基于piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建長期表達(dá)人細(xì)胞因子的免疫缺陷小鼠模型

呂亞楠，范 偉，胡 正

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院/免疫學(xué)研究所，吉林 長春130021)

小鼠作為模式動(dòng)物常被用于研究哺乳動(dòng)物尤其是人類的體內(nèi)免疫系統(tǒng)應(yīng)答。然而物種之間的免疫系統(tǒng)存在差異[1]，致使從小鼠模型中得到的結(jié)論不能完全轉(zhuǎn)化給人類。因此，使用移植有人造血干細(xì)胞和(或)祖細(xì)胞的人源化小鼠成為一種研究人體免疫功能的更優(yōu)模型[2]。然而，在目前已有的人源化小鼠模型中，人單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)細(xì)胞的發(fā)育和功能存在很大程度上的缺陷[3-4]。細(xì)胞因子在造血細(xì)胞的發(fā)育、分化及功能的行使過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，例如，紅細(xì)胞的發(fā)育需要白細(xì)胞介素3(interleukin-3,IL-3)和紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)[5]，樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)的發(fā)育需要粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor， GM-CSF)和白細(xì)胞介素4(interleukin-4, IL-4)[6]，NK細(xì)胞的發(fā)育需要白細(xì)胞介素15(interleukin-15,IL-15)[7]。目前認(rèn)為人源化小鼠中人類固有免疫細(xì)胞的發(fā)育缺陷很可能是由于小鼠細(xì)胞因子與相對應(yīng)的人類細(xì)胞因子受體的反應(yīng)性有限，已報(bào)道小鼠的IL-15、GM-CSF、IL-6、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)和IL-3均未在人細(xì)胞上起作用[8]。目前已報(bào)道的解決該問題的策略主要是使用編碼人細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)基因小鼠，該方法會(huì)引起全身性的細(xì)胞因子高濃度導(dǎo)致造血干細(xì)胞的動(dòng)員和衰竭[9]；或施用外源性人類細(xì)胞因子，該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力[7]；或是通過高壓注射遞送編碼人類細(xì)胞因子的DNA載體，其缺點(diǎn)在于人類細(xì)胞因子的持續(xù)表達(dá)只能維持2～3周[10]。

piggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是在一種粉蝶中被發(fā)現(xiàn)的。PB轉(zhuǎn)座子需要相應(yīng)的轉(zhuǎn)座酶和酶的識別序列同時(shí)存在，其插入位點(diǎn)幾乎都在TTAA位點(diǎn)，而且可以攜帶多個(gè)基因使其在插入位點(diǎn)表達(dá)，轉(zhuǎn)座過程不留痕跡。2005年首次證實(shí)PB轉(zhuǎn)座子可以有效作用于小鼠基因轉(zhuǎn)移[11]。目前，PB已被用于人類細(xì)胞的基因組修飾[12]，包括哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因、誘變、臨床相關(guān)細(xì)胞類型的離體修飾以及體內(nèi)哺乳動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移[13]。 本研究首次將PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)用于優(yōu)化人源化小鼠模型，將人IL-6、IL-3、IL-15、干細(xì)胞生長因子(stem cell growth factor,SCF)和GM-CSF基因連接后整合到PB轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒中，并將其與表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒共同高壓注入NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ(NCG)小鼠，使其在肝臟發(fā)生整合并實(shí)現(xiàn)長期表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建含有人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF 5種細(xì)胞因子的表達(dá)質(zhì)粒，利用PB轉(zhuǎn)座子體系將目的基因整合到宿主小鼠細(xì)胞基因組中實(shí)現(xiàn)長期表達(dá)，以此優(yōu)化免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型，與目前已報(bào)道的方法比較，該方法靈活和簡單并且長效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 NCG 小鼠購自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，動(dòng)物許可證號：SCXK(蘇)2015-0001。人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF ELISA試劑盒購自美國R&D公司。流式細(xì)胞儀(FACS Fortessa)購自美國BD公司，HIMFD多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司。

