股骨頭缺血性壞死造模方法的研究進展

★ 楊佛 夏漢庭 曹端廣 楊鳳云（.江西中醫(yī)藥大學 南昌 330004；.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 南昌 330006）

股骨頭缺血性壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是臨床上最常見的骨壞死，可分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性兩大類。創(chuàng)傷性ONFH多由于股骨頸骨折破壞股骨頭的血供導致的，非創(chuàng)傷性ONFH的病因與過量使用糖皮質激素及長期酗酒有關。本病嚴重影響患者的勞動能力與生活質量，晚期股骨頭塌陷后可導致患者殘疾［1］。近年來由于糖皮質激素的不規(guī)范使用以及酗酒人群的增加，臨床上ONFH患者越來越多，且呈年輕化態(tài)勢，給家庭及社會帶來了巨大的經濟負擔，也給勞動密集型企業(yè)埋下了巨大的隱患［2］。ONFH早期可選擇髓芯減壓和打壓植骨等保髖術式治療，但療程長且療效欠佳，加上ONFH患者早期癥狀輕微，且X線及CT對ONFH輔助診斷不敏感，導致很多患者錯過了就診的黃金時機。晚期就診患者再行保髖治療往往成效甚微，盡早行關節(jié)置換術才能獲得滿意的療效。但關節(jié)置換術的人工關節(jié)也有一定的使用壽命，后期需要翻修，且翻修難度加大，失敗率高［3］。事實上，ONFH的病因和發(fā)病機制至今尚未完全闡明，其中一個至關重要的原因就是在基礎研究領域中缺乏理想的ONFH模型，使得科研及臨床工作者對于ONFH的病理特征得不出突破性認識。基于此，筆者搜集近幾年國內外較理想的ONFH模型制作方法并進行綜述，希望能為ONFH的研究者提供理論參考。

1 液氮冷凍造模

液氮冷凍法由于具有安全性高、造模時間短、可重復性高等優(yōu)點，近幾年受到越來越多ONFH研究者的青睞。譚震等［4］使用股骨頭鉆孔加液氮灌注法，成功在山羊身上建立了ONFH模型。其在實驗中選取12只山羊，一側髖關節(jié)為實驗組，另一側為對照組進行研究。將山羊麻醉后備皮、消毒、鋪巾，從大轉子上方切口皮膚，分離肌肉，暴露髖關節(jié)囊，繼而T形切開關節(jié)囊，用直徑3.8 mm的鉆頭從大轉子處平行股骨頸向股骨頭鉆一長約1 cm的孔道，用自制漏斗插入孔道中，倒入液氮持續(xù)冷凍1 min，后用溫生理鹽水沖洗并逐層縫合傷口。2周后HE染色結果示實驗組骨小梁稀疏，大量骨細胞壞死，空骨陷窩率達（59.2±5.2）%，股骨頭總壞死率達91.67%。李海冰等［5］采用類似方法造模也獲得了較理想的模型。其以22只新西蘭大白兔右側髖關節(jié)作為實驗組進行研究，常規(guī)麻醉、備皮、消毒、鋪巾后，在右髖關節(jié)外側作一橫行切口，逐層分離肌肉、髖關節(jié)囊直至暴露股骨頭。然后用直徑3.5 mm的鉆頭向股骨頭前內側骨與軟骨交界處鉆一深約4 mm的孔，再用mini刮匙沿著孔道刮除部分松質骨直達軟骨下，再用針沿著孔道注入液氮冷凍1 min，繼而生理鹽水復溫并縫合切口。造模4周后X線顯示實驗組股骨頭塌陷，8周HE染色結果示關節(jié)軟骨大片剝脫，可見大量骨碎片。22只實驗動物中有21只造模成功，成功率達95.5%。曲春濤等［6］將液氮造模法結合射頻加熱技術對造模方法進行了改良，并且選用與人類股骨頭受力情況高度類似的兩足動物鴯鹋進行研究。其在實驗中以股骨大轉子為中心，在導航裝置引導下向股骨頭鉆孔到達關節(jié)軟骨下，然后插入閉合回路冷熱交替治療探針，先灌注液氮冷凍3個循環(huán)，每次9 min，冷凍后射頻加熱治療，3個循環(huán)后取出治療頭，逐層縫合切口。造模后第6周X線顯示軟骨下月牙形陰影，組織學顯示大量骨小梁碎裂，骨細胞死亡；第16周MRI顯示部分鴯鹋股骨頭塌陷伴髖關節(jié)半脫位。阮康明［7］運用液氮冷凍法建立了早期犬ONFH模型。其選用8只beagle犬作為實驗組進行研究，將犬麻醉后以右側股骨頸為中心作一弧形切口，分離淺層軟組織直至暴露股骨頭，用無菌紗布覆蓋保護股骨頭周圍組織，然后用浸泡過液氮的棉球濕敷股骨頭，每次3 min，濕敷完1次后用37℃生理鹽水沖洗復溫，然后繼續(xù)濕敷，共5個循環(huán)。造模第6周HE染色結果示股骨頭關節(jié)軟骨出現(xiàn)缺損，出現(xiàn)大量空虛骨陷窩。第12周CT提示骨質疏松，股骨頭出現(xiàn)囊狀透亮區(qū)；MRI顯示股骨頭關節(jié)軟骨下骨折。王海濤等［8］選取18只新西蘭大白兔一側股骨頭進行研究，實驗時先用克氏針向股骨頭鉆一直徑2 mm、深4 mm的孔，再用直徑1 mm、頭端直徑為1.2 mm的小圓球的特質探針蘸取液氮后涂抹于孔內，然后用生理鹽水復溫，共6個循環(huán)。造模后第2周實驗組空骨陷窩率達（73.33±7.21）%，到第8周時空骨陷窩率高達（88.13±8.12）%，且股骨頭大范圍壞死。Jiang W等［9］采用液氮冷凍法成功建立了鴕鳥ONFH并塌陷模型。其選用18只與人體體重相近的鴕鳥，麻醉后以左側大轉子為中心作一切口，分離皮下軟組織，切開關節(jié)囊，暴露股骨頭，接著用直徑3 mm的鉆頭向股骨頭軟骨承重區(qū)鉆一深約3.5 cm的孔，然后沿著孔道置入探針，注入液氮，持續(xù)2 min，2 min后用40℃鹽水復溫，復溫3 min，然后重新注入液氮，循環(huán)3次，3次結束后逐層縫合切口。術后12周發(fā)現(xiàn)手術側股骨頭塌陷。

