蛋白質(zhì)組學(xué)在系統(tǒng)性血管炎中的研究進(jìn)展

蔡昕添 吳 婷 李南方

系統(tǒng)性血管炎是一組原因不明的、以血管壁和(或)管壁周圍組織炎癥和壞死為基本病理改變的結(jié)締組織疾病，根據(jù)受累血管類型、位置、病理特征等情況的不同，可導(dǎo)致相應(yīng)的組織和器官出現(xiàn)缺血的表現(xiàn)，臨床上常表現(xiàn)為皮膚破壞、多部位關(guān)節(jié)炎甚至多臟器衰竭。目前，系統(tǒng)性血管炎的診斷主要依靠患者的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、病理活檢、動(dòng)脈造影以及結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢查檢測(cè)到的一種或多種自身抗體來(lái)確定[1]。然而，目前臨床常用的診斷方法其效率與準(zhǔn)確率均不高且存在一定的局限性。生物學(xué)標(biāo)志物雖早已應(yīng)用于臨床之中，且為非侵入性檢查，對(duì)患者傷害小，可反復(fù)進(jìn)行。但目前僅少數(shù)生物學(xué)標(biāo)志物可用于系統(tǒng)性血管炎的診斷，如抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)對(duì)于ANCA相關(guān)性血管炎(ANCA-associated vasculitis，AAV)的診斷具有重要臨床價(jià)值，但對(duì)于病情評(píng)估尚存爭(zhēng)議；如紅細(xì)胞沉降率和C反應(yīng)蛋白等炎性生物學(xué)標(biāo)志物，但其特異性較差，無(wú)法區(qū)分血管炎與感染[2]。這些標(biāo)志物或許有助于系統(tǒng)性血管炎的診斷，但對(duì)疾病活動(dòng)與復(fù)發(fā)的評(píng)估價(jià)值并不大。因此，尋找新型診斷及評(píng)估病情變化的特異性生物學(xué)標(biāo)志物，以期更早制定出新型的治療方案，提高系統(tǒng)性血管炎患者生存率和生活質(zhì)量，是臨床亟待解決的重大問(wèn)題。

蛋白質(zhì)組學(xué)作為一門新興的科學(xué)和技術(shù)，已受到眾多學(xué)科的廣泛關(guān)注，成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于腫瘤、心血管疾病及自身免疫性疾病的研究之中，對(duì)深入探究疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制、早期篩查與診斷、個(gè)性化治療、預(yù)后評(píng)估都有著極其重大的意義[3]。它的發(fā)展完善為系統(tǒng)性血管炎的研究帶來(lái)了全新的思維模式，開(kāi)拓出全新的研究領(lǐng)域，對(duì)探討系統(tǒng)性血管炎發(fā)病機(jī)制、早期診斷和治療及改善預(yù)后具有重大意義[4]。本文通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)及其在系統(tǒng)性血管炎，尤其是在巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、川崎病、ANCA相關(guān)性血管炎、白塞病、過(guò)敏性紫癜中的研究進(jìn)展做一綜述。

一、蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)是應(yīng)用多技術(shù)對(duì)特定生物液體、細(xì)胞或組織內(nèi)所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，并分析其表達(dá)水平及修飾狀態(tài)，研究其結(jié)構(gòu)、功能以及相互作用。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的研究，不僅能了解疾病發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，還能為疾病機(jī)制的闡述及疾病的攻克提供可靠的理論依據(jù)和有效的解決途徑。

