立即進行包封緩沖液的脂質體的實驗, 實驗步驟與前述相同, 以記錄和測定F0的值.由于LipoFRET實驗中關心的是相對亮度F/F0的值, 因此在同一樣品的同組實驗當中,需要保證包封緩沖液及臺盼藍的脂質體上測試的實驗條件完全一致.

表1 a?syn的氨基酸序列Table 1.Sequences of a?syn.

使用圖1(b)中的亮度?距離曲線將分析獲得的熒光亮度轉換為距離信息.如果使用不同的熒光分子與淬滅劑的組合來進行實驗, 可根據該熒光分子的光譜、量子效率等參數(shù), 參照參考文獻[21]中的計算方法計算相應的亮度?距離曲線以用于熒光亮度與距離數(shù)據的轉換.

2.3 a-syn解離過程的研究

為了研究a?syn解離速率與溶液中蛋白濃度的關系, 首先將脂質體連接在蓋玻片表面上, 接著加入 0.1 nM a?syn T72C?Alexa 555, 待視野中的熒光點密度足夠多(200—500個為宜), 則關閉激光, 并加入一定濃度的wt?a?syn替換原溶液.電荷耦合器件CCD的曝光時間為50 ms/幀, 總時長為5 s.期間打開激光, 以低光強(強度可將視野中的單個分子的熒光點從背景分辨出來即可)照射約1 s即關閉, 此操作降低了光漂白導致的熒光點數(shù)量減少的效應.每隔一定的時間重復錄像?開關激光的步驟, 這樣就記錄了同一視野中熒光點隨時間的變化.最后, 使用ImageJ軟件對圖像進行分析, 統(tǒng)計每個錄像中熒光點的個數(shù), 即得出熒光點個數(shù)隨著時間的變化趨勢.

3 結果與討論

3.1 a-syn中央NAC區(qū)域膜相互作用在高濃度下的變化

為研究較高濃度下a?syn與磷脂膜的相互作用特征, 用LipoFRET方法, 對溶液中存在一定濃度的a?syn時熒光標記的a?syn在磷脂膜上的動態(tài)過程進行探究.

首先關注的是a?syn T72位點.該位點位于蛋白第二螺旋中的NAC區(qū)域.NAC區(qū)域連接了a?syn的N端與C端, 且此區(qū)域在體外有聚集的特性, 因而被認為是介導聚集的關鍵區(qū)域[7].亦即是說, 該區(qū)域是高濃度下參與a?syn多體相互作用的可能區(qū)域.在實驗中, 首先將包封5 mM臺盼藍的脂質體連接在玻片表面上.接著, 將0.1 nM a?syn T72C?Alexa 555加入樣品腔室.待視野中的熒光點密度足夠后, 進行錄像, 以記錄樣品在濃度較低時與磷脂膜相互作用的特征.在記錄足夠數(shù)據之后,再在其中加入50 nM的未標記熒光的a?synuclein(wt?a?syn), 繼續(xù)進行錄像, 以記錄單個 a?syn T72C?Alexa 555在蛋白總濃度較高時的行為特征.實驗結果如圖2所示.

在實驗中, 發(fā)現(xiàn)在蛋白總濃度較低(0.1 nM)時, 亮度曲線仍呈現(xiàn)較為平穩(wěn)的狀態(tài), 其相對亮度的值為 0.65 ± 0.07 (中心值 ± 半峰寬, 下同).膜的厚度約4.5 nm[34], 此結果確認了T72位點位于脂質體磷脂膜的表面附近.而當加入50 nM的wt?a?syn之后, 部分熒光亮度有所增強, 并且亮度曲線出現(xiàn)了明顯的上下起伏(圖2(a)和圖2(d)).對亮度曲線中較明顯狀態(tài)的亮度進行了統(tǒng)計, 以確定亮度狀態(tài)的存在與分布.結果顯示, 在較高濃度的a?syn 存在時, a?syn T72C?Alexa 555 的亮度呈現(xiàn)兩個峰的分布(圖2(b)).亮度較低峰的中心值與低濃度下的a?syn亮度基本一致, 為F/F0= 0.63 ±0.06; 而亮度較高峰的為 F/F0= 0.83 ± 0.09, 對照圖1(b)中的曲線, 其中心值對應于膜外2.1 nm的位置.這顯示a?syn濃度較高時, 一部分蛋白的NAC中央區(qū)域脫離膜表面, 進入了溶液中(圖2(c)),且可在膜表面和溶液中的狀態(tài)之間互相轉換.