2 激素法造模

激素性股骨頭缺血性壞死（steriod-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH） 造 模 法可分為單純激素法、激素聯(lián)合馬血清法和激素聯(lián)合脂多糖法。張立巖等［10］采用單純激素法獲得了兔SONFHARCO分期2期病變模型。實驗組采用臀肌注射地塞米松磷酸鈉（10 mg/kg，每3天1次，共14次）方法造模。6周后MRI顯示實驗組股骨頭內骨小梁稀疏，軟骨下骨壞死，HE染色結果示部分骨小梁斷裂，空骨陷窩增多，空骨陷窩率達（49.0±0.3）%。佟鵬等［11］采用激素聯(lián)合馬血清方法得到了滿意的兔SONFH模型。其選取20只新西蘭大耳白兔進行研究。實驗組10只先經耳緣靜脈注射馬血清（10 mL/kg），2周后再注射1次，注射2次后臀部注射醋酸潑尼松龍（8 mg/kg，1天1次，連續(xù)6天）。造模8周后行X線示實驗組骨密度明顯降低，骨小梁重度疏松；HE染色結果示實驗組股骨頭與股骨頸移行處見大量骨小梁碎片，骨小梁中骨細胞壞死；MRI結果示實驗組雙側股骨頭均出現(xiàn)典型的雙線征。總的造模效果顯示實驗組中10只兔子有8只造模成功，造模成功率達80%。董維等［12］同樣選取大白兔作為研究對象，但是是采用激素聯(lián)合脂多糖法進行造模。其在實驗中共納入30只大白兔進行研究，實驗組20只先經耳緣靜脈注射脂多糖（10 μg/kg），24h后右側臀肌注射甲強龍（20 mg/kg，1天1次，連續(xù)3天）。6周后X線片示右側股骨頭骨質疏松，部分骨小梁模糊不清；HE染色結果示實驗組骨小梁碎裂，骨細胞大量壞死，空骨陷窩數(shù)量增多，骨髓腔內充滿大量脂肪細胞。實驗組中共15只大白兔出現(xiàn)了骨壞死，壞死率為75%。喻鈞倫等［13］對激素聯(lián)合脂多糖造模法進行了改良。先經兔耳緣靜脈注射脂多糖（10 μg/kg），24 h后臀肌注射醋酸潑尼松龍（20 mg/kg，1天1次，共3次）為對照組；改良組則先臀部注射青霉素及阿米卡星預防感染，24 h后再經臀部注射醋酸潑尼松龍（20 mg/kg），再過24 h經兔耳緣靜脈注射脂多糖（5.0 μg/kg），注射脂多糖后間隔24 h分兩次注射醋酸潑尼松龍（每次劑量均為20 mg/kg）。結果對照組10只大白兔死亡8只，死亡率達80%；實驗組18只大白兔死亡9只，死亡率為50%。說明改良組的方法能降低動物的死亡率。張琳等［14-15］則對脂多糖與SONFH之間的量效關系進行了研究。其設置3個實驗組，脂多糖注射劑量分別為 10 μg/kg、20 μg/kg、40 μg/kg，聯(lián)合臀肌注射甲強龍（20 mg/kg）造模。造模后從骨密度、骨生物力學及組織學結果評定得出，脂多糖注射劑量為40 μg/kg時造模效果最好。章建華等［16］通過實驗比較了不同激素類型對SONFH造模效果的影響，結果發(fā)現(xiàn)相比地塞米松和潑尼松龍，運用甲強龍（20 μg/kg）造模對股骨骨密度的破壞最明顯，通過最大彎曲位移和楊氏模量的比較也得出甲強龍對大鼠股骨生物力學影響最大的結論。李超等［17］以“提高SONFH存活率”為出發(fā)點進行了研究，其在實驗中設置了3組實驗組，分別為激素聯(lián)合脂多糖組，激素聯(lián)合脂多糖加慶大霉素組，激素聯(lián)合脂多糖加慶大霉素及泮托拉唑組。造模6周后三組存活率比較發(fā)現(xiàn)，激素聯(lián)合脂多糖加慶大霉素及泮托拉唑組存活率最高，達87.5%。

