花生營養(yǎng)油對中老年SD大鼠大腦皮層單胺氧化酶活性及肝臟細胞的影響研究

趙康宇，曹 健，田 華，張立偉，鄭竟成，羅 質(zhì)，何東平

（1.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.大宗糧油精深加工教育部重點實驗室（武漢輕工大學(xué)），湖北 武漢 430023）

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA，C22∶6n-3），屬于ω-3不飽和脂肪酸，花生四烯酸（arachidonic acid，AA，C20：4 n-6），屬于 ω-6不飽和脂肪酸，這兩種脂肪酸是人腦中主要的長鏈多不飽和脂肪酸（Long-chain polyunsaturated fatty acids，LCPUFA），是人體大腦和視神經(jīng)發(fā)育的重要物質(zhì)，對提高智力和增強視敏度具有重要作用[1-3]。DHA是神經(jīng)系統(tǒng)細胞生長及維持的一種主要脂肪酸，約占人腦總脂的10%，是大腦和視網(wǎng)膜的重要構(gòu)成成分，促進大腦細胞發(fā)育生長，并延緩腦細胞的衰老和凋亡，有利于嬰幼兒提高記憶及學(xué)習(xí)能力，同時也能減少中老年期癡呆癥、腦癱、中風(fēng)等疾病的發(fā)生[4-6]。AA是合成前列腺素 E2、前列腺環(huán)素、血栓烷素 A2和白細胞三烯直接前體，這些生物活性物質(zhì)對人體心血管系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)具有十分重要的作用，具有抗炎、抗癌、酯化膽固醇，增加血管彈性、降低血液粘度，調(diào)節(jié)血細胞功能等一系列生理活性[7-10]。DHA藻油是以裂壺藻（schizochytriumsp.）或者吾肯氏壺藻（ulkeniaamoeboida）或者寇氏隱甲藻（crypthecodiniumcohnii）等藻種為原料經(jīng)生物發(fā)酵、提取、精煉等工藝制取的一種可供食用富含DHA的油脂[11-12]?；ㄉ南┧嵊褪且愿呱奖绘呙梗╩ortierellaalpina）或者缺刻葉球藻(lobosphaeraincisaReisigl)等藻種為原料經(jīng)生物發(fā)酵、提取、精煉等工藝制取的一種可供食用富含AA的油脂[13-15]。目前DHA藻油和AA油脂主要以微膠囊粉劑添加在嬰幼兒奶粉等產(chǎn)品中，如果將直接添加到大眾食用植物油中，不僅簡化了AA油脂的加工工藝過程，節(jié)約生產(chǎn)成本，而且為普通大眾及嬰幼兒補充DHA及AA提供了一條極為便利的途徑[16-17]。

單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）為催化單胺氧化脫氨反應(yīng)的酶，也稱為含黃素胺氧化酶，主要分布于人體內(nèi)的肝、腎、腦組織中，組織中的 MAO主要存在于線粒體上和膜緊密結(jié)合，以脂肪醇氧化酶（fatty-alcohol oxidase，F(xiàn)AO）為輔酶參與兒茶酚胺的分解代謝[18-19]。實驗的花生營養(yǎng)油是在前期研究基礎(chǔ)上以濃香花生油為基油，添加其他植物油以及AA油脂，按營養(yǎng)成分的科學(xué)配比調(diào)制而成。以中老年 SD大鼠為實驗對象，考察含DHA藻油和AA油脂的花生營養(yǎng)油對 SD大鼠大腦皮層單胺氧化酶活性及肝臟細胞的影響，初步探究花生營養(yǎng)油的生理活性，為含 DHA藻油和 AA油脂的植物營養(yǎng)油開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

18月齡中老年SD大鼠雌雄各半：購于湖北省試驗動物研究中心；含DHA藻油和AA油脂花生營養(yǎng)油：由油谷生物科技南京有限公司提供；大鼠單胺氧化酶ELISA試劑盒、蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒：購于上海邦奕生物科技有限公司；其它化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

352型酶標(biāo)儀：芬蘭LabsystemsMultiskan MS公司；AC8洗板機：芬蘭Thermo Labsystems公司；TG16W微量高速離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司；L5S紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；CX40型生物顯微鏡：寧波舜宇儀器有限公司；Agilent 7890A氣相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組與飼喂