接著, 對a?syn K10位點的動態(tài)過程進行研究.K10位點所在的N端第一螺旋是a?syn與膜相互作用較強的區(qū)域.第一螺旋較第二螺旋多出3個凈的正電荷, 并含有更高比例的疏水殘基側鏈.此前的報道中揭示了單個a?syn分子K10位點在膜中有較明顯的動態(tài)過程[21], 在這里探索較高濃度a?syn下, K10位點與膜的相互作用.由于該位點在膜中位置較深, 為避免熒光信號過弱, 采用2.5 mM臺盼藍包封于脂質體中對其進行研究.

圖2 溶液中存在低蛋白濃度或高蛋白濃度時, a?syn T72C?Alexa 555在包封5 mM臺盼藍的脂質體上的動態(tài)特征 (a)蛋白總濃度為0.1 nM (上圖)與50 nM (下圖)時的典型亮度曲線(其中灰色曲線與綠色曲線分別為包封緩沖液脂質體與包封臺盼藍脂質體上的相對亮度曲線(F/F0)); (b)蛋白總濃度為0.1 nM (上圖)與50 nM (下圖)時的亮度統(tǒng)計(誤差線代表統(tǒng)計偏差); (c)低濃度(上部)與高濃度(下部)時, 在磷脂膜上的位置特征示意圖; (d)蛋白總濃度為50 nM時更多的典型亮度曲線Fig.2.Dynamic of a?syn T72C?Alexa 555 on liposome encapsulating 5 mM trypan blue in the presence of low and high protein con?centration in solution：(a) Typical intensity traces of a?syn T72C?Alexa 555 under 0.1 nM (upper panel) or 50 nM wt?a?syn (lower panel) in solution (the grey and green line correspond to the intensity traces on liposomes entrapping buffer (F0) and on liposomes entrapping trypan blue (F), respectively); (b) the intensity histograms of the states under 0.1 nM (upper panel) or 50 nM wt?a?syn(lower panel) in solution (the error bars on the histograms represent the statistical error in the bins); (c) the scheme of the position change of a?syn T72 on the membrane with increased protein concentration in the solution; (d) more intensity traces of a?syn T72C?Alexa 555 in the presence of 50 nM wt?a?syn in solution.

圖3的實驗結果顯示, 在蛋白總濃度較高時,a?syn N端在膜中的動態(tài)過程也會有所變化.在腔室中的蛋白濃度為0.1 nM時, 觀察到3個主要的狀態(tài), 其亮度為 F/F0= 0.47 ± 0.08, 0.68 ± 0.06,以及0.83 ± 0.05, 分別對應膜以內3.6 nm, 1.4 nm,以及膜表面附近的位置(圖3(a)和圖3(b)).而當在溶液中增加了50 nM的wt?a?syn之后, N端的動態(tài)過程發(fā)生了變化.從典型的亮度曲線(圖3(d))來看, K10位點有更大概率跳變到更高亮度的位置.而從亮度統(tǒng)計來看, 較高濃度的a?syn存在時, 仍然有3個峰的位置, 前兩個峰與低濃度的情況相比, 中心位置向更亮處移動, 分別為F/F0= 0.54 ± 0.07,0.71 ± 0.06.這兩個峰對應膜以內2.9, 1.1 nm的位置.亮度最高的峰為F/F0= 0.86 ± 0.06, 其中心對應膜以外0.9 nm的位置.相比于低濃度下的情況, 除了位置更高之外, 最高亮度的峰所占比例明顯升高, 而亮度較低的峰所占比例明顯降低.這提示增加了a?syn的溶液中濃度之后, K10位點所在的第一螺旋更傾向于處在溶液中略高于膜表面的位置(圖3(c)).從實驗結果來看, 溶液中更高濃度的a?syn的加入, 一方面促使T72位點脫離膜表面進入溶液中, 另一方面使K10位點傾向于從膜內切換至更淺甚至較膜表面更高的位置, 結果表明, a?syn溶液中濃度的升高很有可能帶來單個蛋白與膜相互作用的減弱.

