阿爾茨海默病相關(guān)血液學(xué)標(biāo)志物研究進(jìn)展

陳小童，林 勇

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，上海 200040）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知障礙以及后期的人格和行為改變等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，AD在全球廣泛流行，截至2013年，全球約有4400萬(wàn)人罹患癡呆，預(yù)計(jì)至2050年，患病人數(shù)將達(dá)到1.3億，其中50%～75%為AD患者[1]。

隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)在AD早期即可出現(xiàn)細(xì)胞外淀粉樣β蛋白（amyloid betaprotein，Aβ）異常沉積、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及腦組織的核酸氧化、線(xiàn)粒體損傷等[2]。這提示AD是一個(gè)連續(xù)發(fā)展的疾病，通過(guò)對(duì)其病理生理特征的監(jiān)測(cè)或許有利于更加早期、全面地治療AD。2007年發(fā)布的國(guó)際工作組織（the International Working Group，IWG）-1診斷標(biāo)準(zhǔn)首次將生物標(biāo)志物納入AD診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。2014年發(fā)布的IWG-2診斷標(biāo)準(zhǔn)將AD相關(guān)生物標(biāo)志物進(jìn)行了分類(lèi)[4]。美國(guó)國(guó)立衰老研究所和美國(guó)阿爾茨海默病協(xié)會(huì)將生物標(biāo)志物作為臨床前AD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并作為AD源性輕度認(rèn)知障礙（mild cognitive impairment，MCI）以及AD源性癡呆的支持性證據(jù)[5]。由此可見(jiàn)，生物標(biāo)志物在AD的進(jìn)展中有重要的價(jià)值。

目前，主要通過(guò)磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像（positron emission computed tomography，PET/CT）[6]以及腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）相關(guān)項(xiàng)目[7]等針對(duì)“大腦”的AD生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。此類(lèi)方法存在價(jià)格高、創(chuàng)傷性大、技術(shù)要求高等缺點(diǎn)。事實(shí)上，AD的發(fā)生、發(fā)展并不局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而是與全身各器官、組織、細(xì)胞代謝活動(dòng)密切相關(guān)，是更加系統(tǒng)、復(fù)雜的過(guò)程。Aβ的異常沉積與AD的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)，而Aβ的產(chǎn)生和清除過(guò)程由大腦和外周共同參與。有研究結(jié)果顯示，大腦中近60%的Aβ可運(yùn)輸至外周被清除，而外周產(chǎn)生的Aβ也可進(jìn)入大腦并參與AD的病理過(guò)程[8]。大腦與外周Aβ代謝的相互作用及動(dòng)態(tài)變化提示或許可通過(guò)檢測(cè)外周血相關(guān)指標(biāo)監(jiān)測(cè)AD的發(fā)生、發(fā)展。血液學(xué)標(biāo)志物的檢測(cè)相對(duì)簡(jiǎn)便、易行，可彌補(bǔ)現(xiàn)有檢測(cè)方法的不足。為此，本文擬對(duì)AD相關(guān)血液學(xué)標(biāo)志物的研究現(xiàn)狀進(jìn)行分類(lèi)闡述。

1 預(yù)測(cè)型AD血液學(xué)標(biāo)志物

預(yù)測(cè)型AD血液學(xué)標(biāo)志物可在AD無(wú)癥狀期表達(dá)，對(duì)AD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。

