自噬對(duì)椎間盤退行性變作用機(jī)制的研究進(jìn)展

胡舜琪，張其琛，李熙雷

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨科，上海 200032

椎間盤退行性變（IDD）被公認(rèn)為是腰痛的主要原因，約有80%的人會(huì)在其一生中遭遇到腰痛［1］。目前，世界上約有6.5億人受到腰痛的困擾，僅在美國(guó)，每年投入的相關(guān)費(fèi)用就超過(guò)了300億美元，甚至超過(guò)了中風(fēng)、呼吸道感染、糖尿病、冠狀動(dòng)脈疾病及類風(fēng)濕疾病的費(fèi)用總和［2］。腰痛已是導(dǎo)致患者住院治療的第二大常見(jiàn)病因，也是導(dǎo)致患者長(zhǎng)期殘疾的主要原因之一［3］。此外，IDD還是頸部和背部疼痛綜合征的主要原因，嚴(yán)重情況下甚至?xí)斐苫颊邭埣玻?］。隨著人口老齡化的日漸加重，IDD對(duì)人類健康造成巨大危害，也給患者家庭和社會(huì)增加了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。作為一種常見(jiàn)的復(fù)雜退行性疾病，其傳統(tǒng)治療措施已無(wú)法滿足目前的臨床需求。自噬細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)引起學(xué)者們的關(guān)注。椎間盤髓核細(xì)胞通過(guò)自噬適應(yīng)外界環(huán)境，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。適度激活自噬能有效抑制椎間盤細(xì)胞凋亡，延緩細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解。研究自噬在IDD中的作用機(jī)制，針對(duì)性地干預(yù)其病理生理進(jìn)程，可為IDD的臨床治療提供新的理念。本文通過(guò)查閱近年自噬對(duì)IDD作用的相關(guān)文獻(xiàn)，從IDD及自噬的發(fā)生機(jī)制、髓核細(xì)胞凋亡途徑及自噬對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制等方面展開(kāi)分析，綜述如下。

1 IDD的發(fā)生機(jī)制

目前，IDD的治療主要依靠手術(shù)緩解神經(jīng)受壓，有一定的療效，但無(wú)法從根本上預(yù)防或逆轉(zhuǎn)IDD的發(fā)生和發(fā)展［5］。面對(duì)現(xiàn)有治療的局限性，深入研究IDD的發(fā)生機(jī)制，尋找新的解決方案成為迫切需求。椎間盤活性細(xì)胞數(shù)量的減少和ECM的降解是IDD的主要特征。在健康的椎間盤中，由于受到生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的復(fù)雜調(diào)控，ECM的合成和分解代謝處于相對(duì)平衡的狀態(tài)；一旦ECM的分解代謝超過(guò)合成代謝，就容易發(fā)生IDD。IDD的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，常由多個(gè)因素引起，如異常的機(jī)械負(fù)荷、性別、年齡、吸煙、創(chuàng)傷和遺傳等［6-9］。健康的椎間盤需要維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)由于上述因素被破壞時(shí)，在分子水平上會(huì)發(fā)生分解代謝的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致促炎因子水平上調(diào)、基質(zhì)降解酶增加和基質(zhì)蛋白喪失，加劇IDD發(fā)展，甚至導(dǎo)致神經(jīng)血管向椎間盤內(nèi)生長(zhǎng)，引起疼痛癥狀［10］。研究表明，ECM中的膠原蛋白和蛋白多糖的喪失在IDD的發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，ECM的分解過(guò)程由基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）和血小板反應(yīng)蛋白解聚素樣金屬蛋白酶（ADAMTS）引起［11］，該過(guò)程被認(rèn)為由腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等促炎因子介導(dǎo)，其上調(diào)了MMPs和ADAMTS的表達(dá)［12］。在這些分子中，MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4及ADAMTS-5是降解基質(zhì)成分的典型代表，已被證實(shí)在發(fā)生退行性變的組織中高表達(dá)并參與了正常細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和椎間盤主要結(jié)構(gòu)成分的病理性退行性變［13］。此外，椎間盤細(xì)胞的死亡，尤其是髓核細(xì)胞的凋亡也會(huì)導(dǎo)致ECM的合成與分泌減少。

