節(jié)律基因clif單核苷酸多態(tài)性與老年急性心肌梗死患者的相關(guān)性研究

呂煒俊，王云鄉(xiāng)，應(yīng)婕

（永康市第一人民醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 永康 321300）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，多表現(xiàn)為胸骨后疼痛，可并發(fā)心律失常、休克等，常危及生命[1]。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP）是指單個核苷酸變異所導(dǎo)致DNA序列多態(tài)性，有研究表明AMI 與易感基因SNP 密切相關(guān)[2-3]。許多心血管疾病的發(fā)作一般都會發(fā)生在某一特定時間段，比如AMI 多半在早晨突發(fā)，呈現(xiàn)較明顯的生物節(jié)律性。節(jié)律基因包括clock、period 和clif等，相關(guān)研究表明心血管疾病發(fā)生可能與節(jié)律基因突變或表達異常存在關(guān)聯(lián)[4]。絕大多數(shù)AMI 發(fā)生是由于冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或內(nèi)皮損傷，凝血系統(tǒng)被激活，促使血栓形成，血管內(nèi)皮損傷在AMI 發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。凝血酶調(diào)節(jié)蛋白（Thrombomodulin, TM）是一種具有清除凝血酶、活化抗凝因子的糖蛋白，可在抗凝因子蛋白C 協(xié)同作用下減少血栓的形成，是血管內(nèi)皮細胞活化標志物，是反映血管內(nèi)皮損傷的較敏感指標之一[5]。纖溶酶原激活抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1）是一種與血漿波基結(jié)合素結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物發(fā)揮活性的單鏈糖蛋白，可降低凝血及血栓形成[6]。為進一步明確節(jié)律基因在AMI 中發(fā)揮的作用及機制，本研究以老年AMI 患者為研究對象，以探討節(jié)律基因clif 單核苷酸多態(tài)性與該病的相關(guān)性，clif 與PAI-1、TM等鐘控基因的關(guān)系，為臨床防治AMI 及尋找新的早期預(yù)警指標提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2016年7月—2018年3月永康市第一人民醫(yī)院收治的、符合《急性心肌梗死診斷和治療指南》[7]、《2016年中國成人血脂異常防治指南》等[8]標準的126 例老年AMI 患者作為病例組。納入標準：意識清晰，無精神病史；無嚴重瓣膜病或心房顫動等；無嚴重凝血功能障礙或肝腎疾??；無腦梗死或惡性腫瘤者；依從性良好者等。排除標準：惡性腫瘤者；腦梗死者；心房顫動者；嚴重肝腎疾病者；周圍動脈栓塞者；依從性差者等。同期選取132 例健康體檢者作為對照組。研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過。所有研究對象均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 動物及試劑

C57BL/6J 小鼠（由南京大學(xué)模式動物研究所提供），clif 基因慢病毒干擾試劑盒（中國上海吉瑪公司），Trizol 試劑盒（美國Invitrogen 公司），SNaP shot 試劑盒（美國ABI 公司），血漿PAI-1 和TM 酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（美國Sigma 公司），DNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）試劑盒（日本TaKaRa 公司），PCR 擴增引物[生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計、合成]，熒光定量PCR 儀（美國羅氏公司）、電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司），Nano Drop 2000c 紫外分光光度計（美國Thermo Scientific 公司）。

1.3 實驗方法

所有研究對象空腹采外周血5 ml，利用酚-氯仿有機油提法提取外周血細胞DNA，根據(jù)NCBI PubMed等篩選節(jié)律基因clif 位點，選擇標準為人群（漢族）具有較高頻率（MAF ≥0.05）、各位點間連鎖平衡r2≥0.8，再結(jié)合文獻，最終挑選rs2583913 和rs1071592 2 個位點。采用單堿基引物延伸法（SNaP shot 法）檢測多態(tài)性位點rs2583913 和rs1071592 在病例組和對照組中的SNP 基因型和等位基因頻率分布。

C57BL/6J 小鼠慢病毒轉(zhuǎn)染制備過程大致如下：構(gòu)建clif 基因慢病毒干擾質(zhì)粒，慢病毒組轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細胞后，輸注到C57BL/6J 小鼠體內(nèi)，作為慢病毒轉(zhuǎn)染組。慢病毒對照組的制備方法同慢病毒轉(zhuǎn)染組，輸注空白質(zhì)粒?？瞻讓φ战M輸注生理鹽水。每組15 只C57BL/6J 小 鼠 采 用qRT-PCR 檢 測 其PAI-1 及TM mRNA 的表達水平；運用ELISA 檢測干擾前后小鼠血漿中PAI-1、TM 及clif 表達量的變化?；蛞镄蛄幸姳?。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較采用χ2檢驗；采用Hardy-Weinberg 平衡檢驗計算基因頻率分布差異程度；采用基因計數(shù)法分析基因頻率及基因型分布頻率。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象的基線資料比較

兩組研究對象的性別、吸煙史、飲酒史、糖尿病史、高血壓史、年齡、收縮壓、血小板、甘油三酯、高密度脂蛋白及總膽固醇比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；兩組舒張壓、心率、白細胞計數(shù)、低密度脂蛋白、空腹血糖及肌鈣蛋白比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），病例組高于對照組。見表2。

