自體脂肪基質(zhì)細(xì)胞組織-脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架對(duì)兔脛骨骨缺損修復(fù)作用*

楊鵬， 邵擎東**， 李宇飛， 嚴(yán)旭， 江峰， 呂峰霞， 韋蘇

(1.中國(guó)人民解放軍海軍特色醫(yī)學(xué)中心 骨科， 上海 200052； 2.中國(guó)人民解放軍海軍特色醫(yī)學(xué)中心 整形外科， 上海 200052)

骨缺損是骨科的常見疾病，目前骨缺損修復(fù)的治療方法有多種，其中骨組織工程移植修復(fù)是最新使用的修復(fù)方法，該方法是將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與骨架材料生物結(jié)合，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞，完成骨缺損的修復(fù)[1-2]。然而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有取材難、供量少、供區(qū)創(chuàng)傷大等缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)限制骨組織工程移植在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用[3]。脂肪組織是一種具有多向分化潛能的功能細(xì)胞組織，因?yàn)橹窘M織中含有的自體脂肪基質(zhì)細(xì)胞組織(SVF)[4-6]，其中含有脂肪基質(zhì)細(xì)胞(脂肪干細(xì)胞)，其功能和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似，可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等骨細(xì)胞，進(jìn)而通過分泌大量骨基質(zhì)因子、血管生長(zhǎng)因子、抗凋亡因子及其他細(xì)胞因子，促進(jìn)血管新生，吸引成骨前體細(xì)胞參與骨的形成，促進(jìn)骨缺損部位血供恢復(fù)，最終促進(jìn)骨缺損修復(fù)[7]。SVF還具有取材容易、供量豐富、供區(qū)創(chuàng)傷程度小等特點(diǎn)，推測(cè)可以將其作為骨組織工程中骨缺損移植修復(fù)治療過程中的種子細(xì)胞。目前關(guān)于SVF用于骨缺損修復(fù)的研究報(bào)道較少，本研究以形狀結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的脛骨作為骨缺損部位，復(fù)制兔脛骨骨缺損動(dòng)物模型，以骨科研究應(yīng)用較多的脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖為材料制作缺損脛骨支架、將SVF種植于脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架上、對(duì)缺損的兔脛骨進(jìn)行修復(fù)，同時(shí)觀察骨缺損部位骨膜中的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)水平，為SVF應(yīng)用于骨組織工程修復(fù)骨缺損提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇21只健康的新西蘭大白兔，兔齡為4個(gè)月，雌雄不限，體質(zhì)量為2.0～2.5 kg，平均(2.17±0.61)kg，購買自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK(滬) 2017-0005]。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)取1只用于SVF和脫細(xì)胞骨基質(zhì)制備，剩余20只兔隨機(jī)分為研究組和對(duì)照組，每組10只。

1.1.2主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、胰蛋白酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)一抗、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)一抗(均購自美國(guó)Sigma公司)，地塞米松、抗壞血酸、吲哚美辛、甲基黃嘌呤、牛胰島素(均購自上海晶抗生物工程有限公司)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)(上海衡翼精密儀器有限公司)，低溫低速離心機(jī)、石蠟切片機(jī)(德國(guó)Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1SVF的制備 隨機(jī)取新西蘭大白兔1只，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉，在兔的背部取10.0 g皮下脂肪，清除脂肪組織中的血管、結(jié)蹄組織后剪碎，于37 ℃、1 g/L的Ⅰ型膠原酶溶液中振蕩60 min，待塊狀脂肪消化成液態(tài)，加入含有胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，200目濾網(wǎng)過濾，1 600 r/min離心5 min，PBS重懸；洗滌，離心棄去上清液，沉淀在紅細(xì)胞裂解中振蕩，離心棄去上清液；PBS清洗沉淀，加入2倍體積的且含有胎牛血清的培養(yǎng)液，混勻；取細(xì)胞液0.2 mL，行苔盼藍(lán)染色，接種至培養(yǎng)瓶中，接種密度為1.5×104/cm2；常規(guī)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，3 d更換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞融合超過90%時(shí)進(jìn)行消化傳代。