1.2 含有人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF基因的PB轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒的構(gòu)建 化學(xué)合成人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF基因序列，每2個(gè)細(xì)胞因子之間用不同的蛋白接頭序列(Linker)連接，分別為T2A、F2A、P2A和E2A，最后一個(gè)基因末尾加入終止子，目的基因通過酶切位點(diǎn)5′NheⅠ和3′BamHⅠ克隆至載體PB轉(zhuǎn)座子，獲得目的質(zhì)粒(PB-5F)。同時(shí)構(gòu)建綠色熒光蛋白(GFP)基因作為目的基因的PB轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒(PB-GFP)，用于體外驗(yàn)證PB轉(zhuǎn)座子體系的長效性表達(dá)情況。上述基因的合成及質(zhì)粒的構(gòu)建由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。經(jīng)庫美生物科技有限公司測序驗(yàn)證插入序列準(zhǔn)確無誤。

1.3 PB-GFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 293T細(xì)胞分為陰性對照組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒)、陽性對照組(轉(zhuǎn)染pLVTHM質(zhì)粒)、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染PB-GFP質(zhì)粒)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組[共同轉(zhuǎn)染PB-GFP和轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒(super-PB)]。4組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第3天進(jìn)行傳代，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞中GFP表達(dá)水平，每3 d 1次，共10次，每組3個(gè)復(fù)孔。

1.4 轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞中GFP陽性(GFP+)細(xì)胞百分率 棄掉培養(yǎng)基，用無菌PBS洗2次，棄去液體。每孔加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化5 min。DMEM完全培養(yǎng)基終止消化后收集到15 mL離心管中，600 g、4℃離心5 min。PBS重懸沉淀。取5×105個(gè)細(xì)胞加入到流式細(xì)胞儀上樣管中，加入3 mL FACS液體，600 g、4℃離心5 min。棄凈上清，加入100 μL FACS液體，在樣品中加入適量的PI進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測及分析，計(jì)算GFP+細(xì)胞百分率。

1.5 NCG小鼠尾靜脈高壓注射質(zhì)粒實(shí)驗(yàn) NCG小鼠分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組, 每組4只。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組為小鼠尾靜脈高壓注射PB-5F質(zhì)粒(50 μg/只)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組為尾靜脈高壓注射PB-5F質(zhì)粒(50 μg/只)和super-PB質(zhì)粒(20 μg/只)。5 s內(nèi)注 射小鼠體質(zhì)量10%的液體量。

1.6 ELISA法檢測NCG小鼠血清中IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF水平 各組小鼠尾靜脈高壓注射后1、3、5和9 d，及隨后每周1次尾靜脈取血，離心分離血清，-80℃保存。ELISA法檢測NCG小鼠血清中IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF水平。實(shí)驗(yàn)步驟：將試劑盒提前30 min置于室溫，準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品和樣品；標(biāo)準(zhǔn)品等比稀釋；血清樣品在37℃水浴中溶化后，所有組的樣品按同一比例稀釋；上樣，每孔加入50 μL準(zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，封口后室溫孵育3 h；棄凈液體，用Wash buffer(1×)洗4次，300 μL/孔，每次1 min；棄凈液體，每孔加入200 μL結(jié)合液，封口后室溫孵育1 h；棄凈液體，用Wash buffer(1×)洗4次，每孔300 μL，每次1 min；棄凈液體，每孔加入200 μL底物，封口后避光室溫孵育30 min，顏色變藍(lán)；每孔加入50 μL終止液，混勻，顏色由藍(lán)變黃，終止顯色，在450 nm波長下測定吸光度(A)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠血清中IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF水平。

2 結(jié) 果

2.1 PB-5F質(zhì)粒構(gòu)建 將連接后的人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF基因序列片段克隆至PB轉(zhuǎn)座子載體上，陽性克隆經(jīng)NheI和BamHI雙酶切鑒定，可切出2 955 bp的目的片段和6 846 bp的載體片段。見圖1。

