基于核酸適配體檢測(cè)平臺(tái)的設(shè)計(jì)模式*

劉小慧 彭 虎，2 張艷瓊

（三峽大學(xué)，1 醫(yī)學(xué)院，2 腫瘤微環(huán)境與免疫湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜昌 443002）

適配體是短單鏈寡核苷酸（DNA或RNA）或肽類，它們通過(guò)折疊成三維結(jié)構(gòu)可識(shí)別幾乎所有類型的靶點(diǎn)，如金屬離子、毒素、藥物、蛋白質(zhì)和細(xì)胞[1]。核酸適配體易被功能基團(tuán)修飾，可構(gòu)建特異性的分子探針。由于核酸適配體及其識(shí)別靶標(biāo)所產(chǎn)生的生物信號(hào)可被傳感器識(shí)別，并被轉(zhuǎn)化為可探測(cè)的信號(hào)，可被用于設(shè)計(jì)多種傳感器。因而，基于核酸適配體的檢測(cè)平臺(tái)可以分為核酸適配體探針和核酸適配體傳感器，兩者都被廣泛用于生物檢測(cè)。核酸適配體具有以下優(yōu)點(diǎn)：核酸適配體非常穩(wěn)定，即使在熱變性后也能恢復(fù)其活性構(gòu)象；高純度的核酸適配體可被重復(fù)合成，并且通過(guò)分離和回收，核酸適配體可以在不失去活性的情況下被重新利用[2]。因此，基于核酸適配體的檢測(cè)平臺(tái)有望成為臨床診斷的重要工具。根據(jù)分子探針的設(shè)計(jì)策略，核酸適配體檢測(cè)平臺(tái)分為常開模式、靶向誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)改變模式和競(jìng)爭(zhēng)性替換模式，現(xiàn)對(duì)3種模式的設(shè)計(jì)基本原理及其優(yōu)點(diǎn)做一綜述。

1 常開模式

在常開模式（always-on mode）的設(shè)計(jì)中，采用分子標(biāo)簽修飾核酸適配體以達(dá)到追蹤靶標(biāo)的目的。分子標(biāo)簽通常是熒光團(tuán)和納米粒子。在這種設(shè)計(jì)策略下，被標(biāo)記的核酸適配體與靶標(biāo)結(jié)合，分子標(biāo)簽在靶標(biāo)周圍逐漸積累。因而相對(duì)于背景，檢測(cè)信號(hào)也逐漸增強(qiáng)。這種設(shè)計(jì)模式的特點(diǎn)是不必激活即可產(chǎn)生恒定的檢測(cè)信號(hào)[3]。

1.1 熒光團(tuán)標(biāo)記的核酸適配體探針

熒光團(tuán)標(biāo)記的核酸適配體探針，由于其優(yōu)異的靈敏度和成本低而被廣泛應(yīng)用，是一種重要的臨床診斷工具。熒光團(tuán)通常連接在核酸適配體序列的末端，因?yàn)檫@種空間結(jié)構(gòu)對(duì)靶標(biāo)識(shí)別的阻礙較小，且不易導(dǎo)致熒光猝滅。通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)分析，就能確定靶標(biāo)的時(shí)空分布。此外，通過(guò)靜脈注射核酸適配體探針，也可在體內(nèi)進(jìn)行實(shí)時(shí)分子成像。Zhang等[4]針對(duì)這種常開設(shè)計(jì)模式的初步研究結(jié)果提示，核酸適配體和抗體可以協(xié)同使用，提高了淋巴瘤的診斷水平。除了能夠在簡(jiǎn)單的系統(tǒng)中識(shí)別一種靶細(xì)胞或分子，熒光團(tuán)標(biāo)記的核酸適配體還能識(shí)別不同類型的癌癥，甚至在復(fù)雜的樣本中識(shí)別它們的亞型[5]。Yuan 等[6]的研究結(jié)果顯示，特異性結(jié)合淋巴結(jié)組織的核酸適配體，在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的總檢出率為73.9%，而無(wú)轉(zhuǎn)移或癌旁組織的檢出率較低。同樣，Wang等[7]也使用核酸適配體識(shí)別具有類似致瘤潛力，但轉(zhuǎn)移性相反的細(xì)胞系。體內(nèi)熒光成像和臨床組織成像也清楚地表明，核酸適配體可以達(dá)到顯著的靶向效率。因此，熒光團(tuán)標(biāo)記的核酸適配體有望成為轉(zhuǎn)移癌診斷的分子探針，并通過(guò)跟蹤熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)空間成像。

