動(dòng)物源性食品中致病微生物的快速PCR 檢測(cè)

崔榮飛，楊 潔，甄 理，張彩云，劉 偉，曹 楠

（1.石家莊市畜產(chǎn)品和獸藥飼料質(zhì)量檢測(cè)中心 050041；2.河北省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 050000；3.石家莊市藁城區(qū)畜牧工作總站 052160）

動(dòng)物源性食品(Animal Derived Food)是指全部可食用的動(dòng)物組織、蛋和奶，包括肉類及其制品(含動(dòng)物臟器)、水生動(dòng)物產(chǎn)品以及相關(guān)副產(chǎn)品等。 隨著人民生活水平日益提高，動(dòng)物源性食品已成為國(guó)民飲食結(jié)構(gòu)中的主要品種和重要營(yíng)養(yǎng)來源。 我國(guó)在全世界范圍內(nèi)屬于動(dòng)物源性食品的生產(chǎn)大國(guó)和消費(fèi)大國(guó)， 同時(shí)動(dòng)物源性食品的質(zhì)量安全關(guān)系到人民群眾的身體健康， 引起全社會(huì)的普遍關(guān)注和相關(guān)從業(yè)者的廣泛研究。 動(dòng)物源性食品的質(zhì)量安全問題主要集中在：農(nóng)獸藥殘留問題、環(huán)境污染問題、加工和銷售過程中污染和添加，其中涉及到化學(xué)危害和生物危害等。 而在日常食源性疾病中， 由致病微生物引發(fā)的食物中毒或其他疾病是全球范圍內(nèi)食品安全面臨的主要風(fēng)險(xiǎn)， 而動(dòng)物及動(dòng)物源性食品是食源性致病微生物的主要攜帶者之一。 因此，科學(xué)家和相關(guān)從業(yè)者一直致力于動(dòng)物源性食品中致病微生物檢測(cè)技術(shù)的研究和開發(fā)。 傳統(tǒng)上，致病微生物的檢驗(yàn)方法主要是生物培養(yǎng)及鑒定，操作復(fù)雜、周期長(zhǎng)、要求微生物實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行，遠(yuǎn)不能滿足及時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)、高敏感性和特異性的現(xiàn)實(shí)需求。 隨著分子生物學(xué)技術(shù)研究的深入，微生物的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)也在不斷發(fā)展，其中PCR 技術(shù)因其極高的特異性、 靈敏度和可靠性已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、 食品檢測(cè)及其他與DNA 或RNA 鑒定相關(guān)的領(lǐng)域，該方法快速準(zhǔn)確，特別適合病原微生物的檢測(cè)，尤其是在今年的新冠疫情中全世界廣泛開展的核酸檢測(cè)， 展示了快速PCR技術(shù)在檢測(cè)領(lǐng)域的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)。 本文就動(dòng)物源性食品中致病微生物的PCR 檢測(cè)技術(shù)做以簡(jiǎn)單概述，拋磚引玉，希望引起更廣泛的思考和研究[1-2]。

1 常規(guī)PCR 技術(shù)

PCR 即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction），最早提出于二十世紀(jì)八十年代，是一種體外擴(kuò)增特異性DNA 片段的手段。 其本質(zhì)上是利用分子生物學(xué)技術(shù)，在PCR 儀中模仿DNA的天然復(fù)制過程，通過特定靶序列設(shè)計(jì)特異性引物，達(dá)到復(fù)制某一指定片段的目的。 PCR 反應(yīng)步驟包括變性、退火（復(fù)性）和延伸三個(gè)階段，只要在反應(yīng)體系中提供足夠多的堿基，并重復(fù)循環(huán)基本過程的這三個(gè)步驟，就可以獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，每次復(fù)制出的新DNA 鏈又作為下次循環(huán)的模板，幾個(gè)小時(shí)內(nèi)指數(shù)性增長(zhǎng)，將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增至幾百萬倍。 由于在所有細(xì)菌中編碼rRNA 的一些基因序列保守性很強(qiáng)，因此可以用PCR 擴(kuò)增其相應(yīng)的DNA 片段，以此快速靈敏的檢測(cè)動(dòng)物源性食品中是否存在某種致病菌，應(yīng)用PCR 技術(shù)檢測(cè)微生物，首先要提取靶DNA，即通過離心、 過濾或簡(jiǎn)單培養(yǎng)的方法從動(dòng)物源性食品中獲取細(xì)菌細(xì)胞，然后將細(xì)胞裂解，進(jìn)行核酸純化使其適合進(jìn)行擴(kuò)增[2-3]。