1.2.2脫細(xì)胞骨基質(zhì)制備 將1.2.1項(xiàng)下兔的股骨干解剖下來，清除脂肪、血管、結(jié)蹄組織后將股骨碎裂為1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm規(guī)格的碎骨，無菌去離子水高壓沖洗碎骨。在甲醇和氯仿混合溶液(1 ∶1)中浸泡24 h，脫去骨碎塊中的脂肪；將骨碎塊在濃度為30%的過氧化氫溶液中浸泡48 h，脫去骨碎塊中的蛋白質(zhì)；將骨碎塊在濃度為6.0 mol/L的鹽酸溶液中浸泡5 min，脫去骨碎塊中的鈣質(zhì)。上述步驟完成后用無菌去離子水沖洗，冷凍干燥機(jī)中干燥48 h，將骨碎塊無菌粉碎，過鋼篩，選取10～50 μm的骨碎塊作為脫細(xì)胞骨基質(zhì)。制備的脫細(xì)胞骨基質(zhì)在-40 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3SVF-脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架制備 將脫細(xì)胞骨基質(zhì)和5%殼聚糖溶液按照10 ∶1的比例混合，倒入脛骨磨具中，在-40 ℃下先冷凍2 h，然后在冷凍干燥機(jī)中干燥48 h，干燥好的脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架在紫外線下照射8 h，在50 mmol/L碳化二亞胺和N羥基琥珀酰亞胺溶液中交聯(lián)24 h，無菌去離子水清洗，冷凍干燥機(jī)中干燥，鈷60照射滅菌，制備好的脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架在-4 ℃條件下保存?zhèn)溆?。取支架照射滅菌，完全培養(yǎng)液預(yù)濕處理，置入6孔板后，種植SVF細(xì)胞(種植密度為3×107個(gè)/cm2)于支架上，37.0 ℃、5.0% CO2條件下培養(yǎng)1.2 h后轉(zhuǎn)移至含10.0%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在6孔板中培養(yǎng)72 h，在-40.0 ℃環(huán)境中冷凍干燥，干燥后的支架復(fù)合物保存于-40.0 ℃冰箱中備用。

1.2.4兔脛骨缺損模型復(fù)制及骨缺損修復(fù) 將研究組和對(duì)照組新西蘭大白兔耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉，備皮，在兔一側(cè)脛骨的中遠(yuǎn)處用消毒的電鉆在暴露的脛骨平臺(tái)位置鉆一個(gè)9 mm×5 mm的孔洞，復(fù)制脛骨缺損動(dòng)物模型。脛骨缺損模型復(fù)制完成后，研究組用制備好的SVF-脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架進(jìn)行修復(fù)，對(duì)照組用脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架修復(fù)，縫合傷口，消毒，肌肉注射青霉素預(yù)防感染。

1.3 觀察指標(biāo)

取新西蘭兔背部皮下脂肪制備獲取SVF細(xì)胞、取股骨干制備獲取脫細(xì)胞骨基質(zhì)，將SVF細(xì)胞種植于脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架上，于種植當(dāng)日及種植第7天時(shí)，掃描電鏡觀察支架上SVF細(xì)胞生長(zhǎng)情況，計(jì)算種植當(dāng)日及種植第3天時(shí)的SVF細(xì)胞存活率；將20只兔脛骨缺損動(dòng)物模型均分為研究組和對(duì)照組，研究組用SVF-脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架修復(fù)，對(duì)照組用脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架修復(fù)；于術(shù)后第6及12周時(shí)，檢測(cè)2組脛骨缺損部位的骨密度、并進(jìn)行X線拍照，于術(shù)后第12周時(shí)檢測(cè)2組骨缺損部位最大彎曲度負(fù)荷、抗彎鋼度及破壞擾度的力學(xué)特征，以內(nèi)參照蛋白β-actin作為內(nèi)對(duì)照，參考文獻(xiàn)[7]檢測(cè)并計(jì)算缺損骨骨膜中VEGF和EGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SVF-脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架的電鏡掃描結(jié)果

電鏡掃描顯示， 脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架材料呈現(xiàn)為疏松樣多孔結(jié)構(gòu)，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入和各種細(xì)胞黏附，將SVF細(xì)胞接種于脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架第7天時(shí)，支架上黏附大量的SVF細(xì)胞，并且SVF細(xì)胞在支架表面上生長(zhǎng)、增殖。見圖1。

