COVID-19疫情下臨床檢驗面對的挑戰(zhàn)與對策

趙 林，向 瑜，賴曉霏，周發(fā)春△

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院：1.重癥醫(yī)學科；2.檢驗科，重慶 400016

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)屬于有包膜的β屬冠狀病毒，與嚴重急性呼吸綜合征(SARS)冠狀病毒基因的同源性達到85%以上[1-2]，但是否來源于蝙蝠尚存爭議[3]。目前該病毒主要通過呼吸道飛沫傳播[4]。感染者早期有發(fā)熱、乏力、干咳，嚴重者出現急性呼吸窘迫綜合征和多器官功能障礙綜合征，甚至死亡[5-8]；尸檢結果提示，肺部病變及肺泡細胞損傷與透明膜形成有關[9]。目前將新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)納入乙類傳染病，并采取甲類傳染病的預防、控制措施進行管理。因此，為有效地控制疫情傳播，需要進一步提高核酸檢測的陽性率，避免漏診。本文從臨床檢驗的角度分析疫情下面對的挑戰(zhàn)和應實施的對策。

1 COVID-19患者的常規(guī)檢測結果

COVID-19患者的常規(guī)檢查結果主要表現為早期白細胞總數正常或降低，淋巴細胞計數減少[2,4,10-13]，外周血淋巴細胞中B細胞數明顯下降，CD4+及CD8+T細胞水平不斷下降[4,10-13]。部分患者伴有C反應蛋白和紅細胞沉降率的升高，降鈣素原正常，重型、危重型患者常伴有白細胞介素-6(IL-6)的升高；大多數患者出現D-二聚體升高，以及出現天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)異常[10]。這些指標雖然沒有診斷特異性，但是如何從這些常規(guī)結果中篩選出可有效預測患者重癥傾向的指標也具有重要意義。

2 SARS-CoV-2的特異性檢測

SARS-CoV-2感染人體后，在呼吸道上皮細胞內大量繁殖，因此，目前COVID-19患者的確診仍然依靠病毒核酸的檢測。但核酸檢測易出現假陰性結果，若患者在檢測后出現假陰性結果，會導致隔離不及時，可能造成疾病的傳播，因此，準確的診斷對于疫情的防控和患者的治療具有重要的意義[14]。目前SARS-CoV-2常用的檢測方法包括：(1)實時熒光定量PCR(RT-PCR)；(2)病毒基因二代測序技術；(3)COVID-19病毒的抗體檢測。以下就這3種檢測方法的優(yōu)缺點進行逐一介紹。

2.1SARS-CoV-2的RT-PCR檢測 采用RT-PCR檢測SARS-CoV-2的核酸結果為陰性時不能排除SARS-CoV-2感染，需要排除可能產生假陰性的因素，包括標本的采集部位及標本質量，標本采集的時間與病毒載量，標本的保存、運輸和處理，試劑盒本身的局限性，以及其他原因[15]。

2.1.1標本的采集部位及標本質量 目前臨床主要采集上呼吸道標本進行SARS-CoV-2核酸檢測，要求患者和采樣人員相互配合，若采集鼻咽拭子、口咽拭子深度不夠，易導致采集到的標本中病毒載量較低，檢測結果就出現假陰性。下呼吸道標本(深咳痰液、肺泡灌洗液、支氣管灌洗液等)比上呼吸道標本(鼻咽拭子、口咽拭子等)更易檢出病毒，尸檢結果也證實該結論[9]。然而COVID-19患者多表現為干咳，深部痰液標本難以獲取。肺泡灌洗液和支氣管灌洗液等標本采集難度大，采樣人員感染風險大，通常對實施氣管插管的患者和重癥患者優(yōu)先采集下呼吸道標本。但是采集下呼吸道標本的患者所占比例小，對大多數患者仍采集易于獲取的上呼吸道標本，因此易導致假陰性結果的出現。