二、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在系統(tǒng)性血管炎中的應(yīng)用

1.巨細(xì)胞動(dòng)脈炎：巨細(xì)胞動(dòng)脈炎(giant cell arteritis，GCA)是一種肉芽腫性大血管炎，常影響主動(dòng)脈及其主要分支，尤其是顳動(dòng)脈。其臨床表現(xiàn)可因受累部位不同而表現(xiàn)復(fù)雜，甚至出現(xiàn)失明等嚴(yán)重并發(fā)癥。因此，早診和早治是預(yù)防這種疾病發(fā)生不可逆損害的關(guān)鍵[5]。Alexis等[6]采用2-DE聯(lián)合MS技術(shù)將GCA患者顳動(dòng)脈活檢分離得到的血管平滑肌細(xì)胞(vessel smooth muscle cells，VSMCs)與來(lái)自健康對(duì)照組的VSMCs進(jìn)行差異蛋白質(zhì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)26種差異蛋白，其中內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)被認(rèn)為是GCA中VSMCs增殖的關(guān)鍵激活物，這也再次證實(shí)此前Planas-Rigol等[7]所得出的結(jié)論：ET-1在GCA血管病變中顯著上調(diào)，并通過(guò)促進(jìn)VSMCs向內(nèi)膜層遷移，進(jìn)一步加重GCA中血管內(nèi)膜增生和血管閉塞情況。以上研究表明ET-1等蛋白質(zhì)對(duì)于GCA的診斷及病情預(yù)后判斷可能具有較大的提示價(jià)值。ET-1是內(nèi)皮素家族的成員之一，內(nèi)皮素家族成員(主要包括ET-1、ET-2和ET-3)都是由21個(gè)氨基酸組成的活性多肽，是目前已知最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)之一，參與多種疾病的病理生理過(guò)程。而ET-1是唯一存在于內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮素，除有收縮血管作用外，還可介導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷及刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖。近年來(lái)多項(xiàng)研究表明其參與了多種系統(tǒng)性血管炎的發(fā)病機(jī)制[8]。然而，其特異性與敏感度仍有待于進(jìn)一步開(kāi)展大樣本隊(duì)列研究予以證實(shí)。

2.川崎?。捍ㄆ椴?kawasaki disease，KD)是一種嬰幼兒時(shí)期常見(jiàn)的急性系統(tǒng)性血管炎。它主要累及中、小血管，并可導(dǎo)致一系列心血管系統(tǒng)的嚴(yán)重并發(fā)癥[9]。為尋找診斷KD的新型生物學(xué)標(biāo)志物，Alex等[10]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了KD患者與高度懷疑KD但最終證實(shí)為其他發(fā)熱性疾病患者的血清和尿液，發(fā)現(xiàn)兩種免疫調(diào)節(jié)相關(guān)分子僅在KD患者尿液中高表達(dá)，包括金屬蛋白酶Meprin A和細(xì)絲蛋白C。更有意義的是，研究者利用前瞻性盲法研究驗(yàn)證了這兩個(gè)指標(biāo)，最終在不同隊(duì)列中再次證實(shí)KD患者血清與尿液中Meprin A和細(xì)絲蛋白C水平顯著高于對(duì)照組。并且與目前常用的實(shí)驗(yàn)室檢查比較，這兩種標(biāo)志物對(duì)于癥狀不典型KD均表現(xiàn)出更為優(yōu)異的診斷效能。此外，Yayoi等[11]采用LC-MS/MS技術(shù)比較了急性期與恢復(fù)期KD患者的血清蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示急性期患者血清中LBP、LRG1和AGT的表達(dá)水平顯著高于恢復(fù)期患者，而急性期患者血清中RBP4的表達(dá)水平則明顯低于恢復(fù)期患者。這提示以上蛋白可作為預(yù)測(cè)KD活動(dòng)性的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。目前，臨床上KD治療最常用、最有效的方案仍為口服阿司匹林和大劑量靜脈注射丙種球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)聯(lián)合[12]。然而IVIG存在眾多不良反應(yīng)，甚至是致命性的不良反應(yīng)，如急性腎衰竭和血栓栓塞，所以評(píng)估該方案是否利大于弊是極為必要的[13]。Zhang等[14]采用2-DE和MALDI-TOF/TOF-MS對(duì)IVIG治療前后的患者血清進(jìn)行蛋白質(zhì)差異表達(dá)分析，共鑒定出29種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中最有價(jià)值的蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin，TTR)。KD患者的TTR水平顯著高于健康對(duì)照組，且IVIG治療起效后，TTR可恢復(fù)到正常水平，但在IVIG治療無(wú)效的患者中TTR并沒(méi)有這種變化，這或許可作為評(píng)估KD患者IVIG療效有無(wú)的潛在指標(biāo)。