2.2 SVF-脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架中SVF細(xì)胞存活率

SVF種植當(dāng)日的SVF細(xì)胞存活率為100.0%，種植第3天時(shí)，SVF細(xì)胞的存活率為(98.54±1.83)%，2者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 術(shù)后脛骨缺損部位大體觀察及X片結(jié)果

大體觀可見研究組大白兔修復(fù)后第12周時(shí)見骨缺損區(qū)有血管孔生成，已經(jīng)骨性愈合；對(duì)照組大白兔雖見骨缺損區(qū)有血管孔生成，但生成的血管孔數(shù)量少于研究組，骨缺損部位仍未完全骨性愈合。 脛骨缺損修復(fù)術(shù)后第6周及12周時(shí)，分別用X線進(jìn)行拍攝缺損部位，結(jié)果顯示研究組術(shù)后第6周時(shí)的骨缺損支架材料和周圍骨組織之間的界限開始變的模糊，周圍骨組織有骨茄形成，術(shù)后第12周時(shí)骨缺損處骨密度較第6周時(shí)顯著增加，骨缺損的范圍進(jìn)一步縮小，凹面和周圍骨床保持在同一平面上；對(duì)照組術(shù)后第6周及12周時(shí)骨缺損也有改善，但每個(gè)時(shí)間點(diǎn)骨缺損的改善程度均弱于研究組。見圖2。

注：A為脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架，B為SVF細(xì)胞種植在脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架(箭頭所示支架上黏附大量的SVF細(xì)胞，并且SVF細(xì)胞在支架表面上生長(zhǎng)、增殖)。圖1 SVF-脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架電鏡掃描結(jié)果Fig.1 SVF-acellular bone matrix-chitosan scaffold by Electron Scanning microscopy

注：A、B為對(duì)照組，C、D為研究組，A、C為修復(fù)術(shù)后第6周，B、D為修復(fù)術(shù)后第12周。圖2 兩組脛骨缺損修復(fù)后第6周及12周時(shí)的X片結(jié)果Fig.2 Tibial defect repair in both groups at 6th and 12th weeks by X-ray

2.4 術(shù)后脛骨缺損部位骨密度

結(jié)果顯示，2組大白兔術(shù)后第12周骨缺損部位的骨密度均顯著性高于術(shù)后第6周，研究組術(shù)后第6周及12周的骨缺損部位的骨密度均顯著性高于同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 術(shù)后第6周及12周時(shí)2組脛骨缺損部位骨密度比較Tab.1 Comparison of bone mineral density in tibial defects in both groups at 6th and 12th

注：(1)與同組術(shù)后第6周比較，P<0.05；(2)與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05。

2.5 術(shù)后脛骨缺損部位的生物力學(xué)指標(biāo)

結(jié)果顯示，術(shù)后第12周時(shí)，研究組最大彎曲度負(fù)荷和抗彎鋼度顯著大于對(duì)照組，破壞擾度顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 術(shù)后第12周時(shí)2組脛骨缺損部位的生物力學(xué)指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of biomechanical indexes of tibial defects at 6th and 12th

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.6 術(shù)后脛骨缺損部位骨膜的VEGF和EGF蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，術(shù)后第12周時(shí)，研究組脛骨缺損修復(fù)后骨缺損部位骨膜中的VEGF及EGF蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，P<0.05。見圖3和表3。

圖3 術(shù)后第12周時(shí)2組新西蘭兔脛骨缺損部位骨膜的VEGF和EGF蛋白表達(dá)Fig.3 Expression levels of VEGF and EGF in periosteum of tibia defect in New Zealand rabbits at 6th and 12th weeks

表3 術(shù)后第12周時(shí)2組脛骨缺損部位骨膜的VEGF和EGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of VEGF and EGF in tibia defect in New Zealand rabbits

