高效液相色譜法測定白術須根中白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量

邵志愿，章 娟，吳德玲,2,3，黃 琪,2,3，張 偉,2,3，許鳳清,2,3，趙宏蘇,2,3

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；3.中藥飲片制造新技術安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

白術為菊科植物白術(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根莖，白術具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎等功效，臨床上主要用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸[1]、水腫、自汗、胎動不安[2]。白術作為大宗藥材，平均年需求量約為7 000噸。經(jīng)過產(chǎn)地調研發(fā)現(xiàn)，白術須根較發(fā)達，約占根莖總量的10%。按傳統(tǒng)加工方法，白術須根為非藥用部分需去除，造成了資源浪費，不利于中藥資源的可持續(xù)發(fā)展。現(xiàn)代藥理學研究表明，白術中有效活性成分主要是白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等[3]，白術內(nèi)酯Ⅰ具有較強的增強唾液淀粉酶活性、促進腸管吸收、調節(jié)腸道功能的作用，是白術健脾運脾有效成分[4-5]，白術內(nèi)酯Ⅰ也具有抗腫瘤作用[6]，白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅲ均具有抗炎活性[7]。本研究以白術須根為研究對象，采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)測定白術須根中白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量，為白術須根的后續(xù)研究及其綜合開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 日立天美PM1000液相色譜儀(高壓梯度泵、脫氣機、自動進樣器、柱溫箱)：日本；萊芙高速多功能高速粉碎機(LFP-800A型)：浙江省永康市紅太陽機電有限公司；MSA6型百萬分之一電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；高功率數(shù)控超聲清洗器(KQ-400KDE型)：江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；美國PALL進口濾膜(0.22 μmol/L)：天津市領航實驗設備股份有限公司。

1.2 試藥 白術內(nèi)酯Ⅰ對照品(批號73069-13-3，純度≥98%)、白術內(nèi)酯Ⅱ對照品(批號73069-14-4，純度≥98%)、白術內(nèi)酯Ⅲ對照品(批號73030-71-4，純度≥98%)：武漢天植生物科技有限公司；色譜甲醇、乙腈：美國Fisher公司；磷酸等均為分析純；水為娃哈哈飲用純凈水。

1.3 藥材 20批次白術須根采自北京同仁堂(亳州)飲片有限公司白術標準化種植基地，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學劉守金教授鑒定為菊科植物白術(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的須根。見表1。

2 方法

2.1 色譜條件 Agela Venusil XBP C18(L)色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇(A)-0.05%磷酸水(B)(70% A∶30% B)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅲ檢測波長：220 nm，白術內(nèi)酯Ⅱ檢測波長：276 nm；進樣容積：20 μL。對照品和樣品色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對照品適量，用色譜甲醇配制成濃度分別為140、140、164 μg/mL的白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合對照品儲備液，備用。

2.3 供試品溶液制備 取白術須根粉末(過3號篩)1 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲(功率250 W，頻率60 kHz)40 min，放冷，定容，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，過針筒狀微孔濾頭(0.22 μmol/L)，得供試品試液。

2.4 線性關系考察 取白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合對照品儲備液5 mL作為母液，并將母液配制成白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ濃度為70、35、17.5、8.75、4.375、2.187 5 μg/mL和白術內(nèi)酯Ⅲ濃度為82、41、20.5、10.25、5.125、2.562 5 μg/mL的混合對照品溶液。取上述白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合對照品溶液按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，進樣20 μL，每個濃度進樣2次，取平均值。以峰面積積分值(A)為縱坐標，白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ濃度(ρ)為橫坐標，分別繪制標準曲線，并計算線性方程，見表2。

表1 白術須根樣品信息表

注:1.白術內(nèi)酯Ⅲ;2.白術內(nèi)酯Ⅰ;3.白術內(nèi)酯Ⅱ圖1 白術須根樣品(A、B)、對照品(C、D)的HPLC色譜圖

表2 線性關系考察

2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液20 μL，分別連續(xù)進樣6次，按“2.1”項下色譜條件測定白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ峰面積，實驗結果顯示各對照品中白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的RSD分別為0.47%、0.15%、0.68%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、20、24 h進樣，進樣量20 μL，按“2.1”項下色譜條件測定白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ峰面積，實驗結果顯示各樣品中白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的RSD分別為2.22%、0.94%、1.37%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗 取同一批次的白術須根粉末6份，按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，進樣量20 μL，按“2.1”項下色譜條件測定白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量，實驗結果顯示各樣品中白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ平均含量分別為0.0348%、0.0485%、0.0843%，RSD分別為0.95%、1.17%、0.37%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱定樣品(X1)白術須根粉末6份，每份0.5 g，分別精密加入等量白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ標準品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行含量測定，結果見表3。

表3 白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ加樣回收率實驗

2.9 含量測定 白術須根供試品溶液按“2.4”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件進行測定，含量計算以干燥品計，見表4。

3 討論

本實驗首次采用HPLC法同時測定白術須根中白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量，為白術須根的資源利用開發(fā)和質量控制提供參考。本實驗研究方法簡單、準確、重復性好，可以快速測定白術須根中白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量，為白術須根的資源再利用和質量評價提供了實驗依據(jù)。

依據(jù)傳統(tǒng)用藥習慣，白術須根作為非藥用部位需去除，但前期實驗發(fā)現(xiàn)白術須根中含有豐富的揮發(fā)油，白術揮發(fā)油中60%左右的成分是蒼術酮[8]，而蒼術酮是白術的主要燥性成分[9]，因此推測白術須根應具有與白術藥材類似的功效，如燥濕利水、止汗。因此本研究以白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量測定為基礎，為探究白術須根的藥效物質基礎提供實驗依據(jù)，同時初步討論了白術須根再利用的可能性，對節(jié)約中藥材資源具有一定的意義。

表4 白術須根中白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量測定結果