將18月齡中老年SD大鼠隨機分為5組，每組7只。CK1為陰性對照組（飼喂普通花生調(diào)和油）、CK2為陽性對照組[DHA藻油和AA油脂混合油（DHA∶AA=1∶0.83）]、以 200、320、640 mg DHA和170、270、530 mgAA分別調(diào)配后添加至60 g花生調(diào)和油中，作為DHA及AA低、中、高劑量調(diào)配油的處理組。從飼喂第一天起，全部 SD大鼠在相同的自然條件下，定時定量進食，自由飲水，保證自然光照，良好通風(fēng)，以及一定室溫，飼養(yǎng)1周以使SD大鼠適應(yīng)實驗環(huán)境。待大鼠生長活動正常后，每日上午通過灌胃飼喂，飼喂劑量均為1 mL調(diào)配油/100 g體重·d，其余時間自由飲水，持續(xù)飼喂8周。

1.3.2 處置方法

SD大鼠飼喂 8周后，采取注射麻醉法，在SD大鼠腹腔注射10%（V/V）水合氯醛對大鼠進行麻醉后迅速將腦組織及肝臟組織剝離，于-20 ℃凍存，用于后續(xù)大鼠腦組織及肝臟組織有關(guān)成分的檢測。

1.3.3 MAO活性測定

采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法（ELISA）測定[20]。將MAO標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到不同濃度,分別為180、120、60、30、15 U/L，稀釋后各孔加樣量都為50 μL。分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40 μL，然后再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。用封板膜封板后，于 37 ℃條件下，溫育30 min。揭掉封板膜，倒盡板孔中液體，加滿洗滌液重復(fù)洗滌5次后，用吹風(fēng)機吹干。每孔加入酶標(biāo)試劑 50 μL，重復(fù)溫育、洗滌。加顯色劑37 ℃避光顯色15 min，再加終止液50 μL，終止反應(yīng)。以空白空調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。以MAO標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，OD值為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的OD值代入計算出樣品濃度。

1.3.4 肝臟細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀測

按照蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒內(nèi)附的說明書進行操作。

1.3.5 花生營養(yǎng)油脂肪酸組成成分分析

色譜柱：Agilent 19091F-433（30 m×250 μm×0.25 μm）；升溫程序：開始時為140 ℃，以2 ℃/min，22.5 min升至185 ℃，保留5 min，以4 ℃/min，10 min升至 225 ℃，保留 3 min；載氣（N2）壓力：6.1 psi；氫氣流速：30 mL /min，空氣流速：300 mL/min；分流比：30∶1。脂肪酸百分含量用面積歸一法確定（以峰面積百分比表示）。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS11.0軟件進行分析，采用單因素方差t檢驗進行組間比較，P＜0.05表示在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 中老年SD大鼠大腦皮層MAO活性檢測

各實驗組SD大鼠大腦MAO活性數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 各實驗組SD大鼠大腦皮層單胺氧化酶酶活力原始記錄數(shù)據(jù)

各實驗組SD大鼠大腦皮層MAO酶活水平比較如表2所示。由表2可知，當(dāng)向小鼠飼喂含DHA藻油和AA油脂混合油8周時，陽性對照組CK2的SD大鼠大腦皮層中的MAO活性相比于陰性對照組顯著降低，當(dāng)向小鼠飼喂含DHA、AA調(diào)配花生油8周時，低、中、高劑量調(diào)配花生油組SD大鼠大腦皮層中的 MAO活性與陽性對照組和陰性對照組相比，MAO活性均顯著降低。臨床上判斷肝纖維化的程度，診斷肝硬化的重要指標(biāo)之一就是MAO活性的高低，MAO活性增高，說明可能患有肝硬化和肝纖維化等疾病[21-22]。在攝入DHA和AA后，中老年大鼠大腦皮層中的MAO活性明顯降低，表明DHA和AA的攝入有助于防止肝硬化和肝纖維化等疾病的發(fā)生。總的來說，機體肝硬化等疾病的重要指標(biāo)之一為 MAO的活性高低的體現(xiàn)，隨著機體DHA、AA攝入量的升高，MAO活性顯著下降，說明該花生營養(yǎng)油能顯著降低中老年SD大鼠體內(nèi)MAO活性量，從而降低患肝硬化等疾病的風(fēng)險。