淀粉樣蛋白的病理現(xiàn)象被認(rèn)為是最早期的AD病理改變[5]，常預(yù)示著更高的患病風(fēng)險(xiǎn)。VERBERK等[9]建立Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型后發(fā)現(xiàn)，血漿Aβ42/Aβ40比值越低，預(yù)示著臨床進(jìn)展至MCI和AD階段的風(fēng)險(xiǎn)越高[風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）為2.03，校正年齡和性別后的HR為1.67]，血漿Aβ42/Aβ40比值與CSF Aβ42水平密切相關(guān)，若將血漿Aβ42/Aβ40比值用于MCI和AD的診斷，可以減少50%以上用于檢測(cè)CSF Aβ42的腰椎穿刺。NAKAMURA等[10]采用免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜對(duì)日本國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心的121份血液樣本及澳大利亞老齡化影像學(xué)、生物標(biāo)志物和生活方式研究的252份血液樣本進(jìn)行淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）及Aβ檢測(cè)，結(jié)果顯示血漿APP669-711/Aβ1-42比值和Aβ1-40/Aβ1-42比值聯(lián)合檢測(cè)與PET/CT結(jié)果密切相關(guān)，以PET/CT結(jié)果作為反映腦Aβ沉積程度的標(biāo)準(zhǔn)，分別制作2項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的受試者工作特征曲線(xiàn)，其曲線(xiàn)下面積均＞90%，準(zhǔn)確性為90%，提示血漿APP669-711/Aβ1-42比值和Aβ1-40/Aβ1-42比值聯(lián)合檢測(cè)可在一定程度上反映腦Aβ的沉積情況。由此可見(jiàn)，與血漿Aβ42相關(guān)的聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果可作為AD的預(yù)測(cè)指標(biāo)，但尚無(wú)充分證據(jù)表明單獨(dú)檢測(cè)血漿游離Aβ42和Aβ40水平與AD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程有關(guān)。除血液Aβ水平有變化外，Aβ的二級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)隨AD的發(fā)展而發(fā)生變化。NABERS等[11]采用免疫-紅外線(xiàn)探測(cè)儀，通過(guò)Aβ抗體“捕獲”Aβ，以酰胺Ⅰ帶作為目標(biāo)條帶，經(jīng)紅外線(xiàn)照射后產(chǎn)生最大吸收峰，設(shè)1642 cm-1為閾值，β-折疊將使峰值移向＜1642 cm-1一側(cè)。他們采用巢式病例對(duì)照研究方法，以2000—2002年收集的血液樣本作為基線(xiàn)，測(cè)量其酰胺Ⅰ帶吸收峰值，在長(zhǎng)達(dá)8年的隨訪(fǎng)后，統(tǒng)計(jì)暴露的AD患者與非AD對(duì)照者的吸收峰值，發(fā)現(xiàn)AD患者的吸收峰值顯著低于非AD對(duì)照者，該法的陽(yáng)性似然比為7.9，提示該法可用于早期篩查AD高風(fēng)險(xiǎn)人群。

隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)在AD進(jìn)程中，大腦的代謝活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生與之相關(guān)的變化。因此，近年來(lái)有許多研究利用代謝組學(xué)探索與AD相關(guān)的血液學(xué)生物標(biāo)志物。VARMA等[12]同時(shí)檢測(cè)了大腦與外周血的同一組代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4種鞘脂類(lèi)代謝物在血液中的水平越高，未來(lái)AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)越大。

2 進(jìn)展型AD血液學(xué)標(biāo)志物

進(jìn)展型AD血液學(xué)標(biāo)志物在AD病程進(jìn)展（包括MCI和AD階段）中的表達(dá)有明顯差異。

Aβ的生成與β-分泌酶（beta amyloid cleavage enzyme，BACE）相關(guān)。BACE 1介導(dǎo)了APP的第1次剪切，是Aβ生成的限速酶。有研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組比較，MCI組和AD組血漿BACE 1活性分別增加了53.2%和68.9%，且能反映MCI轉(zhuǎn)變?yōu)椤翱赡転锳D”的可能性[13]。