1.2 納米粒子標(biāo)記的核酸適配體探針

納米粒子標(biāo)記的核酸適配體探針可以用于臨床檢測(cè)，甚至是在血液等復(fù)雜系統(tǒng)中提取靶標(biāo)的理想工具。迄今為止，各種各樣的納米粒子被用來(lái)標(biāo)記核酸適配體，包括聚合物納米粒子、介孔二氧化硅納米粒子、金屬納米粒子、量子點(diǎn)和碳納米管。由于核酸適配體分子量低，可以將其固定在納米粒子表面，形成核酸適配體-納米粒子體系。納米粒子與核酸適配體的偶聯(lián)方法可分為共價(jià)偶聯(lián)和非共價(jià)偶聯(lián)。在共價(jià)偶聯(lián)中，核酸適配體可以通過(guò)化學(xué)鍵與量子點(diǎn)表面結(jié)合。例如，在1-[3-二甲基氨基丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二亞胺的催化下，羧基標(biāo)記的量子點(diǎn)與氨基標(biāo)記的核酸適配體偶聯(lián)。非共價(jià)偶聯(lián)是基于生物分子之間的特定相互作用。利用生物素和鏈霉親和素之間的特異性相互作用，量子點(diǎn)可以與核酸適配體結(jié)合。量子點(diǎn)是近球形的熒光納米晶體，直徑為2～20 nm，由Ⅳ、Ⅱ～Ⅵ、Ⅳ～Ⅵ或Ⅱ～Ⅴ族元素組成。量子點(diǎn)具有較高的量子產(chǎn)率、快速的發(fā)射速率、較強(qiáng)的耐光漂白性、化學(xué)穩(wěn)定性和非閃爍的特性[8]。并且，量子點(diǎn)與核酸適配體的結(jié)合不會(huì)引起激發(fā)峰發(fā)生位移[9]。納米材料還可以保護(hù)核酸適配體不被檢測(cè)環(huán)境中的核酸酶降解[8]。因此，在體內(nèi)成像方面，量子點(diǎn)可以替代熒光團(tuán)（如5-氨基乙?；撬岷蜔晒馑剽c）來(lái)標(biāo)記核酸適配體，從而提高臨床診斷的敏感性和選擇性[10]。量子點(diǎn)標(biāo)記的核酸適配體也可以用于熒光引導(dǎo)手術(shù)，它可以勾畫腫瘤邊界，最大限度地實(shí)現(xiàn)了腫瘤安全切除[11]。因此，量子點(diǎn)標(biāo)記的核酸適配體探針在腫瘤的分子診斷、影像引導(dǎo)手術(shù)和術(shù)后檢查等方面具有良好的應(yīng)用前景。此外，量子點(diǎn)標(biāo)記的核酸適配體還可以用于多重成像。由于量子點(diǎn)特定的光學(xué)和電化學(xué)性質(zhì)隨其尺寸的改變而變化，并且量子點(diǎn)的吸收光譜寬，發(fā)射光譜窄而對(duì)稱[12]。量子點(diǎn)標(biāo)記的核酸適配體探針可以通過(guò)顯示不同的顏色，來(lái)評(píng)估不同基因在單個(gè)細(xì)胞中的表達(dá)[13]。因而，在體外，多種的量子點(diǎn)可同時(shí)應(yīng)用于癌細(xì)胞的多重成像。

目前，多模態(tài)分子成像正逐漸成為主流。由于每一種成像方式都有優(yōu)缺點(diǎn)，它們的集成可以帶來(lái)進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和功能改進(jìn)。最常用的多模態(tài)探針涉及磁共振成像（magnetic resonance imaging， MRI）和光學(xué)成像的結(jié)合。MRI具有較高的空間分辨率，同時(shí)它還擁有獲取生理和解剖信息的能力。其中，高密度順磁超細(xì)氧化釓納米粒子作為T1造影劑可以標(biāo)記核酸適配體，使質(zhì)子弛緩增強(qiáng)，且有較低的檢測(cè)限度[14]。而光學(xué)成像又提供了高靈敏度。如果2種納米顆粒的比例適當(dāng)，則熒光發(fā)射和MRI信號(hào)都能增強(qiáng)[15]。雖然常開模式的設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，制備要求不復(fù)雜，但由于靶向結(jié)合產(chǎn)生的信號(hào)有限，靈敏度相對(duì)較低。同時(shí)，利用各種信號(hào)放大方法來(lái)研制高靈敏度的生物傳感器是十分不易。因此，這種設(shè)計(jì)方法有一定的局限性，近年來(lái)鮮有新進(jìn)展。