2 自噬的發(fā)生機(jī)制

自噬是細(xì)胞的自我消化，是一種進(jìn)化上極為保守的分解代謝過(guò)程，最早由De Duve［14］于1963年提出。自噬分為3種形式：巨自噬、微自噬及分子伴侶介導(dǎo)的自噬（CMA）。一般所說(shuō)的自噬即為巨自噬。自噬是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，通過(guò)該機(jī)制，在不利的外界條件下，例如營(yíng)養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激等，細(xì)胞中受損的細(xì)胞器或長(zhǎng)壽命蛋白可以被雙層膜囊泡隔離并帶到溶酶體中降解。自噬在所有細(xì)胞中以較低的基礎(chǔ)水平存在來(lái)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，如更新細(xì)胞器；當(dāng)細(xì)胞需要產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)、能量（如饑餓或營(yíng)養(yǎng)因子缺乏）或需要迅速清除有害的細(xì)胞質(zhì)中的成分（如在氧化應(yīng)激或感染期間），自噬水平會(huì)快速上調(diào)。細(xì)胞通過(guò)自噬來(lái)降解非必需蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，以供細(xì)胞重新回收利用，再合成細(xì)胞所需的大分子和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）［15］。在不同的應(yīng)激下，細(xì)胞依靠自噬清除功能失調(diào)或過(guò)剩的細(xì)胞器來(lái)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［16］。自噬的過(guò)程可分為以下幾個(gè)步驟。

2.1 自噬的起始與成核

自噬的激活途徑包括哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）依賴性途徑（如AMPK/mTOR和PI3K/Akt/mTOR）以及非mTOR依賴性途徑（如p53）。自噬的特異性和復(fù)雜的分子機(jī)制尚未完全闡明，已被認(rèn)為有超過(guò)35種自噬相關(guān)基因（ATGs）參與自噬的調(diào)控［17］。在哺乳動(dòng)物中，mTOR的下調(diào)受到應(yīng)激的刺激，隨后激活下游的絲氨酸/蘇氨酸Unc-51樣激酶1（ULK1）和ULK2（ATG1在哺乳動(dòng)物中的2個(gè)同源物）。激活的ULK1/2與ATG13、FIP2000（ATG17在哺乳動(dòng)物中的同源物）和ATG101形成ULK1復(fù)合物，通過(guò)激活Ⅲ類磷脂酰肌醇3激酶（PI3KC3）復(fù)合物來(lái)調(diào)控自噬體的形成［18］。PI3KC3復(fù)合物通過(guò)磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）的產(chǎn)生來(lái)募集效應(yīng)蛋白，形成歐米茄體，即自噬前體（PAS）作為成核位點(diǎn)［17］。

2.2 自噬體膜的擴(kuò)增和延伸

PI3KC3復(fù)合物定位于吞噬泡并進(jìn)一步募集ATGs以完成自噬體的發(fā)育。吞噬泡的延伸會(huì)受到2種泛素樣結(jié)合系統(tǒng)的調(diào)控：①ATG5-ATG12復(fù)合物與ATG16L1結(jié)合，產(chǎn)生定位于膜外表面的復(fù)合物，稱為ATG16L復(fù)合物［19］。ATG12通過(guò)E1樣酶ATG7和E2樣酶ATG10與ATG5共價(jià)結(jié)合，得到的ATG5-ATG12復(fù)合物被募集到自噬體膜并通過(guò)與ATG16L1的相互作用促進(jìn)其延伸［20］。②涉及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3），其為酵母中ATG8的同源物。早期合成的無(wú)活性proLC3（LC3的未加工形式）被ATG4B裂解，形成可溶性的LC3-Ⅰ，從而暴露其C末端的甘氨酸基團(tuán)［21］。LC3-Ⅰ的C末端甘氨酸基團(tuán)與磷脂酰乙醇胺（PE）的特異性氨基酸位點(diǎn)緊密結(jié)合，形成LC3-PE復(fù)合物，這種形式的LC3被稱為膜結(jié)合的LC3-Ⅱ［22］。蛋白質(zhì)免疫印跡法分析LC3-Ⅱ水平的變化或監(jiān)測(cè)細(xì)胞中GFP-LC3的分布是測(cè)定自噬水平最常用的方法［23］。PE的高親脂性促進(jìn)LC3-Ⅱ募集自噬體，在自噬體的延伸中起到了決定性作用［24］。這2種系統(tǒng)對(duì)自噬發(fā)生均不可或缺。ATG16L復(fù)合物作為一種新型E3樣酶，對(duì)LC3的脂質(zhì)化起到了支架作用，最終促進(jìn)自噬體形成［19］。