2.1.2標本采集時間與病毒載量 COVID-19的潛伏期為1～14 d，多為3～7 d[11]，絕大多數患者就診時可能已經遷延了數天至數周，咽拭子檢測時是否為最佳時期，標本內病毒載量是否仍然在商品化核酸檢測試劑盒的檢測范圍內還有待確定。若咽拭子中的病毒載量小，低于試劑盒的最低檢測限，易導致核酸結果呈現假陰性。根據以往研究經驗，標本的病毒載量從高到低依次為下呼吸道標本、上呼吸道標本、血液標本和糞便標本。但COVID-19患者隨著機體免疫系統(tǒng)的變化，體內病毒載量也隨著病程的不斷變化而發(fā)生著動態(tài)變化。

2.1.3標本的保存、運輸和處理 RNA病毒標本的保存、運輸和處理對于核酸檢測至關重要。SARS-CoV-2是一種RNA病毒，體外較易發(fā)生降解，因此，對保存、運輸和處理的要求很高?！缎滦凸跔畈《痉窝追揽胤桨?第五版)》規(guī)定用于病毒分離和核酸檢測的標本應盡快進行檢測，能在24 h內檢測的標本可置于4 ℃保存；24 h內無法檢測的標本則應置于-70 ℃或以下保存(如無-70 ℃保存條件，則于-20 ℃冰箱暫存)，標本運送期間應避免反復凍融[13]。COVID-19流行前期，本市的患者均在所在醫(yī)院采集標本，然后由醫(yī)院的工作人員將標本送至區(qū)級或市級疾病預防控制中心統(tǒng)一檢測。從采樣到運輸至疾病預防控制中心的時效性以及標本保存和低溫運輸過程是否達標，對于SARS-CoV-2核酸檢測結果準確性也至關重要。

2.1.4試劑盒本身的局限性 為積極應對COVID-19的嚴重疫情，試劑生產商試劑盒研發(fā)時間短，可能存在對試劑優(yōu)化不充分以及試劑批次間存在較大差異的情況。目前不同廠家的商品化的試劑盒一般只檢測1～2個部位的標本，只做一次擴增反應，缺乏標本間、標本內的重復也可能是造成假陰性結果的原因。所以盡可能采集同一患者不同部位的標本(上呼吸道、下呼吸道、血液、糞便標本)，并用不同廠家的商品化的試劑盒進行平行檢測，可最大限度地避免核酸檢測假陰性結果的出現。

2.1.5其他原因 SARS-CoV-2待測靶序列的變異或其他原因導致出現的序列改變可能會導致假陰性結果的出現。試劑或擴增反應中存在未經驗證的其他干擾或PCR抑制因子也可能會導致出現假陰性結果。

2.2病毒基因二代測序技術 利用病毒基因二代測序技術檢測SARS-CoV-2在《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第一版)》中已被列為確定診斷的標準，符合病例的定義，即采集痰液、咽拭子等呼吸道標本進行病毒全基因組測序，與已知的SARS-CoV-2高度同源[2]。病毒基因測序雖然準確性高，但是耗時長、成本高，不能廣泛應用于疫情流行期大量標本的檢測。在目前已經具有商品化試劑盒的情況下，疫情暴發(fā)后大量標本需要檢測，病毒基因測序技術非首選的診斷方案，但可以用于疑難病例的診斷與鑒別診斷。

2.3SARS-CoV-2的抗體檢測 由于RT-PCR檢測SARS-CoV-2具有假陰性率較高的缺點，病毒基因二代測序的費用高、耗時長，如能夠在不同時期對患者體內抗體進行檢測可以有效緩解診斷該病時面臨的困境。目前已經有重慶、浙江等地的科研機構成功研發(fā)出針對SARS-CoV-2檢測的免疫球蛋白(Ig)M、IgG試劑盒，主要方法包括化學發(fā)光法和膠體金法兩種?；瘜W發(fā)光法靈敏度高，易檢測出低水平抗體，假陽性率偏高；膠體金法的Cut-Off值較高，檢測靈敏度較低，易出現假陰性結果。最好采用兩種方法進行檢測，互為補充。由于抗體檢測是血清學的檢測，患有肝臟疾病、類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫性疾病的患者會發(fā)生非特異性反應，出現部分假陽性結果。目前，抗體檢測已經應用于臨床，主要針對疑似病例和無癥狀感染者的血清學檢查，作為核酸檢測的重要補充?？傊?，針對抗體檢測的試劑盒具有快速、高通量和低成本的特點，可用于COVID-19的早期診斷、流行病學篩查和臨床轉歸的預測。

