腫瘤免疫治療的預(yù)測和預(yù)后標志物*

付烊，章必成

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬襄陽醫(yī)院腫瘤科，襄陽 441001；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤中心，武漢 430060)

惡性腫瘤的治療已經(jīng)全面進入精準醫(yī)學(xué)時代。通過尋找生物標志物以判斷腫瘤的生物學(xué)行為和選擇合適的治療手段，是精準醫(yī)學(xué)的一個重要特點。生物標志物通常被定義為一種可以客觀監(jiān)測和評估正常生理進程、病理進程或?qū)δ撤N治療干預(yù)藥物應(yīng)答情況的指標或標志。近年來，各種生物標志物已經(jīng)開始用于腫瘤免疫治療的預(yù)后判斷和療效預(yù)測，并收到良好效果。

1 腫瘤預(yù)測和預(yù)后標志物的概念

腫瘤的預(yù)測標志物通常用于預(yù)測特定人群對某種特定手段的療效，可以成為治療的靶點。例如，對晚期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者進行基因檢測，如果發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)或Braf等驅(qū)動基因敏感突變陽性，則可分別給予相應(yīng)的靶向藥物進行治療[1]。腫瘤的預(yù)后標志物則可用于判斷患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險和生存時間，與患者接受何種治療方法無關(guān)。例如，對乳腺癌患者進行21或58基因分析，以判斷患者的整體預(yù)后。

定義腫瘤的預(yù)測和預(yù)后生物標志物，通常需要通過臨床試驗進行嚴格挑選[2]。迄今為止，臨床常用的腫瘤預(yù)測生物標志物包括：乳腺癌(HER-2、ER/PR)，結(jié)直腸癌(K-ras)，胃腸道間質(zhì)瘤(c-Kit)，胃癌(HER-2)，NSCLC(EGFR、ALK和Braf等)，以及黑色素瘤(Braf)等；美國食品藥品管理局(FDA)批準的腫瘤預(yù)后生物標志物包括：乳腺癌(58基因RNA表達譜、70基因表達譜、HER-2和TOP2A)，前列腺癌(tPSA)等。

隨著惡性腫瘤的治療全面進入免疫治療時代，免疫治療的生物標志物逐步成為當(dāng)前研究的熱點。目前，腫瘤免疫治療的生物標志物包括四大類：①來自腫瘤新抗原，如腫瘤突變負荷(tumor mutation burden，TMB)、微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性(microsatellite instability-high，MSI-H)/錯配修復(fù)缺陷缺失(mismatch repair deficient，dMMR)和新抗原負荷等；②來自腫瘤炎性微環(huán)境，如程序性細胞死亡蛋白配體1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)、腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphoeytes，TILs)和部分炎癥標志物等；③與腫瘤免疫抑制/逃逸有關(guān)的細胞或分子，如調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory cells，Tregs)、骨髓來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)、吲哚胺2，3-二氧化酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)、T 細胞免疫球蛋白及黏蛋白分子-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3，TIM-3)和淋巴細胞活化基因-3(lymphocyte-activation gene 3，LAG-3)等；④來自宿主環(huán)境的標志，如腸道菌群、胚系基因特征等[3]。在這些標志物中，大部分可用于鑒別有效、無效甚至有害人群，即為預(yù)測標志物；少數(shù)兼有預(yù)測療效和判斷預(yù)后的作用，即同時為預(yù)測和預(yù)后標志物。

2 免疫治療正性療效預(yù)測的生物標志物

2.1PD-L1 在腫瘤及其微環(huán)境中，PD-L1分為組成型表達和誘導(dǎo)型表達。目前認為，組成型表達是PD-L1基因在腫瘤組織中的固有表達，與免疫治療療效預(yù)測關(guān)系不大；而誘導(dǎo)型表達是指PD-L1在干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等分子的作用下出現(xiàn)的適應(yīng)性聚焦表達，可導(dǎo)致腫瘤局部出現(xiàn)抑制性炎癥微環(huán)境，這也恰恰為腫瘤免疫治療提供了靶點[4]。