2.2 各組293T細(xì)胞中GFP+細(xì)胞百分率 PB-GFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞3 d后，陽性對照組、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組293T細(xì)胞中GFP+細(xì)胞百分率(33.70%±0.10%、32.57%±0.19%和32.83%±0.58%)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)染30 d后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組293T細(xì)胞中GFP+細(xì)胞百分率(4.61%±0.42%)明顯高于陽性對照組(0.58%±0.05%)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組(0.86%±0.10%)(P<0.01)。見圖2。

M: DL 15 000 DNA marker；Lane 1:PB-5F;Lane 2:PB-5F digested with restriction enzyme.
圖1 PB-5F酶切鑒定電泳圖
Fig.1 Electrophoregram of identification of PB-5F with enzyme digestion

2.3 各組NCG小鼠血清中IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF水平 質(zhì)粒高壓注射第5天，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組小鼠血清中IL-6、IL-3、IL-15和GM-CSF水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在小鼠血清中未檢測到SCF。見表1。質(zhì)粒高壓注射第30天，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組小鼠血清中IL-6、IL-15和GM-CSF水平分別為(1 906.89±564.26)、(239.92±44.65)和(840.67±267.12)ng·L-1，均高于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組[(509.22±34.72)、(125.15±15.77)和(162.69±37.34)ng·L-1](P=0.048，P=0.051，P=0.045)，而2組小鼠在第9天時(shí)血清中均未檢測出IL-3。質(zhì)粒高壓注射第60天，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組小鼠血清中仍能檢測出IL-6、IL-15和GM-CSF[495.02±233.34)、(90.26±25.20)和(162.34±115.87)ng·L-1]。

A-D:3 d; E-H:30 d; A,E:Negative control group; B,F:Positive control group; C,G:Transient transfection group; D,H:Stable transfection group.
圖2 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)各組293T細(xì)胞中GFP+細(xì)胞百分率
Fig.2 Percentages of GFP+cells in 293T cells in various groups at different time points after transfection after transfection

表1 質(zhì)粒注射第5天2組NCG小鼠血清中IL-6、IL-3、IL-15和GM-CSF水平Tab.1 Levels of IL-6, IL-3, IL-15, and GM-CSF in serum of NCG mice in two groups on 5 th day after plasmid injection

3 討 論

為了解決將動(dòng)物模型中的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的局限性，研究人員設(shè)計(jì)并開發(fā)了“人源化小鼠”模型，以在細(xì)胞和分子水平上模擬人類。近年來研發(fā)的具有人類免疫系統(tǒng)的人源化小鼠模型用于理解疾病的發(fā)病機(jī)制以及評估藥物對于人類疾病的治療，研究的疾病主要包括癌癥、傳染病、自身免疫疾病和移植物抗宿主病等[14]。

盡管免疫系統(tǒng)人源化小鼠發(fā)展多年且在多領(lǐng)域中有著重要貢獻(xiàn)，但該模型在許多方面存在缺陷，主要包括：在重建的免疫系統(tǒng)中缺乏人紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的重建[15]；人髓系細(xì)胞和NK細(xì)胞發(fā)育受損以及功能缺陷；B細(xì)胞發(fā)育不成熟，抗原特異性IgG產(chǎn)生過少等[16]。所有血細(xì)胞均由造血干細(xì)胞分化而來，細(xì)胞因子在分化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但由于人與小鼠之間的進(jìn)化分歧，很多細(xì)胞因子是物種特異性的，小鼠細(xì)胞因子無法作用于人的細(xì)胞而發(fā)揮功能[8]。為了克服細(xì)胞因子的障礙，目前可采用外源補(bǔ)充細(xì)胞因子重組蛋白、高壓注射表達(dá)細(xì)胞因子的DNA質(zhì)粒、感染誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)的慢病毒和敲入相關(guān)基因等方法，改善小鼠的體內(nèi)環(huán)境使其更適合人免疫系統(tǒng)的發(fā)育。

