氯霉素、孔雀石綠快速檢測(cè)淺析與應(yīng)用

楊雪婷，李志軍，和永梅

（云南省迪慶藏族自治州維西傈僳族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)服務(wù)中心 674600）

1 前言

快速檢測(cè)的應(yīng)用與發(fā)展一直深受檢疫有關(guān)部門和市場監(jiān)管部門的關(guān)注，便捷、快速、高效也成為各種檢測(cè)試劑盒改進(jìn)發(fā)展的目標(biāo)。 目前維西縣市場上的動(dòng)物產(chǎn)品，特別是水生動(dòng)物產(chǎn)品草魚、鯉魚、鯽魚、蝦、泥鰍等都需要得到及時(shí)準(zhǔn)確地檢驗(yàn)，人們對(duì)食品安全越來越重視， 更需要在一定程度上減少帶疫病動(dòng)物產(chǎn)品或動(dòng)物體內(nèi)有害殘留成分對(duì)人們生活的影響。 在水產(chǎn)品市場上， 盡管監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)檢測(cè)水產(chǎn)品中的孔雀石綠和氯霉素等有害藥物殘留有嚴(yán)格要求。 但市場監(jiān)管部門、農(nóng)業(yè)部門對(duì)水產(chǎn)的檢測(cè)監(jiān)管機(jī)制還有待完善，在短期利益的驅(qū)使下，水產(chǎn)行業(yè)仍然存在非法使用氯霉素和孔雀石綠的現(xiàn)象， 特別在非洲豬瘟疫情在國內(nèi)發(fā)生以來，水產(chǎn)、禽類、牛羊等肉類占據(jù)的市場份額也在不斷增加， 水產(chǎn)品的安全性也已成為影響食品質(zhì)量安全和國際市場競爭力的重要因素。 重視食品安全也關(guān)系到人類健康。 因此，在水產(chǎn)市場檢測(cè)監(jiān)管過程中， 應(yīng)該了解快速檢測(cè)， 進(jìn)行市場預(yù)防、檢測(cè)和控制，才能快速、準(zhǔn)確地獲得結(jié)果，并維護(hù)市場食品安全。

1.1 孔雀石綠和氯霉素簡介

氯霉素主要是對(duì)人和動(dòng)物進(jìn)行細(xì)菌感染性疾病治療的抗生素，用于治療的同時(shí)還產(chǎn)生毒副作用,對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)健康造成威脅[3]，影響紅細(xì)胞、白細(xì)胞等血細(xì)胞在血液中的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致粒狀白細(xì)胞缺乏癥,抑制紅髓造血[2]。 使用該藥物后在動(dòng)物體內(nèi)的代謝殘留還會(huì)增強(qiáng)病菌的耐藥性,對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品安全和人類食品健康甚至生物圈的生態(tài)平衡產(chǎn)生嚴(yán)重影響。目前，美國、歐盟、中國等國家和組織都對(duì)動(dòng)物性食品中氯霉素極其代謝的有害殘留量有著明確的限定， 不得在有關(guān)產(chǎn)品中檢測(cè)出[4]。 雖明令禁止，但就目前來看，人們?cè)陴B(yǎng)殖中對(duì)使用氯霉素治療的依賴還難以完全擺脫，藥物監(jiān)管不到位，使出售到市場上的水生動(dòng)物產(chǎn)品體內(nèi)依然存在氯霉素過量殘留。

孔雀石綠自身三苯甲烷類結(jié)構(gòu)與它特有的毒性密不可分。因其良好的殺菌效果而被用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。 當(dāng)水生動(dòng)物體從周邊環(huán)境中攝入孔雀石綠， 經(jīng)機(jī)體內(nèi)發(fā)生生物轉(zhuǎn)化代謝后主要以無色孔雀石綠的形式蓄積在水生動(dòng)物的器官組織中， 整個(gè)代謝過程中在排泄組織中濃度最高[8]。 科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，使用孔雀石綠后水生動(dòng)物體內(nèi)易留存其代謝產(chǎn)物， 被人攝入吸收后能透過細(xì)胞膜，在細(xì)胞代謝過程中進(jìn)入細(xì)胞核，對(duì)DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，誘發(fā)正常細(xì)胞癌變[6]。 無色孔雀石綠是孔雀石綠在環(huán)境中代謝的主要產(chǎn)物，容易在水生動(dòng)物產(chǎn)品中孔雀石綠代謝產(chǎn)物殘留。無色孔雀石綠使機(jī)體各項(xiàng)生化指標(biāo)發(fā)生變化的毒性作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于母體化合物，殘留量更多，殘留時(shí)間較更長，殘留問題更應(yīng)得到重視。