已經(jīng)證實，PD-L1表達有如下特征：①呈連續(xù)性表達模式，即腫瘤中可能有0%～100%的細胞表達PD-L1；②表達可能隨著治療(免疫、化療、放療或抗血管生成治療等)發(fā)生改變；③不同瘤種、不同組織學(xué)類型的腫瘤以及同一腫瘤內(nèi)部不同區(qū)域的PD-L1表達不同。目前已有多項臨床試驗和薈萃分析認為PD-L1可以作為預(yù)測晚期NSCLC免疫治療療效(包括單藥免疫治療及免疫聯(lián)合化療等)的生物標志物[5]。由于證據(jù)確鑿，自2019年起，PD-L1檢測得到了NCCN和CSCO晚期NSCLC診療指南的一致推薦。然而迄今為止，上述指南并沒有明確對腫瘤組織采用免疫組化法檢測PD-L1表達時采用何種方法和平臺。

雖然PD-L1是目前臨床上已被廣泛接受的免疫治療正性療效預(yù)測的生物標志物，然而，它是不完美的療效預(yù)測生物標志物[6]。首先，并非所有的PD-1或PD-L1抑制劑在使用前都需要檢測PD-L1。2019年8月，國家藥品監(jiān)督管理局(National Medical Products Administration，NMPA)批準DAKO公司生產(chǎn)的PD-L1檢測試劑盒(克隆號：22C3)在中國上市，用于輔助鑒別可使用帕博利珠單抗(pembrolizumab)治療的NSCLC患者。2019年12月，NMPA批準DAKO公司的另一款PD-L1檢測試劑盒(克隆號：28-8)上市，用于輔助鑒別使用納武利尤單抗(nivolumab)治療的非鱗狀NSCLC患者。但是，22C3抗體適用于伴隨診斷，而28-8抗體僅適用于補充診斷。第二，并非所有PD-L1陽性患者都對免疫治療有效。以晚期NSCLC為例，PD-L1陽性患者采用pembrolizumab進行一線或二線單藥治療的客觀緩解率(objective response rate，ORR)<50%，PD-L1 陰性患者也有10%～20%的ORR。第三，PD-L1表達的檢測平臺不一致。Blueprint II研究對多種檢測平臺的一致性進行了對比，發(fā)現(xiàn)22C3、28-8和SP263抗體的一致性高，而SP142和73-10抗體的一致性較差。雖然這5種檢測試劑盒/抗體均在美國獲批上市，但唯有DAKO 22C3 被FDA批準作為伴隨診斷的PD-L1檢測試劑(其他為補充診斷)。第四，PD-L1的表達具有時空異質(zhì)性。有研究比較了晚期NSCLC不同時間點、不同轉(zhuǎn)移器官組織中PD-L1的表達情況，發(fā)現(xiàn)不僅表達水平相差巨大，而且直接影響了患者接受免疫治療的無進展生存期(progression-free survival，PFS)。第五，PD-L1表達的檢測細胞有待進一步明確。大部分抗體只要求檢測腫瘤細胞，但是PD-L1抑制劑阿特珠單抗(atezolizumab)卻要求同時檢測免疫細胞和腫瘤細胞。

2.2TMB TMB是指腫瘤基因組去除胚系突變后的非同義突變的體細胞突變數(shù)量。新抗原是腫瘤特異性突變產(chǎn)生的多肽表位(抗原決定基)，具有結(jié)合主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)分子并被呈遞的功能。免疫原性是指由體細胞突變產(chǎn)生“非己”成分(轉(zhuǎn)化為多肽表位)能夠被T細胞識別引起腫瘤清除的免疫反應(yīng)特性。目前認為，腫瘤TMB越高，新抗原產(chǎn)生就越多，腫瘤免疫原性就越高，因此，T細胞抗腫瘤反應(yīng)越強[7]。