3 COVID-19流行時期臨床檢驗面臨的挑戰(zhàn)與對策

為了避免含有病毒的標本在采集、運送、檢測以及后續(xù)處理的環(huán)節(jié)中傳播疾病，檢驗人員也必須采取相應的防護措施。其中氣溶膠傳播也是可能傳播途徑之一，而標本在運輸、操作和處置過程中均可產生氣溶膠[16-17]，防護措施也要包含避免通過氣溶膠感染的措施[4]。中華醫(yī)學會檢驗醫(yī)學分會制定了《新型冠狀病毒肺炎臨床實驗室檢測的生物安全防護指南(試行第一版)》，明確說明指導臨床檢驗時需進行有效的生物安全防護[18]。

3.1標本的采集和運輸中的防護要求 采集標本由臨床醫(yī)生操作完成，要求進行三級生物安全防護，不建議檢驗人員進入隔離區(qū)采集標本。標本采集后要求置于兩層一次性密封袋內密封。采集后的抽血針、棉簽等，需放入相應的醫(yī)療銳器盒或廢物箱[19]。標本院內運輸由專人運送入實驗室，確認裝箱前有消毒環(huán)節(jié)，參與運輸的人員應嚴格做好防護；院外送檢的標本，需嚴格按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規(guī)定》要求執(zhí)行[20]。

3.2標本的前處理、檢驗過程中的防護 實驗室接收和處理標本，應進行三級生物安全防護，操作人員應穿戴防護服、口罩、防護鏡等。手工檢測的項目要求在生物安全柜中進行。標本開箱或開袋盡可能在生物安全柜里完成檢驗操作，血液標本在離心前避免試管破損或者泄漏等。拔試管帽時防止標本飛濺，消毒后再上機離心，防止氣溶膠的形成。實驗室環(huán)境應符合二級或三級生物安全實驗室規(guī)范。RT-PCR的操作人員應該具有資質，操作的環(huán)境應符合要求，開展前應由省級衛(wèi)生行政部門審核后報國家衛(wèi)生健康委員會批準[18]。

3.3檢測后的防護 操作完成以后，要按照操作規(guī)定完成防護設備的脫卸。檢驗后的標本應確保密封嚴密；盛裝標本的試管，在生物安全柜中重新加蓋新的塞子，然后密封在袋子中，避免在移動過程產生氣溶膠。操作根據情況盡量集中時間統(tǒng)一操作，操作完成后的實驗室應按照要求采用紫外線燈照射、75%乙醇溶液或有效氯的消毒液噴霧全面消毒。廢棄物可以參照《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南(第二版)》進行處理[19]。

3.4特殊情況的處理 檢測標本在操作時發(fā)生飛濺、試管破損等造成小范圍的污染時，使用含有效氯消毒液進行消毒至少30 min。若造成實驗室污染時，應保持實驗室空間密閉，避免污染物擴散。使用含有效氯消毒液的毛巾覆蓋污染區(qū)域，消毒至少30 min。當大量的污染物溢灑時，應采用過氧乙酸加熱熏蒸實驗室[18-19]。

4 總 結

臨床檢驗在做好患者的常規(guī)檢查外，加強與臨床一線醫(yī)生共同分析探討重癥患者預后相關的指標具有重要的意義。其次，重視在核酸檢測時造成假陰性結果的多種因素，提高檢測效率的同時與相關機構合作研發(fā)出靈敏度和特異度高的檢測方法也是遏制疫情的有效措施。最后，針對檢驗中可能存在的暴露因素，按照實驗室生物安全的規(guī)章制度做到有效的防護，降低檢驗人員的感染風險也至關重要。