1.2 快速檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀

在氯霉素殘留控制過程中，準(zhǔn)確、便捷、快速的檢測(cè)方式發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。 近年來，氯霉素的檢測(cè)方法得到了人們的積極探索。 從最初利用微生物進(jìn)行定性檢測(cè)，到如今各種先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)，如酶聯(lián)免疫法[3]、高效液相色譜法[9]、氣相色譜法[9]等,不停地推動(dòng)著食品安全監(jiān)督管理事業(yè)的完善與發(fā)展。 讓氯霉素的檢測(cè)靈敏度、精確性、檢測(cè)時(shí)限等方面的技術(shù)在以往的基礎(chǔ)上都得到了有力提升，使氯霉素的檢測(cè)極限，精密度和回收率大大提高。 膠體金免疫層析試紙條,應(yīng)用免疫學(xué)競爭方法,在膠體金結(jié)合墊上使抗氯霉素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物包被覆蓋, 同時(shí)在硝酸纖維素薄膜表面包被氯霉素抗原作為檢測(cè)線[7]。 當(dāng)待檢物中氯霉素殘留達(dá)到一定限度， 就能夠競爭結(jié)合膠體金標(biāo)記的氯霉素單克隆抗體,能通過直觀的顏色反映檢測(cè)的結(jié)果[7]。適用于市場氯霉素殘留檢疫現(xiàn)場監(jiān)控。

目前在無色孔雀石綠殘留控制過程中，準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方式也發(fā)揮了關(guān)鍵的作用， 檢測(cè)方法在快速的科學(xué)技術(shù)發(fā)展過程中日新月異。 主要有薄層色譜法[6]、分光光度法[6]等。 這些方法以定量檢測(cè)殘留為目標(biāo)，需要大量的專業(yè)的技術(shù)人員投入，需要價(jià)格昂貴的儀器設(shè)備支持，操作要求精細(xì)，過程復(fù)雜。 在現(xiàn)場進(jìn)行大規(guī)模的檢測(cè)，要求操作簡易便捷，反映靈敏，儀器、試劑盒實(shí)用價(jià)廉，用時(shí)短。 快速檢測(cè)方法以免疫學(xué)方法為基礎(chǔ)，在研究人員的大量研究、實(shí)驗(yàn)中均有良好的反應(yīng)性，適合作為藥物殘留檢測(cè)的快速篩選方法之一[5]。 若設(shè)立市場快速檢測(cè)監(jiān)控站，作為一種僅需通用儀器的快速靈敏的檢測(cè)技術(shù)， 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒可用于現(xiàn)場檢測(cè)無色孔雀石綠中的藥物殘留。

1.3 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵饬x

快速檢測(cè)手段的應(yīng)用與發(fā)展一直深受檢疫有關(guān)部門和市場監(jiān)管部門的關(guān)注，便捷、快速、高效也成為各種檢測(cè)試劑盒改進(jìn)發(fā)展的目標(biāo)。 良好的市場監(jiān)管為人們的飲食健康安全提供了保障,同時(shí)為我國的食品對(duì)外貿(mào)易發(fā)揮了巨大作用。 為了保證各種水生動(dòng)物產(chǎn)品的質(zhì)量安全，能夠在最短的時(shí)間內(nèi)建立便捷、高效的快速檢測(cè)技術(shù)來檢測(cè)水產(chǎn)品中無色孔雀石綠與氯霉素的殘留具有重要的意義。 用一種方便快速的檢測(cè)手段，既保證了效率，又節(jié)省了人力，及時(shí)發(fā)現(xiàn)“問題產(chǎn)品”及時(shí)處理，也避免了對(duì)人們生活造成不必要的影響和傷害。

2 實(shí)驗(yàn)所需材料與原理淺析

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

電子秤、移液槍、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、氮吹儀、孔雀石綠快速檢測(cè)試劑盒、氯霉素快速檢測(cè)試劑盒。 氯霉素快速檢測(cè)試劑盒中包括：緩沖液、提取劑、凈化劑、離心管（15mL 和5mL）、氯霉素快速檢測(cè)卡?？兹甘G快速檢測(cè)試劑盒中包括：提取劑A、提取劑B、緩沖液、氧化劑、凈化劑、離心管（15mL 和5mL）、孔雀石綠快速檢測(cè)卡。