2.2 兩組clif 基因多態(tài)性位點基因型及等位基因頻率分布情況

經(jīng)Hardy-Weinberg 平衡檢驗，發(fā)現(xiàn)各基因型分布頻率達到遺傳平衡（P＞0.05）；兩組rs2583913 基因型及等位基因頻率分布情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；兩組rs1071592 基因型及等位基因頻率分布情況比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.3 慢病毒干擾沉默clif 后，小鼠血漿clif、PAI-1和TM mRNA 表達情況

慢病毒轉(zhuǎn)染組均轉(zhuǎn)染成功。以空白對照組小鼠clif、PAI-1 及TM mRNA 表達量為1.0 作為參照，慢病毒對照組小鼠clif、PAI-1 及TM mRNA 相對表達量分別為（0.9±0.1）、（0.9±0.1）及（0.9±0.1），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；慢病毒轉(zhuǎn)染組小鼠clif、PAI-1 及TM mRNA 相對表達量分別為（0.2±0.1）、（0.4±0.2）及（0.6±0.1），均低于空白對照組及慢病毒對照組（P＜0.05）。見圖1。

表2 兩組患者的基線資料比較

表3 兩組clif 基因各位點基因型及等位基因頻率分布情況 例（%）

2.4 慢病毒干擾沉默clif 后，小鼠血漿中TM 和PAI-1 蛋白水平表達

各組小鼠血漿TM 和PAI-1 蛋白表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；慢病毒對照組和空白對照組血漿中TM 和PAI-1 蛋白表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；慢病毒轉(zhuǎn)染組血漿TM、PAI-1 蛋白表達量均低于空白對照組及慢病毒對照組（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠血漿TM 和PAI-1 蛋白表達量比較（n =15，±s）

表4 各組小鼠血漿TM 和PAI-1 蛋白表達量比較（n =15，±s）

注：?與空白對照組或慢病毒對照組比較，P ＜0.05。

組別 TM PAI-1空白對照組 49.2±12.3 22.6±5.1慢病毒對照組 47.6±11.5 21.8±4.8慢病毒轉(zhuǎn)染組 39.2±7.4? 17.6±3.3?F 值 3.838 5.415 P 值 0.029 0.008

3 討論

AMI 是由于冠狀動脈內(nèi)血栓形成而引起，導(dǎo)致凝血及纖溶系統(tǒng)功能紊亂，及時抗凝治療可以有效減少心肌壞死面積，改善預(yù)后[9]。時間生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，AMI大部分發(fā)生于早晨，中樞生物節(jié)律以及外周生物鐘紊亂，會增加心血管疾病的發(fā)生，節(jié)律基因與AMI 發(fā)病密切相關(guān)[10-11]。在大多數(shù)心血管疾病的病理過程中，存在有生物節(jié)律基因和相應(yīng)的鐘控基因的異常表達，而該基因在疾病的病理過程中發(fā)揮各自的作用[12-14]。一般情況下，近日節(jié)律基因變化情況可以反映心血管系統(tǒng)是否正常。

本研究發(fā)現(xiàn)，病例組與對照組clif rs1071592 位點基因型及等位基因頻率分布情況均有差異，rs2583913位點基因型及等位基因頻率分布情況均無差異。表明clif 基因多態(tài)性位點rs1071592 與AMI 存在一定相關(guān)性。TM 與PAI-1 在機體凝血及血栓形成中扮演重要角色，當TM與PAI-1基因表達異常時，機體血凝及抗血栓功能均將失調(diào)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，TM及PAI-1基因表達下調(diào)，機體血凝及抗血栓功能減弱，易導(dǎo)致血管中形成血栓[15]。PAI-1作為鐘控基因產(chǎn)物之一，正常情況下表現(xiàn)出近日節(jié)律。相關(guān)研究表明，clock突變小鼠的纖溶活性較低，且PAI-1無近日節(jié)律[16]。表明，clock基因通過調(diào)控PAI-1來影響機體纖溶系統(tǒng)，進而對凝血系統(tǒng)產(chǎn)生影響。為此，本研究基于上述結(jié)論，推測clif 對PAI-1可能存在類似的調(diào)控機制。為進一步驗證這一推測，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢病毒轉(zhuǎn)染組clif、PAI-1 及TM mRNA 表達水平均低于空白對照組及慢病毒對照組。另外，慢病毒轉(zhuǎn)染組血漿TM、PAI-1 蛋白表達水平均低于空白對照組及慢病毒對照組。表明clif 基因變異可導(dǎo)致TM、PAI-1等鐘控基因的節(jié)律消失，易導(dǎo)致血管中血栓的形成。

綜上所述，節(jié)律基因clif 單核苷酸多態(tài)性位點rs1071592 與老年AMI 患者存在相關(guān)性。節(jié)律基因clif 表達可降低慢病毒干擾小鼠的PAI-1 及TM 表達水平，增加血栓形成風險。本研究為節(jié)律基因在AMI中的作用及機制提供重要實驗依據(jù)。