結(jié)核分枝桿菌相關(guān)γ -干擾素定量檢測(cè)在脊柱結(jié)核診斷中的應(yīng)用

康新桂，周海洋，徐娟麗，周 飛，王中興，王 睿

南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，南京 210014

脊柱結(jié)核是最常見(jiàn)的骨與關(guān)節(jié)結(jié)核，其較高的致殘率及逐年增長(zhǎng)的發(fā)生率嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，是全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題［1］。病原學(xué)檢查與菌種鑒定因周期長(zhǎng)、操作繁瑣、存在潛在風(fēng)險(xiǎn)等原因，遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足脊柱結(jié)核的早期診斷。近年來(lái)，基于結(jié)核感染免疫學(xué)診斷的新技術(shù)——結(jié)核分枝桿菌相關(guān)γ -干擾素定量檢測(cè)（TB-IGRA）在結(jié)核病的診斷方面顯示出較高的應(yīng)用價(jià)值［2］。目前有2 種成熟的TB-IGRA 技術(shù)：一種是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），主要檢測(cè)T 細(xì)胞經(jīng)特異性抗原刺激后在全血中釋放的γ -干擾素；另一種是酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT），是將單核細(xì)胞從全血中分離出來(lái)，在體外環(huán)境中培養(yǎng)并檢測(cè)在特定刺激下分泌γ-干擾素的T 細(xì)胞數(shù)量。這2 種方法原理相似，但在檢測(cè)技術(shù)和具體操作上略有不同［2-3］。TB-IGRA 在肺結(jié)核的早期診斷方面應(yīng)用廣泛，但在脊柱結(jié)核中的研究相對(duì)較少。本研究通過(guò)比較TB-IGRA 中的ELISA 法與其他結(jié)核檢測(cè)方法在診斷脊柱結(jié)核方面的差異，分析TB-IGRA 在脊柱結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年1月—2017年6月本院骨科收治的疑似脊柱結(jié)核病例。收集并整理患者的基本信息、影像學(xué)資料、合并癥、病理報(bào)告及外周血TB-IGRA、抗結(jié)核抗體（TB-Ab）檢測(cè)結(jié)果，所有患者均采用手術(shù)治療，并于術(shù)中留取病理標(biāo)本，對(duì)膿液較多的患者行利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)（Xpert MTB/RIF）。結(jié)合最終臨床診斷，分為脊柱結(jié)核組和非脊柱結(jié)核組。脊柱結(jié)核組納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者X 線片、CT 及MRI 具備脊柱結(jié)核特征（如死骨、椎間隙變窄、冷膿腫形成等）；②病理報(bào)告結(jié)果符合結(jié)核改變（如凝固性壞死、結(jié)核性肉芽腫等）；③細(xì)菌培養(yǎng)排除非結(jié)核分枝桿菌感染；④經(jīng)規(guī)范抗結(jié)核治療后，患者的臨床癥狀（腰背僵硬、盜汗、午后低熱、乏力等）明顯好轉(zhuǎn)；⑤脊柱結(jié)核患者抗結(jié)核治療時(shí)間＜ 2 周。非脊柱結(jié)核組納入標(biāo)準(zhǔn)：明確診斷為其他疾病，X 線片或CT 報(bào)告無(wú)肺結(jié)核改變，無(wú)傳染性結(jié)核患者接觸史。

1.2 研究方法

1.2.1 TB-IGRA TB-IGRA 診斷試劑盒（ELISA 法）購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司?；颊呷朐旱? 天清晨采集空腹靜脈血標(biāo)本，分別加入到對(duì)照管、檢測(cè)管及陽(yáng)性對(duì)照管中，每種培養(yǎng)管分裝約1 mL 血液標(biāo)本，充分混勻后置于37℃培養(yǎng)22 h，3 000 r/min 離心10 min（離心半徑10 cm），分離血漿，然后通過(guò)ELISA 法檢測(cè)γ -干擾素含量。檢測(cè)管γ -干擾素含量與對(duì)照管的差值≥14 pg/mL，且≥25%對(duì)照管判斷為陽(yáng)性，結(jié)核分枝桿菌感染可能性高。

1.2.2 TB-Ab檢測(cè)

TB-Ab ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海奧普生物醫(yī)藥有限公司。取患者第2 天清晨空腹靜脈血標(biāo)本，離心后取血清，將血清加到檢測(cè)孔中，15 ～ 20 min內(nèi)觀察并記錄檢測(cè)結(jié)果。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為對(duì)照線與檢測(cè)線均出現(xiàn)紫紅色線條；陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)為僅對(duì)照線出現(xiàn)紫紅色線條；無(wú)效判斷標(biāo)準(zhǔn)為對(duì)照線與檢測(cè)線均不顯示，需要重新檢測(cè)。