氧化應(yīng)激與AD的病理過(guò)程息息相關(guān)，氧化應(yīng)激相關(guān)的氧化產(chǎn)物或能作為AD的生物標(biāo)志物。異前列腺素（isoprostane，IsoP）是反映體內(nèi)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的可靠的生物標(biāo)志物之一。PE?A-BAUTISTA等[14]對(duì)血漿中18種IsoP進(jìn)行分析，結(jié)果顯示AD組有6種IsoP明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。載脂蛋白（apolipoprotein，apo）一直以來(lái)都被認(rèn)為在AD病理過(guò)程中扮演著重要角色，如apo E基因與晚發(fā)型AD關(guān)系密切[7]，apo J可作為分子伴侶調(diào)控氧化損傷[15]。有研究結(jié)果顯示，MCI組和AD組血漿apo J水平明顯高于健康對(duì)照組（P＜0.001、P＜0.05），但與認(rèn)知量表評(píng)分高低無(wú)關(guān)[16]。與氧化應(yīng)激相關(guān)的血液抗氧化酶在AD進(jìn)程中也發(fā)生了變化，如超氧化岐化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶[17]，且人體總抗氧化力呈下降趨勢(shì)。PERROTTE等[16]的研究結(jié)果顯示，血漿總抗氧化力與臨床認(rèn)知量表評(píng)分有關(guān)，提示總抗氧化力與認(rèn)知衰退程度有一定關(guān)系。

另外，神經(jīng)炎癥在AD進(jìn)程中也扮演著重要的角色。淀粉樣蛋白瀑布假說(shuō)（amyloid cascade hypothesis，ACH）認(rèn)為Aβ的異常沉積可激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特有的免疫細(xì)胞，如小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等，繼而釋放多種炎性介質(zhì)，參與神經(jīng)炎性斑塊的形成[18]。HENEKA等[19]的研究結(jié)果顯示，炎癥反應(yīng)可能在神經(jīng)炎性斑塊形成之前就已發(fā)生，這一過(guò)程可促進(jìn)Aβ沉積、tau蛋白聚集等AD病理過(guò)程。因此，檢測(cè)相關(guān)炎癥介質(zhì)水平或許可在一定程度上反映AD的病情進(jìn)展情況。FORLENZA等[20]的研究結(jié)果顯示，AD組和MCI組血清白細(xì)胞介素（interleukin，IL）1β水平明顯高于正常對(duì)照組（P=0.03）。

3 支持診斷型AD血液學(xué)標(biāo)志物

支持診斷型AD血液學(xué)標(biāo)志物在AD患者與非AD者或正常對(duì)照者之間表達(dá)有明顯差異。

Aβ相關(guān)指標(biāo)在AD預(yù)測(cè)及進(jìn)展監(jiān)測(cè)中發(fā)揮了重要作用，而Aβ相關(guān)基因，如APP、早老素（presenilin，PS）基因突變?cè)贏D診斷，尤其是在家族性AD的診斷上已被廣泛認(rèn)同。淀粉樣蛋白瀑布假說(shuō)認(rèn)為AD的產(chǎn)生在于Aβ過(guò)量生成及清除減少[21]，而Aβ是由APP經(jīng)BACE和γ-分泌酶水解后產(chǎn)生的，因此APP基因突變成為淀粉樣蛋白瀑布假說(shuō)成立的有力證據(jù)之一，如APP基因的β分泌酶剪切位點(diǎn)突變（APPKM670/671NL突變）可促進(jìn)Aβ產(chǎn)生，E693G位點(diǎn)突變使Aβ從寡聚體向原纖維轉(zhuǎn)變，有利于Aβ沉積、E682K位點(diǎn)突變，加快AD進(jìn)程等。然而，并非所有的APP基因突變都會(huì)致病，如APP基因A673T突變可減少Aβ的生成[21]。PS蛋白是組成γ-分泌酶催化亞基的蛋白復(fù)合物，可介導(dǎo)APP的膜內(nèi)切割，產(chǎn)生Aβ。PS基因突變常表現(xiàn)為PS蛋白功能缺失，使γ-分泌酶失去活性，Aβ生成減少[22]。然而，這并不能將其定性為有益突變。有研究結(jié)果顯示，PS基因突變產(chǎn)生的效應(yīng)與淀粉樣蛋白瀑布假說(shuō)相一致[23]。