3 酒精性ONFH造模

酒精性ONFH多見于青年人。目前對于酒精性ONFH的造模方法有灌胃法和股骨頭局部注射法。楊云等［18］用灌胃法給Wistar大鼠灌46°白酒（10 mL/kg，1天1次，連續(xù)6個月），3個月時HE染色結果示股骨骨小梁變細，空骨陷窩開始增加，造模6個月時股骨頭軟骨下區(qū)域出現(xiàn)典型的股骨頭壞死表現(xiàn)，股骨頭骨小梁稀疏，空骨陷窩明顯增加。李宏宇等［19］選取48只新西蘭大白兔進行研究，實驗組予42%乙醇灌胃（10 mL/kg，1周3次，連續(xù)6個月），造模3個月后空骨陷窩率明顯增加，骨內壓為（26.82±3.85）mm Hg，跟對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。范猛等［20］則采用股骨頭局部注射乙醇建立了ONFH模型。其選用大型兩足類動物鴯鹋進行研究，通過一根長10 cm、直徑1.5 mm的穿刺針向股骨頭注入無水乙醇8 mL誘導造模，造模3個月HE染色結果示實驗組出現(xiàn)大量空骨陷窩，骨小梁形態(tài)不規(guī)則；造模6個月HE染色顯示實驗組空骨陷窩存在活骨，表明造模6個月后股骨頭出現(xiàn)了自我修復過程。同樣是運用股骨頭注射無水乙醇，Wang C等［21］在犬身上成功制作了ONFH模型。其先構建虛擬股骨3D模型，同時打印出導針進針需要的套管和模型外殼，然后使用Geomagic Studio軟件選出最佳進針方位。開始正式實驗時先將犬麻醉，再借助導航模型，將直徑1.5 mm的K導針沿著股骨大轉子基底部向股骨頭中心鉆孔，直至離股骨頭關節(jié)軟骨面大約5 mm處，取出K導針，沿著孔道置入一直徑約1.6 mm套管，然后連接壓力注射器，注入4 mL的無水乙醇，注射完后逐層縫合。造模后6周X線檢查示6只犬中有2只出現(xiàn)股骨頭節(jié)段扁平，1只出現(xiàn)股骨頭骨折；第9周時發(fā)現(xiàn)6只犬中有2只影像學顯示髖關節(jié)狹窄伴繼發(fā)性關節(jié)炎。HE染色結果示第3周時股骨頭壞死區(qū)域中骨小梁稀疏，骨髓腔中的造血細胞減少；到第6周時壞死區(qū)域成纖維細胞增生、骨小梁開始重吸收；第9周時骨髓腔充滿了增生的成纖維細胞，破骨細胞沿著骨小梁的方向排列。

