含有白細胞的富血小板纖維蛋白的生物學(xué)特性及臨床應(yīng)用

孫慧穎，朱崇元，馮國棟，高志強*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 耳鼻咽喉科， 北京 100730；2.濰坊醫(yī)學(xué)院 耳鼻咽喉科, 山東 濰坊 261053)

血液制品于40年前開始用在促進組織修復(fù)及愈合的臨床治療上，當時主要以纖維蛋白制成的凝膠為主[1]。以后又出現(xiàn)了富含血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)的制備和應(yīng)用[2]。以此為契機，一系列富血小板的自體血液制品誕生并逐漸廣泛應(yīng)用于臨床，但這些血液制品存在著制備過程復(fù)雜、造價較高、制備時需添加外源性物質(zhì)以致排異風(fēng)險高等問題。隨后， 在PRP基礎(chǔ)上， 利用自體靜脈血制

備了含有白細胞的富血小板纖維蛋白(leucocyte-and platelet-rich fibrin，L-PRF)[3]，這種L-PRF較PRP的優(yōu)勢如下：1)生物學(xué)效應(yīng)更高：①L-PRF中存在的白細胞及細胞因子可起到抗感染及免疫調(diào)節(jié)的作用，而PRP不含白細胞；②L-PRF的纖維蛋白網(wǎng)更加致密而堅固，更利于長期發(fā)揮作用；2)制備更簡單；3)不含外源性添加物，安全性更高[4-5]。目前L-PRF在口腔科、整形外科及骨科的臨床工作中應(yīng)用廣泛?；贚-PRF具有促進骨組織修復(fù)的作用，本研究利用L-PRF聯(lián)合自體骨粉在耳科手術(shù)中修復(fù)骨性結(jié)構(gòu)方面做了初步嘗試，收效良好。本文總結(jié)了L-PRF的生物學(xué)特點及臨床應(yīng)用現(xiàn)狀，探討其應(yīng)用于耳外科手術(shù)重建骨性結(jié)構(gòu)及促進軟組織修復(fù)的可能性。

1 L-PRF的生物學(xué)特點及其主要衍生物

第二代富血小板的血液制品L-PRF相比于第一代富血小板的血液制品PRP主要不同點在于纖維蛋白構(gòu)架以及所含細胞成分比例上。這兩點要素決定了血液制品最終的性狀，從而限定了其臨床應(yīng)用的范圍。

1.1 L-PRF特殊的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

L-PRF及PRP均具有三維的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，纖維蛋白網(wǎng)的作用在于：1)網(wǎng)絡(luò)住血小板或白細胞，使得其能集中、緩慢地在局部釋放生長因子及細胞因子；2)有趨化作用：可募集血液及組織中的多種細胞(如成纖維細胞、成骨細胞、脂肪前體細胞等)向其遷移，因可提供支架有利于細胞附著、增殖和分化，在自體血細胞成分釋放完之后，仍有外界細胞成分參與并發(fā)揮作用，延長了生物學(xué)效應(yīng)的時間[6]。

L-PRF的纖維蛋白網(wǎng)較PRP的更加規(guī)則、致密，穩(wěn)固而不被輕易水解，這使得血小板及白細胞不易擴散到周圍組織中，可以在原處緩慢地發(fā)揮作用，也更利于募集到的組織細胞附著，作用時間更長。纖維蛋白網(wǎng)的結(jié)構(gòu)取決于凝血酶的含量、制備時的離心速度及纖維蛋白原的含量，具體如下：1)纖維蛋白原在凝血酶的作用下脫去血纖維蛋白肽A和B，彼此連接形成纖維蛋白，纖維蛋白再編織成復(fù)雜的纖維蛋白網(wǎng)。低濃度的凝血酶使得纖維蛋白原去蛋白肽的速度慢，可配合原纖維橫向及縱向增長的速度，最終形成粗壯的纖維網(wǎng)；而高濃度的凝血酶使得纖維蛋白原快速地脫去蛋白肽，在未能加入形成原纖維前，形成許多短小的低聚物而被浪費，因此最終的纖維蛋白網(wǎng)的纖維束較細且連接不穩(wěn)定，更容易被水解。在此過程中，鈣離子對凝血酶起到催化作用。PRP的制作中需要添加凝血酶及鈣離子等促凝劑，因此其形成的纖維網(wǎng)不如L-PRF的規(guī)則、粗壯及穩(wěn)定[1]。2)離心速度越快則纖維蛋白越粗壯、網(wǎng)格越致密有序，最終形成的富血小板纖維蛋白體積越大，其內(nèi)的細胞含量越高；此外，離心機的固有參數(shù)(如徑向振動、共振頻率)亦對纖維蛋白網(wǎng)的形成、尤其細胞的數(shù)量有影響[7-9]。L-PRF的制備中需要經(jīng)過1次離心，而PRP在制備中須經(jīng)歷較L-PRF更低速的2次離心,由此PRP的蛋白網(wǎng)更加松散。3)PRP在第1次離心中棄掉上層血漿中未聚合的纖維蛋白原，導(dǎo)致第2次進行離心時可利用的原材料更少，亦影響了PRP的結(jié)構(gòu)及產(chǎn)量[1]。