1.2.3 Xpert MTB/RIF

Xpert MTB/RIF 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cepheid公司。對(duì)術(shù)中膿液較多的患者行Xpert MTB/RIF。術(shù)中用注射器吸取病灶區(qū)域的膿液，送至實(shí)驗(yàn)室后加入1.5 mL 標(biāo)本處理液，輕輕晃勻，37℃孵育15 min；然后再次晃勻，室溫孵育5 min，取2 mL置于標(biāo)本盒，隨后將標(biāo)本盒置于全自動(dòng)醫(yī)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（Gene Xpert Dx System，美國(guó)Cepheid 公司）中，自動(dòng)進(jìn)行樣本過(guò)濾與洗滌。用超聲溶菌釋放出DNA 后與PCR 反應(yīng)試劑混合，進(jìn)行半巢式實(shí)時(shí)擴(kuò)增并檢測(cè)熒光信號(hào)，2 h 后儀器自動(dòng)給出檢測(cè)結(jié)果。若檢測(cè)到rpoB 基因，則認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)陽(yáng)性。

1.2.4 病理學(xué)檢測(cè)

將術(shù)中所取標(biāo)本置于10%中性甲醛溶液中固定＞ 24 h，隨后常規(guī)行脫鈣、切片、蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為鏡下觀察到干酪樣壞死、結(jié)核結(jié)節(jié)及郎格罕巨細(xì)胞等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以最終臨床診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算TB-IGRA、TB-Ab 檢測(cè)、Xpert MTB/RIF及病理學(xué)檢測(cè)4 種方法診斷脊柱結(jié)核的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。不同檢測(cè)方法間的一致性采用kappa 一致性檢驗(yàn)；以P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

所有患者入院后均接受TB-IGRA、TB-Ab 及病理學(xué)檢側(cè)，23 例術(shù)中膿液較多的患者接受Xpert MTB/RIF。確診或高度懷疑脊柱結(jié)核?。怪Y(jié)核組）28 例，男16 例、女12 例，年齡31 ～ 68（46.0±9.4）歲；合并高血壓病6 例，糖尿病9 例，口服激素者2 例。確診非脊柱結(jié)核（非脊柱結(jié)核組）16 例，男10 例、女6 例，年齡28 ～ 64（44.0±8.2）歲；其中腫瘤2 例，脊柱炎14 例；合并高血壓病6 例，糖尿病4 例。

2.2 TB-IGRA、TB-Ab 檢測(cè)、Xpert MTB/RIF 和病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果

TB-IGRA、TB-Ab 檢測(cè)、Xpert MTB/RIF 和病理學(xué)檢測(cè)的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值結(jié)果見(jiàn)表1。χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明，TB-IGRA 與TB-Ab檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），TB-IGRA與Xpert MTB/RIF 及病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。kappa一致性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，TB-IGRA與TB-Ab 檢測(cè)結(jié)果一致性較差（κ = 0.25），TB-IGRA與Xpert MTB/RIF 及病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致性較高（κ = 0.68、0.71）。

3 討 論

近年來(lái)，脊柱結(jié)核的感染人數(shù)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，由于其病程漫長(zhǎng)、病情隱蔽，發(fā)病早期往往不被患者重視，直至出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙、脊柱骨質(zhì)破壞、形成竇道時(shí)才被發(fā)現(xiàn)［2，4］。從某種程度來(lái)說(shuō)，脊柱結(jié)核是一種消耗性?xún)?nèi)科疾病，如能夠早期診治，不僅能遏制疾病的發(fā)展，減輕患者并發(fā)癥，降低死亡率，還有可能達(dá)到不經(jīng)手術(shù)治療而治愈的目的［5-6］。細(xì)菌學(xué)檢查是脊柱結(jié)核確診的可靠標(biāo)準(zhǔn)，但細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)周期長(zhǎng)、操作繁瑣，而且非典型結(jié)核及抗結(jié)核藥物的應(yīng)用降低了結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率，不能很好地滿(mǎn)足臨床診斷的需求［7-8］。

脊柱結(jié)核主要影響患者的細(xì)胞免疫系統(tǒng)，細(xì)胞免疫中的T 淋巴細(xì)胞經(jīng)結(jié)核特異性抗原刺激后，形成活化的效應(yīng)T 細(xì)胞。這些T 淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原——早期分泌靶抗原6（ESAT-6）和培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP-10）刺激后可分泌細(xì)胞因子γ -干擾素。TB-IGRA是一種檢測(cè)結(jié)核感染的新方法，該方法通過(guò)檢測(cè)γ -干擾素濃度及表達(dá)γ -干擾素細(xì)胞的數(shù)量來(lái)評(píng)估機(jī)體是否遭受結(jié)核感染［9］。ESAT-6 和CFP-10 具有高度特異性，在卡介苗及非結(jié)核菌中幾乎不表達(dá)，大大降低了臨床檢測(cè)的假陽(yáng)性率［1，10］。有研究顯示，TB-IGRA 診斷肺結(jié)核的靈敏度為84.85%、特異度為86.67%［9］，診斷骨與關(guān)節(jié)結(jié)核的靈敏度為86.7%、特異度為61.9%［11］。汪鍇等［12］發(fā)現(xiàn)TB-IGRA（ELISPOT 法）診斷脊柱結(jié)核的靈敏度和特異度分別為93.5%和91.7%，而TB-Ab 檢測(cè)的靈敏度和特異度分別為61.3%和72.2%。由此可見(jiàn)，不同研究、不同部位結(jié)核之間TB-IGRA 的靈敏度和特異度有較大差異。本研究發(fā)現(xiàn)，TB-IGRA（ELISA 法）檢測(cè)脊柱結(jié)核的靈敏度和特異度分別為85.7%和68.8%，稍低于汪鍇等［12］的研究，考慮為患者個(gè)體、區(qū)域差異及研究者所制訂的脊柱結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)不同等原因所致。本研究發(fā)現(xiàn)TB-Ab 檢測(cè)的靈敏度和特異度為53.6%和87.5%，該結(jié)果與汪鍇等［12］的研究相近。值得注意的是，TB-IGRA 與TB-Ab 結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者結(jié)果之間一致性較差（κ = 0.25），這與以往研究觀點(diǎn)一致［12］。

