芒果苷對(duì)HepG2 細(xì)胞胰島素抵抗的影響

何樂毅凡，徐暾海*，王 揚(yáng)，李龍宇，伍一煒，劉銅華

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029）

芒果苷主要存在于漆樹科植物芒果的果實(shí)、葉、樹皮或百合科植物知母的根莖、地上部分或鳶尾科植物射干的 花、葉等植物中[1-2]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道證明其具有多種藥理學(xué)活性，包括抗腫瘤[3-4]、保護(hù)心血管[5]、調(diào)節(jié)脂代謝異常[6]、抗糖尿病及其并發(fā)癥[7]等廣泛的藥理作用。本實(shí)驗(yàn)采用HepG2 細(xì)胞研究芒果苷體外降糖效果及對(duì)p-AKT（Thr308）、p-GSK-3β（Ser9）、AMPKα 及GLUT2 蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 HepG2 人肝癌細(xì)胞系來自北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院保存細(xì)胞株。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 芒果苷來自北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生實(shí)驗(yàn)室保存單體

1.3 試劑和儀器 DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）；青霉素-鏈霉素混合液（biotopped）；胎牛血清（美國(guó)O－RIGIN 公司）；磷酸鹽緩沖液（biotopped）；胰島素（諾和靈R）；鹽酸二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥有限公司）；胰蛋白酶-EDTA 溶液（biotopped）；葡萄糖檢測(cè)試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；cck-8（日本同仁化學(xué)研究所）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Fisher scientific 公司）；96 孔板（美國(guó)Corning 公司）；細(xì)胞培養(yǎng)皿（美國(guó)Corning 公司）；6 孔板（美國(guó)Corning公司）；全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；抗體p-AKT（Thr308）、p-GSK-3β（Ser9）、AKT、AMPKα、GSK-3β、GLUT2、β-actin（美國(guó)CellSignaling Technology 公司）；Blocking one（日本 NacalaiTesque 公司）；Solution1（日本TOYOBO 公司）；Solution2（日本TOYOBO 公司）；10×TBST 封閉洗滌緩沖溶液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；10×TBS 封閉洗滌緩沖溶液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；分離膠緩沖液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；濃縮膠緩沖液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；30%蛋白凝膠溶液（北京拜爾迪技術(shù)有限公司）；超純水實(shí)驗(yàn)室自制美國(guó)Millipore。R200D 型分析天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；HERA cell 150i CO2孵育箱（美國(guó)Thermo scientific公司）；HDL 型超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；IX71 倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；Glomaxmulti 酶標(biāo)儀（美國(guó)promega 公司）；Sigma 臺(tái)式高速低溫冷凍離心機(jī)（Sigma-Aldrich 公司）；恒溫培養(yǎng)震蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.4 HepG2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作流程

1.4.1 HepG2 細(xì)胞的培養(yǎng) HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清的4.5 g/L DMEM 高糖培養(yǎng)液中，于37 ℃、5.0% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，覆蓋95%及以上瓶壁后，用胰蛋白酶消化，按照1:3 的比例待傳代2～3 次后，可用于實(shí)驗(yàn)操作。

1.4.2 芒果苷對(duì)HepG2 細(xì)胞活性的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)為正常組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組，其中正常組為含細(xì)胞和完全培養(yǎng)基，對(duì)照組加入含DMSO 溶液（500 μg/mL）培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的含芒果 苷（500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL）培養(yǎng)基，空白組為不含細(xì)胞和任何藥物的培養(yǎng)基。待90%HepG2 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，按照不同處理方法作用細(xì)胞24 h 后，加入CCK-8 溶液將培養(yǎng)板放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀分別于30、60、120、180 min 測(cè)定450 nm 處的吸光度值，按公式計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組－空白對(duì)照組）/（正常組－空白對(duì)照組）×100%。

1.4.3 芒果苷對(duì)胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)為實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組、模型組、正常組，實(shí)驗(yàn)組含不同濃度的芒果苷（60、30、15 μg/mL），陽性對(duì)照組含200 μg/mL 二甲雙胍溶液。待80%HepG2細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組、模型組加入含1×10-6mol/L 胰島素溶液的培養(yǎng)基，正常組加入不含胰島素溶液的培養(yǎng)基，造模36 h 后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行12 h的饑餓處理，按照不同處理方法作用細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，饑餓細(xì)胞8 h，每孔吸出2 μL 培養(yǎng)基上清液加到新的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，另加入2 μL 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，再加入葡萄糖測(cè)試工作液（R1、R2 等量）于37 ℃、5.0%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min，置于酶標(biāo)儀560 nm 下檢測(cè)96 孔板中上清液中的葡萄糖含量。為消除細(xì)胞個(gè)數(shù)對(duì)葡萄糖消耗量的影響，每孔加入10 μLCCK-8，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀分別于30、60、120、180 min 測(cè)定450 nm 處的吸光度值，在按照公式計(jì)算細(xì)胞葡萄糖消耗率。細(xì)胞葡萄糖消耗量=（總葡萄糖含量－剩余葡萄糖的含量）/（實(shí)驗(yàn)組/陽性對(duì)照組－空白對(duì)照組）。