2.3 自噬溶酶體的形成及內(nèi)容物降解

隨著膜的擴(kuò)增和封閉，自噬體逐漸成熟。當(dāng)自噬體完全封閉底物，就可與溶酶體融合，形成自噬溶酶體。自噬體與溶酶體融合之后，位于自噬體膜外的LC3-Ⅱ通過(guò)ATG4與PE解偶聯(lián)，形成LC3-Ⅰ并被釋放到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行再次循環(huán)，而定位于自噬體膜內(nèi)的LC3-Ⅱ最終被自噬溶酶體的酸性水解酶迅速降解。

3 髓核細(xì)胞凋亡途徑

細(xì)胞凋亡的研究主要集中在3種凋亡信號(hào)通路：線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。Wang等［25］的研究證實(shí)，在發(fā)生退行性變的椎間盤組織中，以上3種途徑共同導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在IDD發(fā)展的輕度階段，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑介導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡占主導(dǎo)地位；死亡受體途徑則在輕度、中度IDD中發(fā)揮主要作用；線粒體途徑在重度IDD中起到更關(guān)鍵的作用。

這3條凋亡路徑相互之間也存在著密切的分子交聯(lián)。Caspase-8連接死亡受體和線粒體途徑［26］；p53也可以通過(guò)上述的2個(gè)途徑起作用［27］，在間接的線粒體途徑中，p53導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)的Fas在細(xì)胞表面重新分布，并上調(diào)Fas表達(dá)，而Fas是死亡受體途徑中的重要分子。在直接線粒體途徑中，p53上調(diào)Bax并使功能性Bax和Bcl-x復(fù)合物解離［28］，因此，死亡受體和線粒體途徑也通過(guò)p53連接。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和線粒體途徑可以通過(guò)GADD153和caspase-9聯(lián)系［29］。盡管這3種途徑存在許多交聯(lián)，但死亡受體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的特異性標(biāo)志物各不相同，分別是Caspase-8、Cytc和Caspase-4。髓核細(xì)胞的凋亡發(fā)生率隨著IDD的進(jìn)展而增加，在IDD過(guò)程中，每個(gè)凋亡路徑在IDD的不同階段發(fā)揮不同作用。

4 自噬對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

在成年人的正常椎間盤中幾乎沒(méi)有血管存在，并且髓核細(xì)胞在椎間盤中處于極度缺氧的狀態(tài)（中心的髓核氧濃度僅為1%）［30］，因此，椎間盤本身易發(fā)生退行性變。若存在非生理性的機(jī)械負(fù)荷及其他生理生化因素的刺激（如衰老、尼古丁、炎性因子等），就會(huì)誘導(dǎo)椎間盤細(xì)胞的凋亡，而大量凋亡的髓核細(xì)胞和ECM的分解產(chǎn)物則可進(jìn)一步促進(jìn)髓核組織中炎性因子的增加［31-32］，形成惡性循環(huán)。髓核細(xì)胞是存在于椎間盤髓核中的主要細(xì)胞類型，負(fù)責(zé)合成ECM成分，例如Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖，這些蛋白是椎間盤主要的功能組成部分。不僅凋亡的髓核細(xì)胞無(wú)法合成ECM，在椎間盤中經(jīng)歷退行性變過(guò)程的存活細(xì)胞也無(wú)法合成正常的ECM［33］。有研究顯示，在細(xì)胞水平，凋亡與IDD密切相關(guān)，如在老化的椎間盤中，髓核組織的凋亡率顯著增加［34］。因此，與凋亡相關(guān)的髓核細(xì)胞減少是IDD的起始觸發(fā)因素，如何有效地抑制髓核細(xì)胞的凋亡是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。

研究表明，自噬與細(xì)胞死亡密切相關(guān)，與自噬有關(guān)的細(xì)胞死亡被細(xì)胞死亡命名委員會(huì)（NCDD）稱為“自噬性細(xì)胞死亡”［35］。事實(shí)上，自噬性細(xì)胞死亡和凋亡均屬于程序性細(xì)胞死亡（PCD）的范疇［36］。從分子機(jī)制層面看，自噬也與細(xì)胞凋亡存在著復(fù)雜緊密的聯(lián)系。Beclin-1是酵母自噬相關(guān)基因6（ATG6）的哺乳動(dòng)物同源物，在自噬過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，已有證據(jù)顯示，抗凋亡因子B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）基因可通過(guò)結(jié)合Beclin-1的BH3結(jié)構(gòu)域抑制自噬［37］。此外，ATG12和ATG5在不同應(yīng)激信號(hào)引起的細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)中扮演了重要角色［38］。自噬能否影響椎間盤中的細(xì)胞凋亡，引起了學(xué)者們的極大興趣。

