土大黃對銀屑病小鼠皮膚組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1及神經(jīng)纖維蛋白-1表達(dá)的影響*

熱比姑麗·伊斯拉木，艾西木江·熱甫卡提，阿布都吉力力·阿布都艾尼，阿布都帕塔爾·阿布迪熱扎克，祖力皮卡爾·買買提，玉素甫江·艾力

（新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆 烏魯木齊 830011）

土大黃RumexL．是蓼科Polyonaceae酸模屬Rumex植物，多年生草本，新疆維吾爾自治區(qū)南部區(qū)域農(nóng)村民間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，維吾爾族常用土大黃植物不同部位（根、莖、葉及全草）水煎煮液治療銀屑病等各種皮膚病，且療效較好。2013年至今，本課題組對該藥材進行了顯微鑒別，以及抗炎免疫、治療銀屑病等一系列藥效學(xué)試驗研究［1-4］，也通過動物實驗驗證了土大黃民間用藥的科學(xué)內(nèi)涵。本研究中采用咪喹莫特（IMQ）誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型，通過土大黃干預(yù)，檢測小鼠皮膚組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、神經(jīng)纖維蛋白-1（NRP-1）表達(dá)，旨在探討土大黃對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）免疫抑制功能的影響，為進一步開發(fā)利用民間藥材提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1．1 儀器、試藥與動物

1．1．1 儀器

LEICA TP1020型生物組織脫水機、LEICA RM2235型切片機、LEICA DM4000型生物顯微鏡、LEICA LAS V4．5型顯微成像系統(tǒng)（德國萊卡公司）；KD-BMIII型生物組織包埋機（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司）；KZPG-1A型攤片烤片機（天津天利航空機電有限公司）；LOCUS型烤箱（廣東省中山市諾潔仕電氣有限公司）。

1．1．2 試藥

咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字H20030128，批號為141201）；Silkee脫毛霜（美國Stella Jone′s Inc．公司授權(quán)生產(chǎn)，巴基斯坦制造）；醋酸地塞米松片（DXM，Dexametasone Acetate Tablet，浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H33020822，批號為140670，規(guī)格為每片0．75 mg）。TGF-β1（貨號為bs-0693R，批 號 為AE010840），NRP-1（貨 號 為bs-0086R，批號為909086），均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Tris／EDTA修復(fù)液（貨號為ZLI-9066，批號為WP143310），通用SP試劑盒（貨號為SP-9000，批號為WP142714），DAB kit 20（貨 號 為ZLI-9018，批 號 為K146909E），磷酸鹽緩沖液（PBS，貨號為ZLI-9062，批號為150511），均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；二甲苯（批號為20150302），無水乙醇（批號為20150305），均購自天津永晟精細(xì)化工有限公司。土大黃（批號為12110）由新疆華安中藥飲片有限責(zé)任公司提供，由新疆大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院努爾巴依·阿不都沙力克教授通過顯微鑒別鑒定為正品。

1．1．3 動物

BALB／c小鼠，84只，雌性，SPF級，日齡42～70 d，由新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK（新）2011-0004。動物實驗經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所藥物安全性評價中心［GLP中心，SYXK＜新＞2011-0005］審核，符合新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所動物倫理委員會管理準(zhǔn)則。實驗開始前檢疫，經(jīng)一般行為觀察，選用符合要求的80只小鼠進行實驗。

1．2 方法

1．2．1 土大黃提取物制備

取適量土大黃根，用8倍量的70%乙醇室溫密閉浸泡1 h后回流提取3次，第1次回流2 h，第2次和第3次回流1．5 h，過濾，合并濾液減壓濃縮至浸膏狀，真空干燥，得干膏粉。

1．2．2 IMQ誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型建立［3-9］

將80只BALB／c小鼠分為2組，對照組12只，咪喹莫特誘導(dǎo)模型組68只。背部使用Silkee脫毛霜脫毛，背部涂抹面積約為2．0 cm×1．5 cm。對照組小鼠背部無毛區(qū)域每日涂抹凡士林，模型組小鼠涂抹以5%IMQ乳膏60 mg／d（有效藥物為3 mg／d），連續(xù)6 d。

1．2．3 動物分組及給藥

造模成功后，選用符合要求的60只造模小鼠隨機分為模型組（給予IMQ），DXM（給予DXM 1．02 mg／kg），土大黃根提取物低、中、高劑量組［RE-L組（1 g／kg），RE-M組（2 g／kg），RE-H組（4 g／kg）］，各12只。各給藥組灌胃給予相應(yīng)藥物，灌胃容積均為每10 g體質(zhì)量0．2 mL，1次／日，對照組、模型組灌胃給予等體積的0．5%羧甲基纖維素鈉（0．5%CMC-Na），連續(xù)14 d。小鼠每周測1次體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量變化隨時調(diào)整給藥劑量。