由于傳統(tǒng)PCR 技術(shù)出現(xiàn)最早，發(fā)展到現(xiàn)階段相關(guān)技術(shù)非常成熟， 相關(guān)產(chǎn)品和配套也比較豐富， 是接受度和應(yīng)用最廣泛的PCR 技術(shù)。

2 多重PCR 技術(shù)

常規(guī)PCR 開始被提出時(shí)，單個(gè)反應(yīng)體系只能特異性擴(kuò)增一段DNA 序列，因此只能檢測(cè)單一致病菌。 但實(shí)際應(yīng)用中我們常常需要針對(duì)目標(biāo)被測(cè)物檢測(cè)多種致病微生物， 多重PCR（multiplex PCR）的出現(xiàn)滿足了這一需求。多重PCR 與常規(guī)PCR 原理和反應(yīng)過程是相同的， 但是該技術(shù)通過在一個(gè)反應(yīng)體系中針對(duì)不同的DNA 或RNA 序列設(shè)計(jì)多對(duì)特異性引物，通過優(yōu)化避免幾個(gè)序列間的交叉反應(yīng)和干擾， 實(shí)現(xiàn)了一次PCR 反應(yīng)擴(kuò)增多條目的DNA 片段，達(dá)到單次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多種致病微生物的目的。

多重PCR 的優(yōu)點(diǎn)有：效率高，通過一次PCR 反應(yīng)擴(kuò)增多條目的DNA 片段，實(shí)現(xiàn)單次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多種致病微生物；實(shí)用價(jià)值更大，檢測(cè)工作實(shí)際中常需要對(duì)一組常見致病微生物進(jìn)行篩查，或通過單一致病菌的多個(gè)特征序列檢測(cè)對(duì)被測(cè)物進(jìn)行更準(zhǔn)確鑒定；成本降低，通過減少測(cè)試次數(shù)，大幅度節(jié)約檢測(cè)的時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本，有利于推廣應(yīng)用[4]。

多重PCR 技術(shù)在致病菌檢測(cè)方面的有兩個(gè)方向。 一是單次實(shí)驗(yàn)鑒定單一致病菌。 在一個(gè)多重PCR 反應(yīng)體系中真對(duì)致病菌選取多個(gè)保守序列設(shè)計(jì)特異性引物， 通過多個(gè)特征位點(diǎn)的檢測(cè)鑒定提高真確度，減少假陽性。 Kim S 等在臨床上利用多重PCR對(duì)沙門氏菌檢驗(yàn)分型。 藺芳等根據(jù)Genbank 中PRV 的gB、gE、TK 基因序列設(shè)計(jì)并合成引物,對(duì)樣品中PRVDNA 進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增及反應(yīng)條件優(yōu)化,快速鑒別豬偽狂犬疫苗毒和野毒。 二是單次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多種病原菌。 這種方法具有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值，通過單一擴(kuò)增反應(yīng)體系中對(duì)多種微生物的檢測(cè)，達(dá)到降低成本、簡(jiǎn)化操作又兼顧特異性和高敏性的目的[5]。 熊蘇玥等在2019 年利用多重PCR 對(duì)食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7、 沙門氏菌以及霉菌開展同時(shí)檢測(cè)，5 種致病微生物在20h 內(nèi)的檢出限均可達(dá)到100CFU/25g。 秦文彥等在2018 年通過優(yōu)化主要影響因子, 研究建立了產(chǎn)黃曲霉毒素真菌及其潛在飼料或食品污染的多重PCR 快速靈敏檢測(cè)體系。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR （qPCR） 于1996 年被提出， 即在一個(gè)PCR 反應(yīng)體系中引入熒光標(biāo)記物， 讓PCR 技術(shù)開始具備定量的能力，堪稱一次技術(shù)飛躍。 經(jīng)過不斷發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量逐漸成為一種基礎(chǔ)技術(shù)手段， 與各種不同的PCR 技術(shù)結(jié)合發(fā)展出各類其他熒光定量PCR 技術(shù)，因其特異性更強(qiáng)、不易污染、自動(dòng)化程度高的優(yōu)點(diǎn)，得到越來越廣泛的應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 通過在反應(yīng)中加入特異性探針對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤， 加入的探針攜帶有熒光標(biāo)記，監(jiān)控設(shè)備檢測(cè)熒光標(biāo)記，既可以實(shí)時(shí)了解反應(yīng)過程，也可以更直觀的對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，利用專業(yè)軟件對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，得到樣品中目標(biāo)被測(cè)物的初始濃度，從而實(shí)現(xiàn)較為簡(jiǎn)便的定量檢測(cè)[6]。