大量研究以及Meta分析已經(jīng)表明，TMB與PD-1/PD-L1抑制劑在多個瘤種中的療效相關(guān)[8-10]。CheckMate 026研究的探索性分析顯示，TMB與單藥nivolumab一線治療晚期NSCLC的PFS呈正相關(guān)。CheckMate 227研究第一部分的結(jié)果顯示：TMB≥10 mut/Mb的NSCLC患者，無論PD-L1表達如何，nivolumab+伊匹單抗(ipilimumab)的PFS均優(yōu)于化療。BF1RST研究的中期結(jié)果顯示，高液態(tài)TMB(b-TMB)亞組(≥16 mut/Mb)，atezolizumab療效有優(yōu)于化療的趨勢。Mystic研究的探索性終點顯示，高b-TMB亞組(≥2016 mut/Mb)，德瓦魯單抗(durvalumab)和durvalumab+替西木單抗(tremelimumab)療效均有優(yōu)于化療的趨勢?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，NCCN指南認為TMB是新興的療效預(yù)測生物標志物，TMB檢測也已經(jīng)寫入CSCO指南。

然而，TMB也是不完美的療效預(yù)測生物標志物。第一，TMB并非總是與免疫檢查點抑制劑治療的應(yīng)答相關(guān)，其原因是腫瘤以逐步進化的方式發(fā)展，從而創(chuàng)造了克隆層級；克隆性突變(或同質(zhì)性腫瘤)產(chǎn)生的新抗原可能比來自亞克隆突變(或異質(zhì)性腫瘤)的新抗原更能有效引起腫瘤免疫應(yīng)答[11]。第二，b-TMB并不能取代組織TMB，兩者是互相補充的關(guān)系。如果等位基因突變?yōu)榈拓S度的有意義的突變，b-TMB可能檢測不到，這樣可能出現(xiàn)b-TMB少于組織TMB的情況；另一方面，由于腫瘤組織空間的異質(zhì)性以及克隆分支等原因，b-TMB檢測出的亞克隆計數(shù)會多于組織TMB，但卻不一定有意義[4]。第三，TMB與PD-L1表達通常呈不/弱相關(guān)。已有多項研究證實，高TMB和PD-L1高表達人群只有非常少的交叉。第四，關(guān)于TMB的檢測技術(shù)、平臺、截斷值等均不得而知[12]。二代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)檢測TMB分析非常費時，價格昂貴，技術(shù)要求高，提供的數(shù)據(jù)復(fù)雜；TMB閾值尚無明確定義。第五，TMB與免疫聯(lián)合化療的療效關(guān)系不明。來自KEYNOTE-021、189和407研究的結(jié)果顯示，無論組織學(xué)類型，還是通過全外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)評估的TMB與pembrolizumab+含鉑化療或單用含鉑化療的療效之間均無顯著相關(guān)性。

2.3MSI-H/dMMR MMR系統(tǒng)是生物進化的“保衛(wèi)者”，具有修復(fù)DNA堿基錯配的功能，可以維持基因組的穩(wěn)定性和降低自發(fā)性突變。人類的MMR系統(tǒng)含有9個錯配修復(fù)基因MSH2、MSH3、MSH4、MSH5、MSH6、MLH1、MLH3、PMS1及PMS2等，其中以MLH1和MSH2功能最為重要，負責(zé)最主要的修復(fù)任務(wù)。MSI-H常由dMMR引起[13]。多項臨床研究表明，MSI-H/dMMR實體瘤可從免疫治療中顯著獲益[12]?；?個臨床試驗共149例患者ORR為 39.6%的結(jié)果，2018年5月23日，F(xiàn)DA宣布加速批準pembrolizumab用于對具有特定遺傳(生物標志物)特征的癌癥患者的治療。這是FDA首次不依照腫瘤的組織來源，而是基于生物標志物批準的抗腫瘤療法[14]。

MSI是遺傳不穩(wěn)定性的標志物，因此，伴有不穩(wěn)定基因組的腫瘤可同時表現(xiàn)為MSI-H和高TMB[15]。大多數(shù)(83%)MSI-H的樣本同時表現(xiàn)為高TMB，然而，僅16%高TMB樣本表現(xiàn)為MSI-H。這兩種表型同時出現(xiàn)與腫瘤類型高度相關(guān)，如高TMB和MSI-H同時出現(xiàn)在胃腸道腫瘤中，但是在伴高TMB的黑色素瘤、肺癌和鱗狀細胞癌中，MSI-H并不常見。因此，MSI-H與TMB是部分重疊的療效預(yù)測生物標志物。