1.4.4 芒果苷對(duì)HepG2 細(xì)胞胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路的相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)為正常組、模型組、實(shí)驗(yàn)組（60、15 μg/mL），每組3 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞造模36 h后分組給藥12 h 后，用全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白量，加2×蛋白上樣緩沖液和PBS 調(diào)整每組蛋白為統(tǒng)一值，100 ℃煮沸5 min 后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)蛋白大小配置適宜濃度的凝膠，每孔18 μg上樣量，先90 V 定壓預(yù)電泳10 min，再100 V 定壓電泳90 min。采用濕法凝膠轉(zhuǎn)膜60 或90 min，1×TBS室溫?fù)u床中清洗膜1 次10 min；Blocking one 封閉15～30 min 后。孵育一抗體（1:1 000 稀釋），于4℃孵育過夜。第二天回收一抗，1×TBST 室溫?fù)u床中清洗膜3 次后，加二抗（1:4000）室溫孵育1～2 h，回收二抗后以1×TBST 室溫清洗3 次，再以1×TBS 清洗2 次，加適量ECL 發(fā)光液，避光反應(yīng)2 min，置于紫外顯影儀中對(duì)目的蛋白進(jìn)行成像。用Image J 軟件進(jìn)行蛋白灰度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SAS 8.2 軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（）表示。多組比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用t 檢驗(yàn)；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芒果苷對(duì)HepG2 細(xì)胞活性的影響 與正常組比較，對(duì)照組濃度為500 μg/mL 的DMSO 對(duì)細(xì)胞活性無影響，因此可用DMSO 溶解芒果苷進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；與正常組比較，當(dāng)芒果苷濃度在大于62.5 μg/mL 后對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，因此濃度為62.5 μg/mL 及以下的芒果苷均可用于實(shí)驗(yàn)，但由于芒果苷為單體化合物，最終選擇濃度為60、15 μg/mL 進(jìn)行葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)，見表1。

表1 芒果苷對(duì)HepG2 細(xì)胞活性的影響（，n=6） %

表1 芒果苷對(duì)HepG2 細(xì)胞活性的影響（，n=6） %

2.2 芒苷對(duì)胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響 與正常組比較模型組葡萄糖消耗量明顯減少，且存在極顯著性差異（P＜0.01），因此胰島素模型造模成功；與模型組比較，陽性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組葡萄糖消耗量均明顯增加，雖然實(shí)驗(yàn)組葡萄糖消耗量不及陽性對(duì)照組，但高劑量組葡萄糖消耗量具有極顯著差異（P＜0.01），低劑量組葡萄糖消耗量具有顯著差異（P＜0.05），見表2。

表2 芒苷對(duì)胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響（，n=6）

表2 芒苷對(duì)胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響（，n=6）

注：與正常組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

2.3 芒果苷對(duì)HepG2 細(xì)胞胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路的相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 由表3 及圖1 所示，與正常組比較，模型組p-AKT（Thr308）、p-GSK-3β（Ser9）、AMPKα、GLUT2 蛋白表達(dá)明顯降低且存在顯著性差異（P＜0.05），因此胰島素抵抗模型造模成功；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)均明顯增加，且高劑量組均存在顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05），低劑量組除GLUT2 蛋白表達(dá)具有顯著性差異（P＜0.05），其他蛋白雖有增加但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 芒果苷對(duì)IR-HepG2 細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響（，n=3）

表3 芒果苷對(duì)IR-HepG2 細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響（，n=3）

注：與正常組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

圖1 芒果苷對(duì)IR-HepG2 細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

3 討論

胰島素抵抗是指各種原因（如炎癥、肥胖）使組織對(duì)胰島素敏感性下降，使肝臟、肌肉、脂肪組織等靶細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取和利用的效率下降，其貫穿于 2型糖尿病整個(gè)發(fā)病過程[7-8]，目前改善胰島素抵抗成為治療2 型糖尿病的關(guān)鍵途徑之一[9]。肝臟在胰島素抵抗發(fā)生中起到了重要作用，通過參與肝糖原合成與分解、糖異生等過程調(diào)節(jié)機(jī)體的糖代謝過程[10]；芒果苷是一種C-葡萄糖苷的多酚化合物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明芒果苷具有改善胰島素抵抗細(xì)胞葡萄糖消耗量的作用；且給予芒果苷刺激8或12 h后，胰島素抵抗細(xì)胞的p-AKT（Thr308）、p-GSK-3β（Ser 9）、AMPKα 及GLUT2蛋白表達(dá)顯著增加，明顯改善細(xì)胞胰島素抵抗，推測(cè)其可能是通過改善p-AKT（Thr308）、p-GSK-3β（Ser9）、AMPKα、GLUT2 等與PI3K/Akt 通路有關(guān)的蛋白表達(dá)水平以發(fā)揮降低血糖作用，達(dá)到改善胰島素抵抗作用以緩解2 型糖尿病癥狀。

本實(shí)驗(yàn)從蛋白表達(dá)水平探討芒果苷發(fā)揮降糖作用的可能機(jī)制，首次推測(cè)其可能與PI3K/Akt 信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)，但驗(yàn)證的關(guān)鍵性蛋白還有欠缺，并且也僅從蛋白水平單方面推測(cè)，因此后續(xù)還需增加PI3K/Akt 信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白的驗(yàn)證并進(jìn)行更深入的多方面、多通路、多途徑的驗(yàn)證，以探討芒果苷發(fā)揮降糖作用的可能機(jī)制。