2.2 快速檢測(cè)氯霉素的實(shí)驗(yàn)原理

氯霉素快速檢測(cè)卡對(duì)水生動(dòng)物組織中的氯霉素殘留檢出限為0.3ppb， 應(yīng)用了競爭抑制免疫層析的原理使樣本液中的氯霉素在與檢測(cè)卡接觸過程中通過競爭抑制了抗體和NG 膜檢測(cè)線（T）上氯霉素蛋白偶連物的結(jié)合[7]。 在樣本處理過程中，選用乙酸乙酯[1]作提取劑，提取出肌肉內(nèi)臟中的氯霉素，混勻離心后氯霉素溶于上層有機(jī)相，將有機(jī)相吹干，選用正己烷做凈化劑[1]，除去其中脂質(zhì)分子，最后用試紙進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 快速檢測(cè)孔雀石綠的實(shí)驗(yàn)原理

孔雀石綠快速檢測(cè)卡對(duì)魚、 蝦等組織中的孔雀石綠檢出限為2ppb， 應(yīng)用了競爭抑制免疫層析的原理使樣本液中的孔雀石綠在與檢測(cè)卡接觸過程中，通過競爭性抑制抗體和NG 膜檢測(cè)線上孔雀石綠蛋白偶連物的結(jié)合[5]。 在樣本處理過程中，選用乙腈作提取劑A、中性氧化鋁作提取劑B[8]盡可能有效地充分提取組織中的孔雀石綠代謝產(chǎn)物， 混勻離心后孔雀石綠代謝產(chǎn)物溶于上層有機(jī)相加入微量氧化劑，選用正己烷做凈化劑，提取的成分溶于下層溶液并呈紫紅色，用氮?dú)獯蹈珊?，加緩沖液混勻待檢。

2.4 快速檢測(cè)結(jié)果判定

注：圖中C 線為質(zhì)控線，T 線為檢測(cè)線。 當(dāng)測(cè)試結(jié)果中C 線顯色比T 線顯色淺或與T 線顯色相同時(shí)檢測(cè)結(jié)果為陰性；當(dāng)C 線顯色比T 線顯色深或C 線顯色T 線不顯色時(shí)檢測(cè)結(jié)果為陽性；當(dāng)C、T 線均不顯色或只有T 線顯色時(shí)檢測(cè)結(jié)果無效。

3 市場監(jiān)管和快速測(cè)試應(yīng)用的前景

快速檢測(cè)方法基于免疫學(xué)方法， 并采用競爭抑制免疫層析原理。 選擇基于此技術(shù)的快速檢測(cè)套件來進(jìn)行市場監(jiān)管的快速檢測(cè)，并在市場食品衛(wèi)生監(jiān)管中做得更好，要容易得多。 此類產(chǎn)品應(yīng)價(jià)格便宜，靈敏，快速，適合大規(guī)模現(xiàn)場檢測(cè)，適合作為藥物殘留檢測(cè)的快速篩選方法， 并且只需要使用普通儀器的檢測(cè)技術(shù)即可進(jìn)行無色孔雀石綠現(xiàn)場藥物殘留檢測(cè)初步篩選測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果高度可靠。 如果發(fā)現(xiàn)陽性樣品，樣品將被送至上級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重新檢查，等待結(jié)果，然后將采取相應(yīng)的措施以積極應(yīng)對(duì)。

快速檢測(cè)卡為定性檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)過程只需要90min 左右，適用于現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣品篩查。 操作簡單，對(duì)儀器設(shè)備要求不高。 為了保證各種水生動(dòng)物產(chǎn)品的質(zhì)量安全，需要能夠在最短的時(shí)間內(nèi)建立便捷、 高效的快速檢測(cè)技術(shù)來檢測(cè)水產(chǎn)品中無色孔雀石綠與氯霉素的殘留。 盡管快速檢測(cè)手段具有快速、便捷等諸多優(yōu)點(diǎn)，但面對(duì)定量檢測(cè)等要求，其自身缺陷就顯現(xiàn)出來，因?yàn)槲覀兊玫降闹皇侵吏~體內(nèi)是否含有違禁藥物， 具體藥物殘留有多少，沒有定量，這是快速檢測(cè)的弊端。 從基層市場監(jiān)管來看，快速檢測(cè)卡能夠更快，更準(zhǔn)確地做好食品安全檢測(cè)，能夠?yàn)楸O(jiān)管部門從市場中把關(guān)起到良好的輔助作用， 逐漸對(duì)養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生良好的促進(jìn)作用。 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，會(huì)有更多先進(jìn)的檢驗(yàn)技術(shù)問世，借助這些先進(jìn)的技術(shù)，有關(guān)部門就能更好地服務(wù)于市場，服務(wù)于人們。