2.4其他新興的療效預(yù)測標志物 除上述3個已被臨床公認的正性療效預(yù)測生物標志物之外，人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-I分子的多樣性及特定T細胞亞群T細胞受體(T cell receptor，TCR)的克隆性等也是新興的、值得關(guān)注的標志物。HLA基因能夠“教”免疫系統(tǒng)中的T細胞識別“自己”和“異己”，擁有更多樣化HLA基因意味著免疫系統(tǒng)更有能力識別不屬于機體內(nèi)部的“東西”；已有研究表明，HLA-I類分子多樣性越高，免疫治療療效越好；如果合并突變負荷高，免疫治療療效就最好[16]。

機體內(nèi)所有的TCR構(gòu)成了TCR庫，其多樣性直接反映了機體免疫應(yīng)答的狀態(tài)。TCR庫的瘤內(nèi)異質(zhì)性可能和基因組的瘤內(nèi)異質(zhì)性密切相關(guān)，與患者術(shù)后的復(fù)發(fā)風(fēng)險成正相關(guān)。最新研究表明，CD+8PD-L1+T細胞TCR克隆多樣性更高，免疫治療響應(yīng)越好[17]。

3 免疫治療負性療效預(yù)測的生物標志物

3.1STK11基因突變 STK11基因又名LKB1基因，其突變能調(diào)節(jié)冷腫瘤免疫微環(huán)境，是非鱗NSCLC PD-1抑制劑原發(fā)耐藥的重要因素。已有研究證明，無論pembrolizumab還是durvalumab治療晚期NSCLC，STK11突變或KEAP1突變均與免疫治療療效呈負相關(guān)。而且，TMB和PD-L1的腫瘤細胞陽性比例分數(shù)(tumor proportion score，TPS)狀態(tài)未影響到STK11突變或KEAP1突變NSCLC患者接受免疫治療的結(jié)果[18]。

3.2PTEN基因缺失 PTEN基因缺失可導(dǎo)致PI3K通路增強，進而致IFN-γ、顆粒酶B基因表達降低以及CD+8T細胞數(shù)目減少。在晚期黑色素瘤中，PTEN缺失與TILs減少正相關(guān)，PTEN表達與抗PD-1治療反應(yīng)相關(guān)[19]。在子宮平滑肌肉瘤中，PTEN缺失導(dǎo)致新抗原減少，進而導(dǎo)致免疫治療耐藥[20]。

3.3轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)上調(diào) TGF-β是一種重要的免疫抑制分子，主要通過刺激組織纖維化和細胞外基質(zhì)沉積，抑制免疫功能，促進血管生成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。2018年，《Nature》同期發(fā)表兩篇文章[21-22]，分別從基礎(chǔ)及臨床兩方面揭示腫瘤相關(guān)成纖維細胞分泌的TGF-β通過清除T細胞介導(dǎo)PD-L1抑制劑耐藥，與atezolizumab的療效負相關(guān)。

3.4β-catenin信號通路激活 一方面，β-catenin通過促進ATF3 的轉(zhuǎn)錄，抑制T細胞浸入腫瘤局部。另一方面，Wnt/β-catenin通路激活，提升Tregs存活能力，誘導(dǎo)CD+4T細胞向Th17分化，促使樹突狀細胞分泌IL-10/12，抑制CD+8T細胞功能，從而抑制機體抗腫瘤免疫應(yīng)答。

3.5JAK突變 由腫瘤特異的T細胞產(chǎn)生的IFN-γ，能識別腫瘤細胞或抗原呈遞細胞上的相應(yīng)受體，從而發(fā)揮免疫效應(yīng)。腫瘤細胞上IFN-γ通路相關(guān)蛋白，如IFN-γ受體(IFNGR1與IFNGR2)、IFN-γ受體鏈(JAK1與JAK2)、STATs及IRF1等突變與缺失，下游免疫反應(yīng)無法啟用(MHC-I與PD-L1)，導(dǎo)致免疫治療耐藥[23]。