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05。

3 討論

骨缺損是骨科的常見疾病，如缺損骨得不到有效修復(fù)，輕者嚴(yán)重降低患者脛骨功能，重者將面臨截肢。目前用于骨缺損修復(fù)的方法有多種，傳統(tǒng)的修復(fù)方法有自體骨移植、異體骨移植、假體材料填充等，雖然上述方法的修復(fù)效果有效，但上述修復(fù)方法中所用到的修復(fù)材料沒有細(xì)胞活性，將修復(fù)材料移植至骨缺損部位后，需要自身的成骨細(xì)胞緩慢的向骨缺損部位和修復(fù)材料上轉(zhuǎn)化為新生骨[8-10]。上述骨缺損修復(fù)方法對(duì)于骨缺損小的情況，修復(fù)效果尚可以達(dá)到預(yù)期，但對(duì)于骨缺損大的情況，則很難收到預(yù)期的修復(fù)效果。近年來骨組織工程技術(shù)得到快速的發(fā)展。使用含有活細(xì)胞修復(fù)材料修復(fù)骨缺損的技術(shù)已經(jīng)用于多種骨缺損的修復(fù)治療，且修復(fù)效果十分理想[11-12]。利用骨組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是將具有分化為成骨細(xì)胞的干細(xì)胞接種至修復(fù)支架材料上，當(dāng)修復(fù)支架材料移植至骨缺損部位后，修復(fù)支架材料上的干細(xì)胞可以快速的增殖分化為成骨細(xì)胞，修復(fù)速度和效果好于傳統(tǒng)的修復(fù)方法[13-14]。目前接種至修復(fù)支架材料上的干細(xì)胞主要是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，然而這種來源的干細(xì)胞具有取材難、供量少、供區(qū)創(chuàng)傷大等缺點(diǎn)，限制了骨組織工程技術(shù)在修復(fù)骨缺損的應(yīng)用。

脂肪組織是一種具有多向分化潛能的功能細(xì)胞組織，脂肪組織的這種功能主要是因?yàn)橹窘M織中含有SVF[15-16]。SVF具有很好的體外擴(kuò)增和多克隆的能力，可以誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞[17-18]。SVF的這一特性，使其具有干細(xì)胞的功能，推測(cè)其可以作為接種值修復(fù)支架材料上的細(xì)胞。另外SVF具有取材容易、供量豐富、供區(qū)創(chuàng)傷程度小等優(yōu)點(diǎn)?？梢蕴娲撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞，可作為骨組織工程中骨缺損移植修復(fù)治療過程中的種子細(xì)胞。在本研究中將從兔脂肪組織中制備而來的SVF接種至脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架上，種植第7天時(shí)支架上黏附大量的SVF細(xì)胞，并且SVF細(xì)胞在支架表面上生長(zhǎng)、增殖。說明SVF在脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架材料上具有良好的生物相容性，脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架具備的骨缺損修復(fù)材料的基礎(chǔ)和特性。SVF-脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架移植至兔脛骨缺損部位，術(shù)后骨缺損的支架材料和周圍骨組織之間的界限開始變的模糊，周圍骨組織有骨茄形成，骨缺損的范圍進(jìn)一步縮小，骨缺損部位的骨密度逐漸升高，生物力學(xué)檢測(cè)指標(biāo)逐漸改善，隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，骨缺損修復(fù)的效果越來越好。說明使用應(yīng)用SVF-脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架修復(fù)兔脛骨缺損收到良好的修復(fù)效果。

骨膜在骨缺損修復(fù)的過程中起到重要作用，骨膜內(nèi)含有豐富的血管，這些血管為骨的增生提供氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使骨膜中的成骨細(xì)胞具有造骨細(xì)胞的功能[19-21]。VEGF和EGF是2種重要的具有促進(jìn)血管新生的因子，參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分化以及新生血管的形成，機(jī)體中2者水平的高低與新生血管的生成速度呈正相關(guān)[22-23]。有研究表明SVF細(xì)胞具有促進(jìn)血管新生的作用[24-25]。本研究檢測(cè)了2組大白兔術(shù)后第12周時(shí)骨缺損部位的新生骨膜中的VEGF和EGF蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示使用SVF-脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖之間修復(fù)的研究組新生骨膜中的VEGF和EGF蛋白表達(dá)水平顯著高于僅使用脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架修復(fù)的對(duì)照組，說明SVF-脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架修復(fù)兔脛骨缺損時(shí)促進(jìn)骨膜中的血管新生，為骨缺損的修復(fù)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

綜上所述，使用SVF-脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架修復(fù)兔脛骨骨缺損可以收到顯著的效果，SVF不但可以分化為成骨細(xì)胞而且還可以促進(jìn)骨膜內(nèi)的血管新生。