為了探究高濃度下a?syn的存在所導致的微觀層面蛋白與膜相互作用的變化是否會對a?syn在膜上的解離性質有所影響, 用不含臺盼藍的脂質體做了a?syn在DOPC/DOPA膜上的解離測試, 實驗結果如圖4所示.從圖4可以看出, 加入wt?a?syn后, 隨著時間的推移, 原本結合于脂質體上的 a?syn T72C?Alexa 555 逐漸減少.并且, 溶液中a?syn的濃度越高, 熒光點減少的速度越快.此過程表明熒光標記的a?syn從脂質體上逐漸解離.這種現(xiàn)象與一般的結合?解離過程不同.一般而言, 生物大分子從作用位點上解離由一個解離常數(shù)決定, 這個解離常數(shù)通常是一個恒定的值, 不隨溶液中生物大分子濃度的變化而變化.而a?syn的解離則明顯地受濃度調控, 該現(xiàn)象在以往關于a?syn的文獻中并未報道過.溶液中的a?syn使得已經結合在膜上的蛋白更容易從膜上脫落, 因此,LipoFRET得到的高濃度狀態(tài)下a?syn在膜上垂直位置的變化, 確實導致a?syn與磷脂膜相互作用的減弱, 促進了a?syn的解離.

圖3 包封2.5 mM臺盼藍的脂質體上的a?syn K10C?Alexa 555在溶液中存在低濃度與高濃度wt?50 nM wt?a?syn時的動態(tài)特征(a)蛋白總濃度為0.1 nM (上圖)與50 nM (下圖)時的典型亮度曲線(其中灰色曲線與深藍色曲線分別為包封緩沖液脂質體與包封臺盼藍脂質體上的相對亮度曲線(F/F0)); (b)蛋白總濃度為0.1 nM (上圖)與50 nM (下圖)時的亮度統(tǒng)計(誤差線代表統(tǒng)計偏差); (c)蛋白低濃度(上部)與高濃度(下部)時, 在磷脂膜上的位置特征示意圖; (d)蛋白總濃度為50 nM時更多的典型亮度曲線Fig.3.Dynamic of a?syn K10C?Alexa 555 on liposome encapsulating 2.5 mM trypan blue in the presence of low and high protein concentration in solution：(a) Typical intensity traces of a?syn K10 C?Alexa 555 under 0.1 nM (upper panel) or 50 nM wt?a?syn(lower panel) in solution (the grey and dark blue line correspond to the intensity traces on liposomes entrapping buffer (F0) and on liposomes entrapping trypan blue (F), respectively); (b) the intensity histograms of the states under 0.1 nM (upper panel) or 50 nM wt?a?syn (lower panel) in solution (the error bars on the histograms represent the statistical error in the bins); (c) the scheme of the position change of a?syn K10 on the membrane with increased protein concentration in the solution; (d) more intensity traces in the presence of 50 nM wt?a?syn in solution.

根據在實驗中從微觀與宏觀層面得到的結果,溶液中存在高濃度的a?syn時, 應當存在一個包含多個蛋白與磷脂膜形成復合物的過程(圖5).對于低濃度下的單個a?syn來說, K10位點有較大概率深入磷脂膜的較深處, 而T72位點基本穩(wěn)定在磷脂膜的表面上.當溶液中的a?syn濃度較高時, 兩個a?syn有一定的概率充分靠近, 從而發(fā)生一個a?syn K10位點所在的第一螺旋占據另外一個a?syn的T72位點所在的第二螺旋與膜作用區(qū)域的情況.此時, 作用位點被占據的a?syn第二螺旋與膜的作用減弱, 有一定概率離開磷脂膜的表面.此變化導致同一蛋白的第一螺旋切換至膜的淺表位置.此時, a?syn與磷脂膜的相互作用很不穩(wěn)定, 當?shù)谝宦菪c第二螺旋同時處于膜外時, 最終使得其與膜的作用位點容易從膜上脫落下來, 從而導致了宏觀上溶液中蛋白濃度升高反而促進蛋白從膜上解離的現(xiàn)象.需要注意的是, 蛋白之間互相占據膜作用位點的情況是有可能發(fā)生的, 因為a?syn的第一螺旋帶有3個正的凈電荷, 而C端帶有12個凈的負電荷.其靜電作用可能傾向于使a?syn的第一螺旋從另外一個a?syn的第二螺旋方向靠近并促使替代過程發(fā)生.該過程與Kamar等[35]揭示的轉錄因子從DNA上解離的動力學過程具有類似的機理, 因為從微觀上看, a?syn與磷脂膜之間同樣涉及兩個a?螺旋導致的多位點相互作用.