3.6HLA-I表達缺失 B2M參與HLA-I類分子折疊和轉(zhuǎn)運到細胞膜。對基線和免疫治療復(fù)發(fā)后的樣本進行NGS檢測，發(fā)現(xiàn)B2M突變。B2M突變能使腫瘤細胞膜表面的HLA-I表達缺失，無法實現(xiàn)抗原呈遞，CD+8T細胞從而失去識別功能[24]。

3.7HLA-I等位基因的雜合性缺失 HLA-I等位基因雜合性缺失即HLA-I純合型。臨床研究表明，至少一個位點HLA-I(A&B&C)純合型及突變負荷低的患者，免疫治療不獲益[25]。

4 腫瘤免疫治療的預(yù)測和預(yù)后生物標志物

根據(jù)預(yù)后生物標志物的定義，并不存在免疫治療的預(yù)后標志物一說。前文提到的PD-L1、TMB，都不是腫瘤的預(yù)后生物標志物。最新研究表明，PD-L1表達越高，靶向治療耐藥出現(xiàn)越早，PD-L1高表達是靶向用藥的負性預(yù)測指標；當(dāng)淋巴細胞浸潤被用作NSCLC的預(yù)后標志物時，細胞增殖、PD-L1、吸煙史和組織學(xué)應(yīng)該予以考慮[26]。雖然CheckMate 227研究提示TMB雖然同時具有預(yù)測和預(yù)后價值，但CheckMate 026認為高TMB患者化療效果更差；迄今為止，仍認為TMB只有預(yù)測免疫治療療效的價值[27]。

T細胞炎癥微環(huán)境是惡性腫瘤的正向預(yù)后標志物[28]，目前有研究認為它還是免疫治療的療效預(yù)測標志物。炎性基因表達譜(gene expression profiling，GEP)是檢測特定細胞或微環(huán)境中基因RNA水平表達，可反映細胞功能或評估微環(huán)境狀況；炎性GEP可反映腫瘤微環(huán)境中免疫細胞狀況，包含了細胞類型、數(shù)量、功能、定位等信息。一項涉及20個瘤種的313例患者的回顧性研究，分析了PD-1抑制劑療效和18個炎癥基因表達水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)GEP評分高的患者亞組，ORR更高，PFS更長[29]。雖然TMB與GEP可以獨立預(yù)測療效，但是將兩者聯(lián)合起來，預(yù)測效果會更好。對KEYNOTE系列研究匯總顯示，在泛實體瘤、頭頸部鱗癌和NSCLC等3個隊列中，ORR和PFS獲益患者均為：TMBhiGEPhi>TMBlo或GEPlo>TMBloGEPlo [30]。

體細胞拷貝數(shù)變異(somatic copy number alterations，SCNA)包括非整倍體、亞二倍體、超二倍體、四倍體等，是惡性腫瘤的負性預(yù)后標志物。最新研究表明，它是免疫治療療效的正向預(yù)測標志物。在多種腫瘤中，全染色體SCNA與免疫浸潤呈負相關(guān)；在ipilimumab治療黑色素瘤時，SCNA與TMB可以一起用于預(yù)測療效，勝過其中任一指標；而且，SCNA可以獨立用于預(yù)測療效。其機制可能是SCNA導(dǎo)致免疫活性相關(guān)基因缺失，如HLA基因。

5 結(jié)束語

目前關(guān)于免疫治療療效預(yù)測的標志物研究主要集中在預(yù)測正向療效的PD-L1、TMB和MSI-H/dMMR上，其中又以PD-L1在臨床應(yīng)用上的認可度最高。HLA-I分子的多樣性、TCR庫的克隆性和T細胞炎性GEP有望成為新興的正性療效預(yù)測標志物。免疫治療負性療效預(yù)測的生物標志物則主要包括特定基因的突變、免疫抑制分子或免疫抑制細胞等，但這方面的研究還剛剛起步，尚不能成為臨床應(yīng)用的證據(jù)?，F(xiàn)有的研究表明，僅有T細胞炎性GEP和SCNA，既是腫瘤的預(yù)后生物標志物，也是免疫治療的療效預(yù)測標志物。尋找和發(fā)現(xiàn)最佳的腫瘤免疫治療的預(yù)測和預(yù)后標志物，依然道阻且長。