綜上所述，PRP制備中棄去了一些纖維蛋白原，又由于制備過程中添加的外源性凝血酶及鈣離子的作用，纖維蛋白的聚合速度超過生理狀態(tài)，PRP在相對低速的梯度離心后，最終形成的纖維網(wǎng)絡(luò)僵硬而缺乏彈性，含有很多較細的小纖維，易被分解吸收，PRP中的生長因子在10 min內(nèi)會釋放70%，1 h內(nèi)即幾乎全部釋放，作用時間較短，半衰期5～7 d[10]。而L-PRF無外源性凝血酶等添加劑，棄去的纖維蛋白原相對較少，在相對高速的離心下其形成的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)更加致密、穩(wěn)固，不易被水解，從而生長因子得以緩慢釋放并發(fā)揮生物學(xué)作用，可持續(xù)7～14 d[11-12]。

1.2 L-PRF的生長因子及細胞因子

L-PRF富含全血中約97%的血小板和50%以上的白細胞，包含許多種細胞因子及生長因子，主要包括轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)等[6]。TGF-β1主要由人體血小板在組織損傷時釋放，其通過趨化巨噬細胞、成纖維細胞及上皮細胞等，促進膠原合成、血管形成及上皮化，從而加快組織愈合過程。PDGF可由血小板和單核細胞分泌，與間葉組織表達的受體結(jié)合，可起到趨化作用并促進有絲分裂，加速纖維化和組織愈合。VEGF可通過調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的遷移、增殖和分化，促進新生血管的生成，同時對成骨細胞分化起到刺激作用，在骨修復(fù)中起一定作用。 EGF通過刺激角化細胞和皮膚成纖維細胞的增殖，促進表皮再生和創(chuàng)面的愈合，同時對其他生長因子有促進作用。此外，L-PRF內(nèi)還含有一種重要的細胞基質(zhì)蛋白——血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)，其對L-PRF微環(huán)境的調(diào)節(jié)起著重要作用，同時TSP-1可與蛋白水解酶競爭vWF結(jié)合位點，從而促進凝血過程[13-14]。

L-PRF中所含的白細胞能夠釋放多種促炎性反應(yīng)因子，使得L-PRF具有抗感染能力。主要包括：白介素-1B (interleukin-1B，IL-1B)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α)等。這些因子不僅可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，更具協(xié)同發(fā)揮作用調(diào)控細胞代謝、組織增生的作用。如骨折后通過調(diào)節(jié)破骨細胞、成骨細胞相互作用促進骨性愈合等[5]。

如前文所述，L-PRF的纖維蛋白網(wǎng)可募集巨噬細胞等組織細胞成分，進一步持續(xù)釋放生長因子及細胞因子，形成良性循環(huán)，延長了L-PRF促進上皮化、新生血管形成及新骨形成等生物學(xué)作用的時間，效果較PRP更好。