研究發(fā)現(xiàn)，自噬在未發(fā)生退行性變的大鼠椎間盤髓核細(xì)胞中存在著一定的基礎(chǔ)水平，而在發(fā)生退行性病變的髓核組織中細(xì)胞自噬顯著增高或降低，說(shuō)明自噬在正常髓核細(xì)胞及不同病理因素背景下發(fā)揮不同的作用［4］。

Jiang等［39］的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖胺可通過(guò)PI3K/Akt/mTOR通路激活自噬，在10 mmol/L葡萄糖胺的濃度下，炎性因子IL-1β處理過(guò)的髓核細(xì)胞的Caspase3/pro-caspase3顯著降低，說(shuō)明髓核細(xì)胞的凋亡被該濃度下葡萄糖胺所誘導(dǎo)的自噬抑制。然而在高濃度葡萄糖胺下，自噬被過(guò)度激活，引起髓核細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡；另外，用自噬抑制劑3-MA可以使細(xì)胞凋亡加劇。這說(shuō)明中等程度的自噬激活有利于髓核細(xì)胞的生存，過(guò)低或過(guò)高水平的自噬均會(huì)加劇髓核細(xì)胞的死亡。

同時(shí)有研究顯示，外界刺激持續(xù)作用的時(shí)間也會(huì)通過(guò)自噬影響髓核細(xì)胞的活力。Ma等［40］通過(guò)壓縮誘導(dǎo)髓核細(xì)胞自噬，隨著暴露于壓縮刺激的時(shí)間延長(zhǎng)，自噬增加，凋亡水平也呈時(shí)間依賴性增加。這說(shuō)明外界持續(xù)刺激誘導(dǎo)的長(zhǎng)期自噬不利于細(xì)胞存活。Chang等［41］的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)葡萄糖剝奪，早期（0 ～ 6 h）由少量活性氧類（ROS）產(chǎn)生所誘導(dǎo)的自噬對(duì)細(xì)胞的保護(hù)起到關(guān)鍵作用，在晚期階段（12 ～ 24 h）過(guò)量的ROS累積反而造成細(xì)胞器的損傷，此時(shí)自噬的保護(hù)作用無(wú)法與之抗衡，導(dǎo)致髓核細(xì)胞凋亡增加。有學(xué)者認(rèn)為，自噬引起的細(xì)胞內(nèi)資源的過(guò)度消耗也可能是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的一個(gè)重要原因［42］。

自噬激活的作用效果也與椎間盤本身的退行性變程度有關(guān)。Miyazaki等［43］的研究發(fā)現(xiàn)，自噬在PfirrmannⅣ級(jí)椎間盤中抑制凋亡的效果比PfirrmannⅡ級(jí)更明顯，而且自噬在晚期退行性變的椎間盤中的作用比在早期更為突出。因此，可以推斷，退行性變程度越高的椎間盤，其細(xì)胞對(duì)自噬激活的敏感性可能更高。由此可見(jiàn)，自噬對(duì)髓核細(xì)胞而言是一把雙刃劍，是髓核細(xì)胞存活和死亡之間的轉(zhuǎn)換器。自噬的適度激活有利于改善髓核細(xì)胞活力，減少髓核細(xì)胞在不利應(yīng)激下的凋亡率。

5 總 結(jié)

IDD的傳統(tǒng)治療已無(wú)法滿足患者對(duì)預(yù)后的期望和對(duì)生活質(zhì)量的需求。近年來(lái)，自噬作為一個(gè)科研熱點(diǎn)引起了廣泛的關(guān)注和深入探索。目前，大部分研究依然處于體外試驗(yàn)階段，其確切的臨床效果尚有待驗(yàn)證。如何將椎間盤細(xì)胞的自噬水平調(diào)控至最佳以最大程度降低細(xì)胞凋亡，是臨床應(yīng)用的重大挑戰(zhàn)，但可以預(yù)見(jiàn)的是，以自噬相關(guān)通路作為靶點(diǎn)的療法，將為IDD的臨床治療提供更多的選擇。