Tau蛋白是微管相關(guān)蛋白。在生理狀態(tài)下，tau蛋白不折疊且?guī)缀鯚o(wú)聚集傾向。正常成人每個(gè)tau蛋白分子中約有2個(gè)位點(diǎn)磷酸化，而AD患者每個(gè)tau蛋白分子中平均有8個(gè)位點(diǎn)磷酸化[24]，tau蛋白的過(guò)度磷酸化可改變tau與其他蛋白的正常相互作用，使其脫離微管，促進(jìn)tau蛋白的聚集，導(dǎo)致突觸功能異常。MIELKE等[25]的研究結(jié)果顯示，AD組血漿總tau蛋白和磷酸化tau181蛋白水平均明顯高于認(rèn)知正常組（P＜0.01）。有Meta分析結(jié)果顯示，AD組CSF總tau蛋白及磷酸化tau蛋白水平分別是正常對(duì)照組的2.54倍和1.88倍，且磷酸化tau蛋白診斷AD的特異性高于總tau蛋白[26]。

CORSI等[27]對(duì)外周血中炎性介質(zhì)、內(nèi)皮細(xì)胞功能與AD及認(rèn)知衰退的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，AD組血漿IL-8（P=0.01）、γ干擾素（interferon gamma，IFN-γ）（P=0.026）、人單核細(xì)胞趨化蛋白-1（P=0.05）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（P=0.049）水平均高于正常對(duì)照組，P-選擇素（P＜0.0001）和L-選擇素（P=0.0002）均低于正常對(duì)照組，且認(rèn)知損傷最嚴(yán)重的AD患者P-選擇素和L-選擇素水平最低。在植物血凝素的刺激下，外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌的IFN-γ等細(xì)胞因子水平和血清細(xì)胞因子水平異常也可能與AD發(fā)病相關(guān)[28]。此外，AD患者血清中的其他炎癥因子，如IL-10、IL-1β和IL-17等也明顯高于正常對(duì)照組[29]。分化簇（cluster of differentiation，CD）40是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，目前應(yīng)用較多的是將其作為與淋巴細(xì)胞功能相關(guān)的表面抗原。有研究結(jié)果顯示，在AD患者的大腦皮質(zhì)、神經(jīng)炎性斑塊及反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞聚集中，CD40的反應(yīng)原性明顯增強(qiáng)[30]。MOCALI等[31]的研究結(jié)果顯示，晚發(fā)型AD患者血漿可溶性CD40明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.001），且該水平的差異與apo E表達(dá)無(wú)關(guān)。該研究結(jié)果在一定程度上為晚發(fā)型AD的診斷提供了新的依據(jù)。然而，目前尚未在AD患者或MCI患者CSF中發(fā)現(xiàn)可溶性CD40[32]，其內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

AD患者免疫和炎癥系統(tǒng)的系統(tǒng)性改變部分是由于其外周血CD3+淋巴細(xì)胞水平降低所致。TRAMUTOLA等[33]利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究了AD患者和非癡呆患者血液中3-硝基酪氨酸的蛋白質(zhì)組，鑒定了10種蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示AD患者CD3+T細(xì)胞中3-硝基酪氨酸水平顯著高于非癡呆患者（P＜0.05）。還有研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照者比較，AD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)微小RNA（microRNA，miRNA）-34a升高（P＜0.05），miRNA-34c在AD患者單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)（P＜0.05）及血漿中（P＜0.01）均明顯升高[34]。

此外，氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)、外泌體及細(xì)胞外miRNA也與AD相關(guān)。丙二醛是常用的膜脂過(guò)氧化指標(biāo)。有研究結(jié)果顯示，AD患者血漿丙二醛水平變化顯著[35]。FIANDACA等[36]的研究結(jié)果顯示，AD組血漿中源自神經(jīng)元外泌體的P-S396-tau、P-T181-tau和Aβ1-42水平顯著高于認(rèn)知正常組（P＜0.0001）。HARA等[37]的研究結(jié)果顯示，AD組血清has-miRNA-501-3p下調(diào)，但腦中has-miRNA-501-3p水平上調(diào)，相應(yīng)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)has-miRNA-501-3p的細(xì)胞可下調(diào)128種基因位點(diǎn)的表達(dá)，而這些基因與DNA復(fù)制和細(xì)胞周期相關(guān)，提示血清hasmiRNA-501-3p可能與AD患者大腦中細(xì)胞損傷和凋亡相關(guān)。另外，AD患者血清外泌體miRNA-135a、miRNA-384表達(dá)顯著升高，miRNA-193b表達(dá)明顯下調(diào)[38]。由此可見(jiàn)，miRNA有望被用于診斷AD。