2 靶向誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)改變模式

在靶向誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)改變模式（traget-induced structure switching mode）中，核酸適配體優(yōu)先與靶標(biāo)結(jié)合，從而改變了原設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)。其特點(diǎn)是核酸適配體與靶標(biāo)結(jié)合的構(gòu)象變化導(dǎo)致了檢測(cè)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括光的散射和吸收特性等。這種模式的核酸適配體探針又可以根據(jù)是否改變自身的三維結(jié)構(gòu)，分為“打開”和“關(guān)閉”2種模式。探針和靶標(biāo)的結(jié)合作為開關(guān)控制信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在這種設(shè)計(jì)模式中，最常運(yùn)用的原理是熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）。FRET的發(fā)生與供體和受體的空間距離（通常為1～10 nm）密切相關(guān)[16]。當(dāng)應(yīng)用核酸適配體進(jìn)行基于FRET的分析時(shí)，利用核酸適配體的特異性識(shí)別，使供體和受體處于距離合適范圍內(nèi)，從而觸發(fā)FRET[17-18]。熒光染料、量子點(diǎn)和聚合物被廣泛用作能量供體[17]。

2.1 “打開”核酸適配體探針模式

在“打開”核酸適配體探針模式中，檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度隨靶向結(jié)合的增多而增加。熒光團(tuán)與猝滅劑通過(guò)共價(jià)結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物使熒光完全猝滅。但將熒光團(tuán)與猝滅劑隔離后，熒光淬滅反應(yīng)減弱，從而熒光恢復(fù)。這種機(jī)制在“打開”模式中應(yīng)用最為廣泛。Ma等[19]設(shè)計(jì)了2條核酸適配體的互補(bǔ)序列，在序列末端分別修飾了熒光團(tuán)和猝滅劑。核酸適配體可以結(jié)合熒光團(tuán)標(biāo)記的互補(bǔ)鏈和猝滅劑標(biāo)記的互補(bǔ)鏈，從而使猝滅劑有效地猝滅熒光團(tuán)的熒光。而當(dāng)靶標(biāo)存在時(shí)，核酸適配體傾向于和靶標(biāo)結(jié)合，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)，熒光恢復(fù)。該核酸適配體感受器的檢測(cè)限度為0.70 ng / mL。此外，近紅外的量子點(diǎn)可在近紅外檢測(cè)窗口（650～900 nm）被檢測(cè)到，避免了以生物基質(zhì)為背景的干擾。Wang等[20]運(yùn)用這種新型的近紅外-FRET模式，檢測(cè)到了0.6 pmol/L胰島素。除了近紅外的量子點(diǎn)外，鑭系上轉(zhuǎn)換納米粒子（lanthanidedoped upconversion nanoparticles） 作為高效的能量供體可用于復(fù)雜樣品的檢測(cè)[21]。

2.2 “關(guān)閉”核酸適配體探針模式

Cho等[22]提出了一種“關(guān)閉”核酸適配體探針設(shè)計(jì)模式。在傳統(tǒng)檢測(cè)方法中是通過(guò)測(cè)量顏色變化或熒光猝滅監(jiān)測(cè)核酸適配體與靶標(biāo)的相互作用，但受傳感器靈敏度或相關(guān)檢測(cè)復(fù)雜性的限制。例如，比色測(cè)定或熒光猝滅需要收集大量的納米粒子，以獲得可識(shí)別的顏色變化或熒光信號(hào)。因此，表面增強(qiáng)熒光（surface-enhanced fluorescence， SEF）的運(yùn)用，在很大程度上增強(qiáng)了熒光信號(hào)。Cho等[22]研究顯示，當(dāng)靶標(biāo)缺失時(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）165核酸適配體被展開，與包覆在金納米粒子表面的帶正電荷的多聚賴氨酸結(jié)合，從而激發(fā)Cy3- VEGF165核酸適配體的SEF。當(dāng)VEGF165核酸適配體遇到靶標(biāo)時(shí)，由于靜電結(jié)合力降低，構(gòu)象改變的核酸適配體又從金納米粒子表面釋放。因此，從金納米粒子表面不可逆性地分離核酸適配體，避免了Cy3-VEGF165核酸適配體的SEF效應(yīng)，使檢測(cè)VEGF165的靈敏度得到了極大提高。但是，由于信號(hào)-背景比率（signal-tobackground ratio）較低，又存在非特異性吸附及猝滅劑的干擾，“關(guān)閉”模式受到假陽(yáng)性結(jié)果的限制。相比之下，“打開”模式?jīng)]有背景信號(hào)的影響。

3 競(jìng)爭(zhēng)性替換模式

競(jìng)爭(zhēng)性替換模式（competitive replacement mode）是基于分析物（靶標(biāo)）與核酸適配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的原理，從而能夠獲得檢測(cè)信號(hào)。其特點(diǎn)是競(jìng)爭(zhēng)者可以是核酸適配體修飾的目標(biāo)分析物或與核酸適配體互補(bǔ)的DNA序列。