4 手術造模

股骨頭的血供主要來自外骺動脈、下干骺端動脈和內骺動脈。股骨頸骨折時容易損傷這些血管，如果得不到及時的手術治療很容易導致股骨頭出現(xiàn)缺血性壞死。因此在基礎實驗中可以通過結扎供應股骨頭血供的血管來達到ONFH造模的目的。Hwang等［22］在實驗中納入27只新西蘭大白兔進行研究，分為W、B、M三組，每組9只。W組采用直徑0.4mm的鋼絲繩環(huán)繞右股骨頸阻斷供應股骨頭的血供進行造模；B組在W組造模條件基礎上加用電極燒灼5s造模；M組采用肌注醋酸潑尼松龍（20mg/kg）方法造模。造模2周后組織學檢查示，B組較W組骨壞死程度高，W組骨壞死程度高于M組；免疫組織學結果顯示B組高表達Tunel細胞。這在一定程度上說明ONFH手術造模效果比激素造模效果好，且用時短。Qin Wen等［23］在實驗中制作了兔ONFH模型，其將所有附著在股骨頭上的韌帶分離，同時從股骨頸基底部截斷股骨頸，然后逐層縫合。造模后3周MRI顯示實驗組2/3的動物出現(xiàn)軟骨下低信號影。造模后3天即能明顯觀察到實驗組股骨頭HE染色變化，骨髓細胞減少，伴有骨髓細胞形狀的改變，骨髓腔出血，同時觀察到成纖維細胞。辛大森等［24］以研究“阿侖膦酸鈉防治股骨頭塌陷的效果”為出發(fā)點，選取45只SD大鼠進行研究，其中30只采取手術造模。麻醉后備皮，消毒，鋪巾，取左髖部外側3cm切口，分離皮下組織，切開關節(jié)囊，暴露股骨頭，使髖關節(jié)脫位，切斷圓韌帶，剔除股骨頸近端骨膜組織，沖洗后分層縫合。5周后安慰劑組HE染色結果示股骨頭組織內活骨和死骨交替存在，空骨陷窩＞50%。

5 小結

綜上所述，ONFH常用液氮冷凍法、激素法、酒精灌胃及局部注射法、手術法進行造模。每種造模方法都具有各自的優(yōu)點。液氮冷凍法能在短期內造出理想的ONFH模型，且動物整體死亡率低，實驗可重復性高，是一種較理想的造模方法［25］；激素造模法在基礎實驗中研究人群較多，且造模效果符合臨床上ONFH病變過程，因此研究價值較大；酒精灌胃及局部注射法、手術法造模效果好，且造模后動物病變過程比較符合臨床ONFH病變過程。但每種造模方法都有其不足之處：液氮造模法雖然成功率高，但不是針對ONFH的病因進行造模，且應用液氮的劑量和時間沒有統(tǒng)一的標準。激素造模法中單純激素法造模時間較長，激素聯(lián)合馬血清容易引起動物休克，導致死亡率偏高；激素聯(lián)合脂多糖方法得到大多數(shù)研究者的認可，但激素的種類繁多，目前尚沒有統(tǒng)一的標準，且脂多糖的用量也沒有公認的標準或標準范圍。酒精法中局部注射無水乙醇法術中操作過程較復雜，術中多次透視對實驗人員傷害較大。手術法造模對動物股骨頭周圍軟組織損傷較大，且難以造出塌陷型ONFH模型［26］。

在造模動物的選擇上，有四足動物大白兔、大鼠、犬，也有兩足動物鴯鹋、鴕鳥。兩足動物其髖部受力特點與人類類似，因此是研究者們一致認同的ONFH造模理想動物。但是由于其體型較大，具備的飼養(yǎng)條件及手術條件較嚴格，加上其價格昂貴，來源少，研究成本高，因此未能在基礎實驗中得到大量的應用。大鼠價格較便宜，飼養(yǎng)條件要求較低，但由于其股骨頭較小，不利于影像學觀察及組織形態(tài)學觀察。犬類股骨頭較大，但由于飼養(yǎng)成本高，且造模要求高，因此用于研究ONFH模型的例子也較少。大白兔性格溫和，存活率也高，股骨頭較大，因此是基礎領域研究者用來造模的合適動物。

因此，ONFH的研究者可以根據(jù)自己的實驗需要，同時結合自身的實驗條件，選擇對應的造模方法進行研究。近年來伴隨著科技的進步，ONFH造模方法得到不斷的完善而日趨理想。但我們也要認清這樣一個事實：在ONFH造模方面仍需要投入大量的基礎實驗研究，其中的很多造模方法還需要不斷的實驗檢驗和完善，對于造模藥物的用藥劑量沒有確定的標準或標準范圍，同時造模藥物的劑量及用藥時間與造模效果之間的關系研究得不夠透徹。相信隨著微創(chuàng)和3D打印技術的發(fā)展，ONFH造模方法能取得更大的突破。