4 結(jié)論

AD在全球范圍內(nèi)已引起廣泛關(guān)注，越來(lái)越多的研究結(jié)果表明在AD進(jìn)程中，中樞與外周的聯(lián)系密切，如小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的免疫細(xì)胞之一，參與Aβ的清除及突觸功能的發(fā)揮[39]，免疫相關(guān)的基因及通路的表達(dá)在AD患者大腦及外周中均有變化[40]。有研究結(jié)果顯示，外周的炎癥刺激可誘導(dǎo)大腦急性的“免疫訓(xùn)練”及“免疫耐受”，在AD小鼠模型中，免疫訓(xùn)練可加劇大腦Aβ沉積，而免疫耐受則可減輕Aβ沉積，表明外周的刺激可影響大腦的免疫記憶，繼而影響AD的病理過(guò)程[41]。介導(dǎo)外周炎癥和大腦之間溝通的“橋梁”包括血腦屏障的損傷、細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的信號(hào)傳遞、腦內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等。這種密切聯(lián)系為AD相關(guān)血液學(xué)生物標(biāo)志物的研究打下了基礎(chǔ)，為其在臨床上的應(yīng)用提供了可能。

目前，用于衡量AD血液學(xué)標(biāo)志物的依據(jù)主要包括：（1）是否與PET/CT或CSF中相關(guān)標(biāo)志物的變化相關(guān)，借此反映大腦Aβ的沉積情況或tau蛋白的磷酸化情況；（2）是否在AD無(wú)癥狀期、MCI和AD期進(jìn)程中變化顯著，以提示生物標(biāo)志物與AD有一定的相關(guān)性。但以上依據(jù)尚有一定的局限性：首先，目前PET/CT或CSF指標(biāo)的變化能否較準(zhǔn)確地反映AD進(jìn)展還有待商榷，如臨床分期與大腦中Aβ的沉積情況并不完全相符；其次，目前常見(jiàn)的晚發(fā)型AD與年齡密切相關(guān)，而許多疾病也與年齡相關(guān)，因此需充分考慮年齡因素并排除其他疾病因素干擾；再次，目前主要運(yùn)用的檢測(cè)方法為免疫分析法和分子生物學(xué)檢測(cè)方法，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性較差，假陽(yáng)性率、假陰性率較高，原因可能為分析前樣本采集、運(yùn)送、提取等方式不同[42]，分析方法不一致[43]，血腦屏障損傷與AD相關(guān)[44]但無(wú)法量化，受AD有關(guān)危險(xiǎn)因素及其他疾病的影響[45]，血液本身的復(fù)雜性導(dǎo)致分析結(jié)果出現(xiàn)差異[46-47]。除了規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作及選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法可在一定程度上減少額外的變異外，所選的生物標(biāo)志物種類(lèi)、數(shù)量及分析方法也可影響研究結(jié)果，因此目前出現(xiàn)了許多組學(xué)研究，如蛋白質(zhì)組學(xué)[48]、基因組學(xué)[49]、脂質(zhì)組學(xué)[50]等，試圖更加全面地反映AD誘導(dǎo)的相關(guān)生物標(biāo)志物的變化。

總之，AD是全世界面臨的共同難題，因而在科研上也需要無(wú)國(guó)界的通力合作，克服難題，共同尋找理想的生物標(biāo)志物。理想的血液學(xué)標(biāo)志物將以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在AD的篩查和診斷中得到推廣和應(yīng)用。