3.1 核酸適配體-目標(biāo)分析物作為競(jìng)爭(zhēng)者

在核酸適配體-目標(biāo)分析物作為競(jìng)爭(zhēng)者的模式下，首先制備目標(biāo)分析物，并與核酸適配體結(jié)合，然后，將基于該核酸適配體-目標(biāo)分析物的生物傳感器添加到分析物中。游離的分析物將從核酸適配體-目標(biāo)分析物中競(jìng)爭(zhēng)核酸適配體，從而引起檢測(cè)信號(hào)的變化。Jackson等[23]設(shè)計(jì)了一種基于FRET的魚腥藻毒素-a （anatoxin-a，ATX-A）傳感器。核酸適配體的末端修飾了猝滅劑，然后與實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備的ATX-A結(jié)合，并被固定在量子點(diǎn)表面。因此，量子點(diǎn)的熒光由于FRET作用被猝滅劑阻斷。當(dāng)暴露于游離的ATX-A時(shí)，核酸適配體被釋放，猝滅劑離開量子點(diǎn)表面，熒光恢復(fù)。檢測(cè)信號(hào)與被測(cè)樣品中的ATX-A濃度成正比。而Gao等[24]將生物膜干涉術(shù)（biolayer interferometry）與酶聯(lián)核酸適配體結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了快速、靈敏地檢測(cè)較低濃度的目標(biāo)分析物。在該實(shí)驗(yàn)中，樣品中游離的水螅毒素（palytoxin）競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合固定在生物傳感器上的核酸適配體。由于生物傳感器的光學(xué)厚度和質(zhì)量密度發(fā)生了較大變化，導(dǎo)致反射光的干涉譜發(fā)生變化，放大了檢測(cè)信號(hào)，使得檢測(cè)到的光學(xué)信號(hào)與樣品中游離PTX的濃度成反比。

3.2 核酸適配體的互補(bǔ)DNA序列作為競(jìng)爭(zhēng)者

在核酸適配體的互補(bǔ)DNA序列作為競(jìng)爭(zhēng)者的模式下，核酸適配體既可以與其互補(bǔ)的DNA序列結(jié)合，也可以與靶標(biāo)結(jié)合，它們之間存在競(jìng)爭(zhēng)。當(dāng)核酸適配體與靶點(diǎn)結(jié)合時(shí)，未結(jié)合的DNA序列會(huì)引起檢測(cè)信號(hào)的變化。Borghei等[25]基于比色分析法，將核酸適配體運(yùn)用于癌癥的早期檢測(cè)。他們將單鏈DNA探針功能化，使這2種探針在核酸適配體的2個(gè)特異位點(diǎn)上均有互補(bǔ)序列，然后與金納米粒子結(jié)合。當(dāng)靶細(xì)胞不存在時(shí)，金納米粒子通過(guò)核酸適配體與單鏈DNA探針雜交而聚集，導(dǎo)致其吸收光譜發(fā)生位移。引入靶細(xì)胞后，靶細(xì)胞與單鏈DNA探針競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合核酸適配體，導(dǎo)致樣品的顏色和吸收光譜發(fā)生變化。該設(shè)計(jì)策略的檢測(cè)限度為10個(gè)細(xì)胞，可推廣應(yīng)用于各種癌細(xì)胞的精準(zhǔn)檢測(cè)。

綜上所述，常開模式結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但由于該模式的信號(hào)恒定，清除未結(jié)合的核酸適配體探針需要較長(zhǎng)的時(shí)間，這不僅導(dǎo)致診斷時(shí)間較長(zhǎng)，而且高背景影響了圖像的對(duì)比度。此外，為了增加檢測(cè)的靈敏度，常開模式消耗了大量的核酸適配體探針，這將進(jìn)一步降低靶標(biāo)與背景之間的對(duì)比度。因此，用于檢測(cè)生物分子的理想設(shè)計(jì)，最好具有靶標(biāo)誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)改變的特性，即與靶標(biāo)成功地結(jié)合后，才能激活信號(hào)。相比之下，靶向誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)改變模式便具有更好檢測(cè)靈敏度。而競(jìng)爭(zhēng)性替換模式的檢測(cè)程序較復(fù)雜，但表現(xiàn)出高靈敏度和低檢出限度。因而，靶向誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)改變模式和競(jìng)爭(zhēng)性替換模式或是未來(lái)構(gòu)建核酸適配體檢測(cè)平臺(tái)的關(guān)注重點(diǎn)。