脊柱結(jié)核的病理學(xué)改變主要有2 種類(lèi)型，即增殖型病變和干酪樣滲出型病變。一些非典型結(jié)核病變僅依據(jù)臨床癥狀、影像學(xué)等檢查很難確定是否為結(jié)核分枝桿菌感染，病理學(xué)檢查較好地解決了這一難題［13］。Yuan 等［10］發(fā)現(xiàn)非典型脊柱結(jié)核患者中88.5%的病理檢查符合結(jié)核分枝桿菌感染的病理特點(diǎn)，TB-IGRA 的靈敏度和特異度分別為82.8%和81.3%，并認(rèn)為非典型脊柱結(jié)核患者的營(yíng)養(yǎng)狀況及年齡可能影響TB-IGRA 的陽(yáng)性率。本研究發(fā)現(xiàn)，28 例確診或高度懷疑脊柱結(jié)核組中有26例的病理結(jié)果高度提示結(jié)核感染，病理學(xué)檢查的陽(yáng)性率與TB-IGRA 的陽(yáng)性率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且兩者結(jié)果之間具有高度一致性（κ = 0.71）。由此可見(jiàn)，TB-IGRA 雖然不能確定結(jié)核病灶的位置及是否處于活動(dòng)期，但診斷方便快捷、靈敏度高、無(wú)需病灶取材，是一種很好的脊柱結(jié)核輔助診斷方法［8］。

Xpert MTB/RIF 是一種新的分子檢測(cè)方法，在結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥性的診斷中受到關(guān)注［14］，在肺內(nèi)及肺外結(jié)核的診斷中均有很好的應(yīng)用價(jià)值［15］。Wang等［16］依據(jù)脊柱結(jié)核診斷的綜合參考標(biāo)準(zhǔn)（包括臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、病理學(xué)檢查、放射學(xué)檢查及18個(gè)月的隨訪調(diào)查），發(fā)現(xiàn)Xpert MTB/RIF 的靈敏度（85.27%）明顯高于病理學(xué)檢測(cè)（73.04%）。李禎［17］采用相似的綜合參考標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)Xpert MTB/RIF同樣具有很高的靈敏度（78.7%）。本研究發(fā)現(xiàn)Xpert MTB/RIF的靈敏度為68.8%，較上述研究結(jié)果偏低。綜合分析本研究患者的臨床特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)個(gè)別患者口服激素類(lèi)藥物，可能在不同程度上降低了Xpert MTB/RIF 的靈敏度；本研究樣本量相對(duì)較少，且針對(duì)脊柱結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)與上述研究有差異，這都可能造成本研究中Xpert MTB/RIF靈敏度較上述研究結(jié)果偏低。此外，不同的取材方式（開(kāi)放手術(shù)、超聲定位穿刺及活組織檢查）［18］、取材部位（膿液、肉芽組織和干酪樣壞死組織）［19］所檢測(cè)的Xpert MTB/RIF 靈敏度有較大差異。目前尚無(wú)Xpert MTB/RIF與TB-IGRA的對(duì)照研究，本研究發(fā)現(xiàn)Xpert MTB/RIF 的靈敏度（68.8%）低于TB-IGRA（85.7%），但2種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且檢測(cè)結(jié)果之間有較高一致性（κ = 0.68）。

綜上所述，TB-IGRA 診斷脊柱結(jié)核具有良好的靈敏度和特異度，檢測(cè)方法方便、快捷，尤其適用于不方便獲取病灶組織的患者，在脊柱結(jié)核的輔助診斷方面有很好的應(yīng)用前景。然而本研究為小樣本量的回顧性研究，下一步本研究組將進(jìn)行較大樣本量的前瞻性研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果。本研究中部分患者患有高血壓、糖尿病、免疫功能低下（口服激素）等疾病，個(gè)別患者術(shù)后、出院前與入院時(shí)相比TB-IGRA 檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)明顯波動(dòng)，而且淋巴細(xì)胞的減少可能對(duì)TB-IGRA 的檢測(cè)結(jié)果有影響，因此，合并癥、藥物、手術(shù)干預(yù)及外周血（淋巴細(xì)胞等）數(shù)量對(duì)TB-IGRA 的影響仍有待進(jìn)一步研究。