熒光定量PCR 有熒光染料摻入法和探針法兩種常用方法。熒光染料摻入法是把過量的熒光染料加入PCR 反應(yīng)體系中，反應(yīng)開始前此染料不會(huì)發(fā)光， 在反應(yīng)過程中部分熒光染料會(huì)特異性地?fù)饺隓NA 雙鏈，開始發(fā)射熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)進(jìn)程的持續(xù)，熒光信號(hào)的增加與PCR 產(chǎn)物的擴(kuò)增同步， 實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)進(jìn)程的監(jiān)控。 探針法是指在一個(gè)PCR 反應(yīng)體系中加入攜帶有熒光基團(tuán)的特異性探針， 這個(gè)寡核苷酸探針包括一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。 反應(yīng)開始前，完整探針不向外發(fā)射熒光信號(hào)，擴(kuò)增開始后， 探針隨DNA 擴(kuò)增被同時(shí)酶切分解為兩個(gè)獨(dú)立基團(tuán)，使報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)無法被淬滅熒光基團(tuán)吸收，相應(yīng)的熒光信號(hào)就被監(jiān)控系統(tǒng)接收到，重復(fù)這一過程，就能使每一條擴(kuò)增的DNA 鏈與熒光分子形成一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，通過觀測(cè)熒光信號(hào)累積達(dá)到實(shí)時(shí)定量目的[7]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)經(jīng)歷了二十多年的發(fā)展，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各類傳染性疾病的臨床診斷和療效評(píng)價(jià)，禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟等動(dòng)物疫病病原菌和抗體檢測(cè)，食源微生物、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因研究等食品安全領(lǐng)域[8]。 何苗等在2016 年使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和雙歧桿菌屬及種特異性引物對(duì)收集的嬰兒糞便中的雙歧桿菌屬及人體腸道特有的8 個(gè)雙歧桿菌菌種進(jìn)行定性及定量分析。 章沙沙在2016 年設(shè)計(jì)并優(yōu)化實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系，建立了沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌和副溶血弧菌六種食源性致病菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法， 并通過食品樣品的檢測(cè)和傳統(tǒng)方法驗(yàn)證，證明該方法具有良好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（LAMP）技術(shù)

PCR 方法操作起來較復(fù)雜，其對(duì)溫度控制的較高要求令試驗(yàn)過程對(duì)儀器和人員都提出較高要求， 不適合基層或現(xiàn)場(chǎng)快速診斷，2000 年日本學(xué)者提出了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)。其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)使得這項(xiàng)技術(shù)在短短幾年間被成功應(yīng)用于多種疾病的檢測(cè)中， 如SARS、禽流感、HIV 等。 該技術(shù)通過針對(duì)目的基因的6 個(gè)不同區(qū)域，分別設(shè)計(jì)一對(duì)外部引物和一對(duì)內(nèi)部引物進(jìn)行識(shí)別， 極大增加了目的DNA 片段的特異選擇性，降低了交叉反應(yīng)和干擾率。 LAMP 最大的優(yōu)勢(shì)是整個(gè)反應(yīng)體系在等溫條件(63℃左右)下進(jìn)行，且反應(yīng)時(shí)間縮短至30～60min[9]。 LAMP 方法的優(yōu)勢(shì)除了高特異性、高靈敏度外，還對(duì)操作和儀器設(shè)備的要求降低了，因?yàn)長(zhǎng)AMP 技術(shù)不需要傳統(tǒng)PCR 技術(shù)中升溫和退火的溫度變化過程， 只需要借助特殊的鏈置換DNA 聚合酶就實(shí)現(xiàn)了等溫條件下擴(kuò)增降低了對(duì)昂貴、精密實(shí)驗(yàn)儀器的需求，簡(jiǎn)單的控溫水浴鍋或恒溫箱就滿足實(shí)驗(yàn)條件。 LAMP 反應(yīng)過程產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀，這是一種白色副產(chǎn)物，能造成反應(yīng)體系溶液的渾濁，因此反應(yīng)結(jié)束后即使不經(jīng)過凝膠電泳，只使用濁度計(jì)或肉眼觀察也能夠判斷結(jié)果，相較傳統(tǒng)PCR 技術(shù)更具有簡(jiǎn)便性和易操作性， 是較為理想的快速檢測(cè)方法。 LAMP 方法在反應(yīng)進(jìn)程中不能開蓋操作，否則易造成氣溶膠污染，導(dǎo)致假陽性結(jié)果[10]。

LAMP 技術(shù)通過20 年的發(fā)展，在醫(yī)學(xué)診斷、流行病學(xué)、食品檢測(cè)和獸醫(yī)領(lǐng)域都得到了大范圍推廣和廣泛應(yīng)用。國(guó)內(nèi)在LAMP技術(shù)方面的研究起步較晚，黃朱梁等在2015 年針對(duì)食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌建立了基于LAMP 技術(shù)的實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)方法， 該方法對(duì)培養(yǎng)的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)下限為32CFU/mL,可在60min 內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)。 李佳桐等在2014 年根據(jù)GenBank 公布的沙門氏菌高度保守的STN 基因序列設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化和建立了沙門氏菌的LAMP 檢測(cè)方法，最低可檢出濃度為101CFU/mL。