本課題組開發(fā)了一種簡單、靈活且長效的技術(shù)，該技術(shù)不需要復(fù)雜的程序，易于應(yīng)用到任何實(shí)驗(yàn)室。采用該方法處理，人IL-6、IL-15和GM-CSF表達(dá)可存在2個(gè)月以上。與敲入細(xì)胞因子的小鼠不同，高壓注射轉(zhuǎn)座子體系的方法能夠準(zhǔn)確控制細(xì)胞因子的誘導(dǎo)時(shí)間，從而準(zhǔn)確調(diào)控細(xì)胞的分化發(fā)育，并且可根據(jù)不同目的而靈活選擇細(xì)胞因子的種類。

目前敲入人IL-6基因的人源化小鼠模型表現(xiàn)出適應(yīng)性免疫功能明顯改善、T細(xì)胞和B細(xì)胞更好地植入及分化[17]。IL-6可以誘導(dǎo)CD4-CD8-胸腺細(xì)胞分化為CD4+CD8+和 CD4+CD8-細(xì)胞，成熟表型的B細(xì)胞隨著重建時(shí)間的延長而增加，24周后超過60%。與其他模型比較，表達(dá)人IL-6基因的人源化小鼠模型總IgG和抗原特異性IgG產(chǎn)生明顯增加，這種增加與IgG1記憶B細(xì)胞和漿母細(xì)胞的分化增強(qiáng)有關(guān)。因此，表達(dá)人IL-6基因的人源化小鼠模型改善了適應(yīng)性免疫細(xì)胞的發(fā)育和功能。

IL-15可以誘導(dǎo)重建的NK細(xì)胞表現(xiàn)出正常的表型和功能。誘導(dǎo)人NK細(xì)胞表達(dá)NK受體的3個(gè)主要家族包括NK細(xì)胞活化性受體(NKG2D)、NK細(xì)胞抑制性受體(NKG2A和KIR)及天然細(xì)胞毒性受體(NKp46)[10]。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的NK細(xì)胞能夠在體外和體內(nèi)裂解組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子(MHC Ⅰ)缺陷的靶細(xì)胞[18],并在聚肌胞苷酸(polyⅠ∶C)刺激時(shí)分泌干擾素γ(interferon-γ, IFN-γ)。此外，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的NK細(xì)胞能夠針對腺病毒感染產(chǎn)生強(qiáng)烈反應(yīng)，如IL-15和酪氨酸激酶3(Flt-3)/胎肝激酶2(Flk-2)配體處理的人源化小鼠發(fā)生廣泛的肝壞死和高水平的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)[19]。上述研究[10,18-19]表明:人IL-15誘導(dǎo)的NK細(xì)胞在表面表型和功能方面均正常。

人源化小鼠中GM-CSF和IL-4的表達(dá)可以刺激B細(xì)胞的成熟、CD5+B細(xì)胞的產(chǎn)生和CD209+DC的分化， 這些細(xì)胞因子處理的小鼠可以在免疫后產(chǎn)生明顯的抗原特異性IgG抗體應(yīng)答[20]。IL-3和GM-CSF的表達(dá)誘導(dǎo)功能性人肺泡巨噬細(xì)胞的發(fā)育[21]。

引起人類疾病的某些病原體具有種屬特異性[10]。 例如，登革熱病毒感染人DC和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，惡性瘧原蟲感染人紅細(xì)胞，Epstein Barr病毒感染人B細(xì)胞，人類免疫缺陷病毒-1感染人巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞。目前人源化小鼠對于上述感染的研究受到病原體靶細(xì)胞的缺失或者其存在的數(shù)量遠(yuǎn)低于人體組織的阻礙。本研究結(jié)果表明：通過高壓注射遞送表達(dá)細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，可以增強(qiáng)人源化小鼠中特定人血細(xì)胞譜系重建的能力，有助于使人源化小鼠成為針對病原體感染后的免疫應(yīng)答研究的更好模型。