3.ANCA相關(guān)性血管炎:AAV是一系列以壞死性炎性反應(yīng)為特征的小血管炎。ANCA是目前診斷AAV最常檢測(cè)的血清標(biāo)志物，但并非所有AAV患者都能檢測(cè)到ANCA，且ANCA的血清水平并不總能準(zhǔn)確反映AAV的活動(dòng)度[15]。因此，需要尋找更多的生物學(xué)標(biāo)志物用于AAV的診斷及其活動(dòng)度的評(píng)估。此外，因AAV常同時(shí)累及多臟器，所以發(fā)掘能反映特異性器官損傷的生物學(xué)標(biāo)志物也尤為重要。Régent等[16]采用13C/15N標(biāo)記結(jié)合LC-MS/MS的方法對(duì)健康者和AAV患者治療前(活動(dòng)期)與治療后(緩解期)的血清進(jìn)行蛋白質(zhì)差異表達(dá)分析，共鑒定出多種差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的表達(dá)蛋白質(zhì)。并在另一更大樣本量的AAV患者隊(duì)列中對(duì)以上蛋白質(zhì)進(jìn)行了敏感度與特異性的分析鑒定，最終選定組織金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)為監(jiān)測(cè)AAV活動(dòng)的最佳生物學(xué)標(biāo)志物，這一結(jié)論也證實(shí)了Bjerkeli等[17]的研究結(jié)果，活動(dòng)期GPA的TIMP-1水平顯著高于非活動(dòng)期與健康對(duì)照組。

Rani等[18]采用2-DE和MALDI-TOF-MS分析了GPA活動(dòng)期患者、緩解期患者以及健康對(duì)照3組間血清中的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。研究結(jié)果顯示與緩解期及健康對(duì)照組比較，活動(dòng)期患者血清中發(fā)現(xiàn)了多種差異表達(dá)蛋白質(zhì)。其中觸珠蛋白可能是反映GPA疾病活動(dòng)最重要的標(biāo)志物。維生素D結(jié)合蛋白、CD91和IL-17可用于活動(dòng)期與腎損傷的監(jiān)測(cè)。以上幾種蛋白質(zhì)均可用于診斷和預(yù)后判斷，但其實(shí)際的臨床價(jià)值仍有待于進(jìn)一步評(píng)估。

4.白塞?。喊兹?Behcet′s disease，BD)是一種變異性血管炎，可累及全身各處血管，當(dāng)累及中樞系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等重要臟器時(shí)常致死致殘。為應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，Hu等[19]利用血清標(biāo)本，采用了Hu-Prot技術(shù)分別分析了BD、大動(dòng)脈炎、ANCA相關(guān)性血管炎、干燥綜合征和健康受試者中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并通過(guò)更大樣本量的隊(duì)列進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)抗-CTDP1抗體在BD患者中的表達(dá)明顯高于疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組。此外，Cheng等[20]通過(guò)LC-MS/MS分析了BD患者血清同其他風(fēng)濕免疫性疾病、健康對(duì)照之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，從BD外周血循環(huán)免疫復(fù)合物中鑒定出多種自身抗原。并針對(duì)自身抗原微管蛋白-α-1c的自身抗體進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)它在BD中表達(dá)顯著增高，這或許是一種全新的BD診斷標(biāo)志物。研究者還發(fā)現(xiàn)抗微管蛋白-α-1c自身抗體與深靜脈血栓形成等并發(fā)癥密切相關(guān)，而且其血清水平與BD活動(dòng)度呈正相關(guān)。但研究者尚不清楚是抗微管蛋白-α-1c抗體導(dǎo)致了內(nèi)皮細(xì)胞損傷及局部血管炎性反應(yīng)，還是血管炎性反應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生了抗微管蛋白-α-1c抗體。所以有必要進(jìn)一步研究微管蛋白-α-1c及其自身抗體在BD中的發(fā)病機(jī)制。