5 重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（RAA）技術(shù)的應(yīng)用

近幾年國(guó)內(nèi)出現(xiàn)了一種分子生物學(xué)新技術(shù)， 即重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù) （Recombinase Aided Amplification）， 簡(jiǎn)稱RAA。 該技術(shù)利用從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶，能夠在恒定常溫 （39℃） 條件下實(shí)現(xiàn)核酸的快速擴(kuò)增。 該重組酶首先與引物DNA 緊密結(jié)合，以酶和引物的聚合體形式在模板DNA 上進(jìn)行搜索，當(dāng)發(fā)現(xiàn)完全匹配的互補(bǔ)序列時(shí)，反應(yīng)體系中的單鏈DNA 結(jié)合蛋白開始發(fā)揮作用，幫助打開模板DNA 的雙鏈結(jié)構(gòu)，然后在DNA 聚合酶的作用下開始序列復(fù)制擴(kuò)增，最終形成新的DNA 雙鏈，通過周期性重復(fù)反應(yīng)過程使擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。 結(jié)合熒光即時(shí)檢測(cè)， 實(shí)現(xiàn)5～20min 輸出結(jié)果， 靈敏度達(dá)到10copies/測(cè)試，該方法對(duì)環(huán)境溫度、操作技能和實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求更低，具有很大發(fā)展優(yōu)勢(shì)。

重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)提出的時(shí)間較短， 且尚未形成一定應(yīng)用規(guī)模，因此應(yīng)用實(shí)例和相關(guān)報(bào)道也不多，李婷在2019年針對(duì)血吸蟲病診斷的敏感性、特異性及可操作性的需求,基于重組酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理建立日本血吸蟲特異性基因片段RAA 快速檢測(cè)方法，初步研究表明,建立的熒光RAA 法可用于血吸蟲不同樣品的檢測(cè)，且在保持特異性良好的同時(shí),檢測(cè)敏感性較基礎(chǔ)法提高了100 倍。 魏瑩等在2018 年基于RAA 熒光法建立優(yōu)化了溶血性鏈球菌檢測(cè)方法， 并生產(chǎn)了相關(guān)快速檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品。

6 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）技術(shù)的應(yīng)用

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA),因具有比傳統(tǒng)分子及免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)等更快速、靈敏、特異、簡(jiǎn)便以及實(shí)用性強(qiáng)等方面優(yōu)勢(shì), 現(xiàn)已在一定程度上得到應(yīng)用。 RPA 反應(yīng)的最適溫度在37℃～42℃， 無需變性， 在常溫下即可進(jìn)行。 這無疑能大大加快PCR 的速度。 此外，由于不需要溫控設(shè)備，RPA 可以真正實(shí)現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測(cè)。 RPA 既可以擴(kuò)增DNA 也可以擴(kuò)增RNA，還省去了額外的cDNA 合成步驟。 RPA 技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA 結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA 聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應(yīng)溫度在37℃左右[11]。

重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)也是最近幾年開始興起的新技術(shù)，目前在國(guó)內(nèi)應(yīng)用不多，在致病微生物方面的報(bào)道更少。 王金鳳在2018 年基于LMhlyA 基因保守序列， 建立并優(yōu)化了單核細(xì)胞增生李斯特氏菌實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè)方法；劉立兵在2018 年根據(jù)蠟樣芽胞桿菌保守基因16S RNA 設(shè)計(jì)特異性引物， 建立了可用于食品中低濃度蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)的real-time RPA 方法。

7 總結(jié)

隨著分子生物學(xué)的不斷研究， 針對(duì)動(dòng)物源性食品中致病微生物檢測(cè)的PCR 方法一定會(huì)不斷發(fā)展和更新, 并時(shí)刻發(fā)生著技術(shù)進(jìn)步，回想十年以前，常規(guī)PCR 技術(shù)還屬于檢測(cè)領(lǐng)域的先進(jìn)技術(shù)，現(xiàn)在已經(jīng)非常普及，更是出現(xiàn)了如LAMP、RAA、RPA 等等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，可以算得上是PCR 技術(shù)領(lǐng)域的一次技術(shù)革命，伴隨著這次技術(shù)浪潮的推進(jìn)，我們也要與時(shí)俱進(jìn)，努力學(xué)習(xí)應(yīng)用新技術(shù)，以更具活力的狀態(tài)完成我們的檢測(cè)任務(wù)。