2 L-PRF的衍生物

為了滿足不同的應(yīng)用需求，在L-PRF的基礎(chǔ)上產(chǎn)生了幾種L-PRF的衍生物，以下就較常見的兩種進行介紹。

2.1 I-PRF簡介

可注射的PRF(injectable-platelet-rich fibrin, I-PRF)為液體狀,是在700 r/min，離心3 min下制備而成的。短時間的低速離心限制了纖維蛋白網(wǎng)的形成，使血液離心后呈兩層狀態(tài)，底層為以紅細胞為主的細胞層，頂層為含血漿、血小板及白細胞的I-PRF層。I-PRF的優(yōu)勢在于其為溶液形態(tài)，因此更方便與其他生物材料混合應(yīng)用；I-PRF中的白細胞及血小板含量更高，因此所含生長因子及細胞因子較PRP及L-PRF更豐富，已有文獻證實I-PRF能夠更長時間釋放生長因子并促進成纖維細胞遷移，在促進新生骨形成及抗菌能力等方面作用更強[15-16]。

2.2 A-PRF簡介

改良型富血小板纖維蛋白(advanced platelet-rich fibrin，A-PRF)是在更低速下離心更長時間后獲得的(1 500 r/min，14 min)，A-PRF與L-PRF均呈膠凍狀，但A-PRF的纖維蛋白網(wǎng)因更加低速及長時間的離心而較L-PRF疏松，血液中的有形成分更易浸潤，因此其富含的白細胞及干細胞較L-PRF更多[17]。干細胞在組織修復(fù)中具有非常重要的作用，其可分化為多種類型的組織細胞并可通過調(diào)控B-和T-淋巴細胞參與免疫調(diào)節(jié)和細胞調(diào)亡。A-PRF可通過在局部組織中提供較L-PRF多的自體干細胞而發(fā)揮優(yōu)勢。

I-PRF與A-PRF的臨床應(yīng)用報道有限，其與L-PRF的差別仍有待更多的動物及臨床試驗明確。

3 L-PRF的制備及注意事項

L-PRF的制備通常使用Choukroun的標準離心方法，通過離心使采集的靜脈血分3層，上層為血小板貧乏的血漿(platelet-poor plasma，PPP)，中層為L-PRF，下層為紅細胞層(red blood cells, RBCs)。L-PRF的制備要素包括：1)采血后立即離心：因制備過程中無添加物，因此L-PRF需要取靜脈血后立即盛入特制的試管中進行離心，否則會產(chǎn)生血凝塊導(dǎo)致制備失??；2)離心速度和時間：如前所述，離心的速度和時間會不同程度影響PRF纖維蛋白網(wǎng)的微結(jié)構(gòu)及血小板和白細胞的含量，但目前的制備方法仍有細微差異。PRF的標準離心方法是2 700 r/min，12 min，亦有3 000 r/min 離心10 min[7]，但兩種不同離心方法對L-PRF的性狀、構(gòu)成、生物活性等方面的影響，目前研究較少，結(jié)果尚有爭議；3)其他：多采用干燥和無添加劑的無菌玻璃或塑料試管，L-PRF在常溫下離心后立即取出置于擠壓盒中1 min，可根據(jù)需要壓成膜狀或小塊狀備用。制備完成后的L-PRF應(yīng)立即使用。

4 應(yīng)用

4.1 L-PRF在口腔科、骨科及整形科的應(yīng)用現(xiàn)狀

L-PRF為自體血液來源，無排異反應(yīng)，安全性高。且L-PRF具有促進成骨、上皮化及抗感染等作用，已在基礎(chǔ)實驗及臨床應(yīng)用中得到廣泛認可。目前L-PRF主要應(yīng)用于口腔科、骨科及整形外科的組織修復(fù)重建工作中。在口腔科用于：1)作為生物屏障膜修補口腔黏膜病損切除后的黏膜缺損；2)上頜竇底內(nèi)提升手術(shù)中用以促進骨質(zhì)增生；3)拔牙后局部填塞以保存拔牙位點；4)口腔上頜竇穿通的填補；5)第三磨牙拔除后干糟癥的預(yù)防及治療；6)促進年輕恒牙牙髓組織再生等[18-19]。在骨科用于：1)骨缺損的局部修復(fù)；2)脊柱融合手術(shù)；3)半月板等關(guān)節(jié)軟骨損傷與修復(fù)；4)韌帶/肌腱損傷的修復(fù)；5)預(yù)防骨與關(guān)節(jié)感染[20-22]。在整形科用于：1)慢性創(chuàng)面的修復(fù)；2)游離皮片及脂肪移植中促進組織增生及成活等[23-24]。