5.過(guò)敏性紫癜：過(guò)敏性紫癜(henoch-schonlein purpura，HSP)是一種由IgA介導(dǎo)的小血管炎，又名IgA血管炎(IgA-vasculitis，IgAV)，通常涉及皮膚、關(guān)節(jié)、胃腸道以及腎臟，其中腎臟受累者(IgA vasculitis with nephritis，IgAVN)預(yù)后往往極差。目前為止，尚無(wú)明確的實(shí)驗(yàn)室檢查能用于確診HSP[21～23]。孫秀坤等[21]通過(guò)CM10芯片結(jié)合SELDI-TOF-MS技術(shù)，分析了HSP伴發(fā)腎炎患者與HSP不伴腎炎患者尿液中的差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜，并利用SVM算法建立由多個(gè)標(biāo)記蛋白構(gòu)成的IgAVN的早期診斷模型，這些標(biāo)記蛋白能在尿檢發(fā)現(xiàn)隱血、尿蛋白之前即可測(cè)得，這為IgAVN的早期診斷提供了可能。當(dāng)然該模型的穩(wěn)定性與可重復(fù)性仍有待于不同隊(duì)列的進(jìn)一步驗(yàn)證。

He等[22]納米級(jí)超高效液相色譜-質(zhì)譜(nano LC-MS/MS)研究了IgAV、IgAVN和健康受試者之間在血清中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并通過(guò)ELISA進(jìn)一步驗(yàn)證了其中豐度差異較大的蛋白質(zhì)，如血管緊張素原和激肽原-1等。最終，研究者發(fā)現(xiàn)血清中血管緊張素原濃度與IgAVN發(fā)病密切相關(guān)，且其可作為判斷IgAV預(yù)后的潛在標(biāo)志物。Mao等[23]研究也發(fā)現(xiàn)尿血管緊張素原濃度可用作判斷IgAV腎臟受累嚴(yán)重程度的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，并認(rèn)為尿血管緊張素原水平的升高很可能直接參與了IgAV急性期腎損害的疾病進(jìn)展。研究者還推測(cè)阻斷尿血管緊張素原的生成可能是治療重癥IgAV腎臟受累的一種有效方法。

三、展 望

由于系統(tǒng)性血管炎治療難度大且預(yù)后較差，因此盡早診斷是改善系統(tǒng)性血管炎患者預(yù)后的關(guān)鍵。鑒于目前系統(tǒng)性血管炎早期檢測(cè)手段的局限性，研究者一直在找尋其敏感度及特異性更高的早期診斷標(biāo)志物。近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)的飛速發(fā)展為系統(tǒng)性血管炎的研究提供了全新思路。為揭示系統(tǒng)性血管炎發(fā)病機(jī)制及尋找早期診斷、療效評(píng)價(jià)和預(yù)后評(píng)估的可靠生物學(xué)標(biāo)志物提供了極大的便利。但蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在系統(tǒng)性血管炎的研究中仍存在無(wú)法回避的缺陷，如目前已發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)標(biāo)志物仍面臨難以大規(guī)模應(yīng)用于臨床實(shí)踐、檢驗(yàn)檢測(cè)流程仍未制定出標(biāo)準(zhǔn)化的規(guī)范和后期質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)存在較大差異等困境。即便如此，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)理論研究的持續(xù)深入、系統(tǒng)性血管炎中蛋白組學(xué)研究數(shù)據(jù)的不斷積累以及實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作流程的逐步改進(jìn)，這必將帶動(dòng)系統(tǒng)性血管炎相關(guān)研究更進(jìn)一步地發(fā)展。