圖4 溶 液 中 含 有 1 nM, 10 nM, 100 nM 的 wt?a?syn 時,視野中脂質體上的a?syn T72C?Alexa 555數(shù)量相對于原始數(shù)量的比值隨時間變化趨勢(誤差線代表統(tǒng)計偏差)Fig.4.Fraction of the remaining fluorescence spots of a?syn T72C?Alexa 555 on the liposomes versus time.The solution contains 1 nM, 10 nM, or 100 nM wt?a?syn.The error bars on the histograms represent the statistical error in the bins.

圖5 溶液中高濃度的a?syn促進標記Alexa 555的a?syn從膜上解離的過程模型Fig.5.Model corresponding to the dissociation of a?syn from the membrane which was promoted by increased pro?tein concentration.

綜上所述, 實驗揭示了a?syn在高濃度下的行為.溶液中高濃度的a?syn使T72位點從膜上解離至溶液中, 而K10位點從膜內轉移至膜表面甚至溶液中, 從而在宏觀上促進了a?syn從磷脂膜上的解離.這與一些研究中的a?syn寡聚體在膜上聚集的結果并不一致, 因為如果a?syn更易于從膜上解離, 其導致的結果是在膜上的聚集體更難以形成.但是, 按照LipoFRET實驗的時間尺度(僅關注了單分子水平上a?syn在與膜相互作用后短時間內的動態(tài)變化), 可以認為a?syn在磷脂膜存在下的聚集是一個包含解離與成核競爭的復雜動態(tài)過程, 這也解釋了一些研究中a?syn聚集體的生成至少需要數(shù)小時的時間尺度的原因[22].高濃度的a?syn促進其自身從磷脂膜上解離的性質, 很可能是a?syn在體內調控其聚集過程的重要方式, 因為高濃度下a?syn從膜上解離的速率更快則限制了聚集體大小的增長速率.帕金森病的致病機理有可能和a?syn的解離與聚集性質的失調有關.另外,此前文獻[36]報道了a?syn與膜作用的不同位點分別連接兩個脂質體、介導脂質體之間聚集的模型假設.此研究中a?syn的狀態(tài)與本文中LipoFRET得出的高濃度下a?syn在膜上的狀態(tài)較為吻合.該現(xiàn)象的發(fā)生與一定濃度下a?syn發(fā)生部分位點從脂質體膜上解離從而與另一個脂質體發(fā)生相互作用有關, 即使該相互作用可能是瞬態(tài)的.從另一方面來看, 蛋白濃度是調節(jié)a?syn與膜的相互作用的重要參數(shù).在低濃度時, 存在的是較長時間的持續(xù)相互作用; 而高濃度時, 則主要為瞬態(tài)的相互作用.在解讀和比較研究a?syn與膜相互作用的不同研究結果時, 蛋白濃度應作為重要影響因素被納入考慮.

4 結 論

本文使用LipoFRET方法研究了在溶液中存在較高濃度的a?syn的情況下, 磷脂膜上的單個a?syn與膜作用的細節(jié)變化.LipoFRET方法可以在單分子水平上實時動態(tài)地監(jiān)測膜蛋白單個位點處標記的熒光基團在垂直于膜方向上的距離變化,從而為研究膜蛋白的動力學過程提供重要的實時定量信息.

在實驗中發(fā)現(xiàn), 當溶液中a?syn的濃度提高時, 磷脂膜上的a?syn T72位點所在的NAC附近區(qū)域可從磷脂膜上解離至溶液中.而K10位點附近區(qū)域處在膜中的概率減小, 深度變淺, 并有很大概率脫離膜表面進入溶液中.這提示在此情況下a?syn與磷脂膜的相互作用可能會減弱.進一步地,采用單分子熒光成像的方法對a?syn與脂質體的解離過程進行了研究.結果表明, a?syn從脂質體上的解離速率確實隨著溶液中蛋白濃度的提高而加快, 這與LipoFRET的單分子實驗的結果是自洽的.針對這樣的現(xiàn)象, 本文提出了a?syn蛋白濃度升高導致膜上的a?syn與膜的作用位點互相競爭, 進而導致a?syn的膜作用位點從膜上解離, 并最終導致a?syn與磷脂膜的相互作用減弱從而從膜上解離的模型.a?syn濃度調控解離的性質是調節(jié)其在膜上寡聚過程的重要一環(huán), 該寡聚過程很可能涉及聚集與解離的競爭.

此外, 本文的結果也證明了LipoFRET方法在探測膜蛋白動力學過程中的適用性.期待將來在膜蛋白功能與結構的研究中, LipoFRET能得到更廣泛的應用.