4.2 L-PRF在耳外科中的應(yīng)用現(xiàn)狀及展望

在耳顯微外科學(xué)中，骨質(zhì)缺損的修復(fù)、外耳道的重建對于保護重要結(jié)構(gòu)、重建有自潔能力的外耳道、降低感染及膽脂瘤復(fù)發(fā)率、減輕患者反復(fù)復(fù)診的負擔(dān)等方面有重要的意義。以往常用的填充和重建材料包括自體材料(如骨、軟骨和肌肉等)及人工材料(如羥基磷灰石水泥)。自體材料重建血運的時間長，表面覆蓋的皮膚、筋膜易萎縮、壞死，導(dǎo)致骨粉、骨片及軟骨的泄漏或暴露、感染，引起外耳道及乳突腔的上皮化時間延長，而肌肉瓣可逐漸萎縮，其游離端易缺血壞死而致內(nèi)陷袋形成，引起感染、上皮堆積，這些情況均限制了自體材料的應(yīng)用，目前尚沒有理想的解決方案。而人工材料因存在感染、排異反應(yīng)等風(fēng)險，亦難得到推廣。因此，如何使重建的外耳道更接近生理狀態(tài)并保證其穩(wěn)定(如保持填塞骨粉及肌肉的體積、促進新生骨質(zhì)形成)、降低不良反應(yīng)的發(fā)生率(提高上皮化及血運建立的速度、降低感染機會)一直是耳科學(xué)的難點，也一直是耳科醫(yī)師關(guān)注的問題。近年來，鑒于L-PRF及PRP在骨科、口腔科等用于軟組織及骨組織的修復(fù)和重建的經(jīng)驗，有耳科醫(yī)師嘗試將L-PRF及PRP用于耳科的組織修復(fù)重建中。

Ensari通過動物試驗證實L-PRF可促進鼓膜穿孔的愈合[L-PRF組平均(10.3±2.2)d,對照組為(17.0±2.4)d]，且L-PRF可促進鼓膜的纖維化和新血管形成[25]。對比用膜狀L-PRF及紙片處理急性鼓膜空孔的效果，認為L-PRF組穿孔愈合更早、愈合率更高、術(shù)后聽力更好[26]。在21例開放式乳突根治術(shù)中用PRP及自體骨片重建外耳道后壁，術(shù)后外耳道形態(tài)良好且上皮化良好[27]。本文作者所在課題組亦在總結(jié)其他科室應(yīng)用的基礎(chǔ)上，用L-PRF聯(lián)合自體骨粉重建開放式乳突根治術(shù)后的外耳道后壁，術(shù)后定期隨訪，結(jié)果顯示重建后的外耳道后壁較其他重建方式(如骨片、肌肉)形態(tài)更接近生理狀態(tài)，可達到自潔的目的，此部分工作仍在進行中。以上均提示PRP或L-PRF在耳科手術(shù)中的應(yīng)用前景廣闊，但基于相關(guān)報道較少且樣本量有限，仍有待設(shè)計更加合理的動物及臨床試驗驗證，這也是本人日后工作的方向。

5 結(jié)論

L-PRF來自于自體靜脈血，具有安全、取材方便、容易制備、造價低廉和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、可較長時間發(fā)作生物學(xué)效應(yīng)的優(yōu)點，其富含有多種生長因子，能夠促進組織的再生及修復(fù)，尤其在促進上皮化、新生血管生長及成骨方面作用顯著，L-PRF網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部的白細胞使其同時具備抗感染的能力。L-PRF在多個學(xué)科的臨床工作中應(yīng)用廣泛，收效良好。其優(yōu)良的生物學(xué)特性在耳科學(xué)中亦具有廣闊的應(yīng)用前景，有待進一步探討發(fā)掘。