表2 各組大鼠大腦皮層單胺氧化酶（MAO）酶活水平的比較（）

表2 各組大鼠大腦皮層單胺氧化酶（MAO）酶活水平的比較（）

注：#代表與空白組比較具有顯著性差異（P＜0.01）；*代表與陽性藥物組比較具有顯著性差異（P＜0.01）。

組別 動物例數(shù)（n）/只MAO/（U/mg）陰性對照組CK1 7 540.00±67.12陽性對照組CK2 7 171.33±19.69#低劑量DHA、AA調(diào)配花生油組 7 405.92±40.19#*中劑量DHA、AA調(diào)配花生油組 7 319.74±19.00#*高劑量DHA、AA調(diào)配花生油組 7 248.59±40.16#*

2.2 中老年SD大鼠肝臟細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀測結(jié)果

各組大鼠肝臟組織細胞切片如圖1所示。圖1中肝臟組織細胞的細胞核被蘇木精染成鮮明的藍色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍色，粘液呈灰藍色。細胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈反光強的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色，紅血球呈橘紅色，蛋白性液體呈粉紅色。

從圖 1可以看出：陰性對照組中肝臟匯管區(qū)膽管及小葉間靜脈擴張，纖維間質(zhì)增生，伴有炎性細胞浸潤。匯管區(qū)周圍肝細胞水腫，空泡變性。陽性對照組為較正常肝小葉。處理1組中肝細胞廣泛水腫，空泡變性伴氣球樣變，可見肝細胞核固縮，凋亡壞死。處理2組中肝細胞排列較密集，部分區(qū)域可見肝細胞水腫，胞漿空泡樣改變。處理3組中肝細胞索排列稍紊亂，局部可見肝竇擴張淤血，肝細胞形態(tài)較正常。通過對中老年 SD大鼠肝臟的切片染色觀察結(jié)果可知，灌喂花生營養(yǎng)油能有效改善中老年 SD大鼠的肝臟水腫及細胞炎癥等癥狀，減緩細胞衰亡的速度，從而達到保護肝臟的作用。且DHA與AA含量越高，對肝臟的保護效果越明顯。

圖1 不同組中老年SD大鼠肝臟組織細胞切片圖（200X）

2.3 花生營養(yǎng)油脂肪酸組成成分分析

花生營養(yǎng)油主要脂肪酸組成成分分析結(jié)果見表3。

由中老年SD大鼠大腦皮層MAO活性及肝臟細胞切片觀測結(jié)果可知，飼喂高劑量 DHA、AA調(diào)配油組的 MAO活性最低，且肝細胞形態(tài)較正常。所以，采用高劑量組調(diào)配油中的比例，對花生營養(yǎng)油進行脂肪酸組成分析。從表3中可知，其ω6/ω3≈4.1，符合《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》中建議的推薦值。這種油品不但具有花生油風(fēng)味，而且具有更好的營養(yǎng)生理功能。同時，可使ω-3系多不飽和脂肪酸在總脂肪酸中所占比例增加，完善膳食中各類脂肪酸比例構(gòu)成，使人體攝入營養(yǎng)更加均衡。

表3 花生營養(yǎng)油脂肪酸組成

3 結(jié)論

中老年 SD大鼠飼喂花生營養(yǎng)油，可顯著降低SD大鼠中老年鼠大腦皮層中的MAO活性，且其活性與花生營養(yǎng)油中所含的DHA和AA含量呈正相關(guān)，在一定程度上能降低老年人肝硬化和肝纖維化等疾病的風(fēng)險。根據(jù)對中老年 SD大鼠的肝臟組織切片染色觀察結(jié)果可知，飼喂花生營養(yǎng)油可以有效改善中老年 SD大鼠的肝臟水腫及細胞炎癥等炎癥，減緩細胞衰亡的速度，從而達到保護肝臟的作用。

因此，在食用油中添加適量的DHA和AA，有利于增強大鼠肝臟抗肝硬化的能力以及抑制肝組織的過氧化程度。