1．2．4 指標(biāo)檢測

1）試劑配制（臨用前配制）

PBS：取1 000 mL（1袋）溶于1 000 mL蒸餾水（1∶1）中，即得。Tris／EDTA修復(fù)液：取10 mL溶于500 mL蒸餾水中（1∶50），即得。DAB顯色劑：將1滴A液（約50μL）溶于1 000μL B液中（1∶200）?？贵w（TGF-β1）：取抗體加PBS，抗體∶PBS為1∶500?？贵w（NRP-1）：取抗體加PBS，抗體∶PBS為1∶500。

2）石蠟切片制作

固定：在研究1中BALB／c小鼠，取背部皮膚組織固定于15%中性福爾馬林；取材：1．5 cm×1．5 cm，厚度不超過0．5 cm；脫水、浸蠟：分別經(jīng)80%乙醇，95%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明2次，浸蠟3次，均1 h；包埋：用液體石蠟；切片：0．3μm厚度切片。

3）免疫組織化學(xué)SP法

檢測皮膚TGF-β1和NRP-1表達(dá)。取上述石蠟切片放入60℃烤箱內(nèi)30 min，融化石蠟。從烤箱中取出后依次放入3份100%二甲苯中脫蠟，每份放置10 min。將脫蠟完畢的切片依次放入100%，95%，85%，75%乙醇中，每次3 min，最后用蒸餾水沖洗干凈，完成水化。將切片置入已配好的EDTA中，微波爐預(yù)熱1 min，調(diào)微波爐加熱檔中高10 min、高5 min進行抗原修復(fù)。室溫冷卻20 min后，PBS清洗3遍，每次3 min。每張切片上滴1滴（約50μL）過氧化物酶阻斷劑，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS，每張切片上滴1滴（約50μL）正常非免疫動物血清，室溫下孵育10 min。除去血清，每張切片上滴1滴（約50μL）一抗（TGF-β1），4℃過夜，PBS沖洗3次，每次3 min，NRP-1和TGF-β1同法。除去PBS，每張切片上滴1滴（約50μL）生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS，每張切片上滴1滴辣根過氧化物酶標(biāo)記物，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS，每張切片上滴2滴（約100μL）新鮮配制的DAB顯色劑，顯微鏡下觀察3～10 min。自來水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，PBS沖洗反藍(lán)。切片依次放入75%，85%，95%，100%乙醇中，每次3 min，脫水干燥，二甲苯透明，干性樹脂封片。

1．2．5 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)［10-11］

以胞外或胞膜有棕黃色顆粒狀沉積為陽性。采用積分法判斷陽性表達(dá)結(jié)果，對陽性細(xì)胞進行計分，將染色強度為無、弱、中、強分別計分為0～3分，再將陽性細(xì)胞比例以≤5%，16%～25%，26%～50%，51%～75%，＞75%分別計分為0～4分，最后綜合評分。

1．2．6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17．0統(tǒng)計學(xué)軟件處理。計數(shù)資料采用Kruskal-walls H，Mann-whitneyU非參數(shù)檢驗進行多組樣品比較，檢驗水準(zhǔn)α＝0．05。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 對IMQ誘導(dǎo)銀屑病模型TGF-β1表達(dá)的影響

TGF-β1細(xì)胞定位細(xì)胞外基質(zhì)，以胞外棕黃色顆粒狀沉積為陽性。與對照組小鼠背部皮膚比較，IMQ誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型組小鼠背部皮膚TGF-β1表達(dá)弱或低表達(dá)（Z＝-2．673，P＜0．01）。與IMQ誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型組比較，RE-M組小鼠背部皮膚TGF-β1表達(dá)升高或增強（Z＝-2．673，P＜0．01）。雖DXM組、RE-L組、RE-H組表達(dá)升高或增強，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z＝-1．263，-1．114，-0．191，P＞0．05）。結(jié)果見圖1。

2．2 對IMQ誘導(dǎo)銀屑病模型NRP-1表達(dá)的影響

NRP-1細(xì)胞定位細(xì)胞膜，以胞膜有棕黃色顆粒狀沉積為陽性。與對照組小鼠背部皮膚比較，模型組小鼠背部皮膚NRP-1表達(dá)弱或低表達(dá)（Z＝-2．309，P＜0．05）；與模型組比較，DXM組小鼠背部皮膚NRP-1表達(dá)升高或增強（Z＝-2．018，P＜0．05），RE-M組和RE-H組表達(dá)升高或增強（Z＝-2．439，-2．309，P＜0．05）；雖RE-L組表達(dá)升高或增強，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z＝-1．300，P＞0．05）。結(jié)果見圖2。

3 討論

銀屑病的觸發(fā)因素和發(fā)病機制尚未完全明確，目前認(rèn)為其是一種多基因遺傳背景下的免疫性疾病，其中T淋巴細(xì)胞免疫功能的紊亂是發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，且與皮損的發(fā)生、發(fā)展和持續(xù)存在密切相關(guān)。Treg細(xì)胞是維持機體免疫耐受的主要調(diào)節(jié)細(xì)胞，能選擇性地抑制一些效應(yīng)性T細(xì)胞（Th17細(xì)胞）和自身反應(yīng)性T細(xì)胞活化，主要通過細(xì)胞接觸機制或抑制性細(xì)胞因子TGF-β1發(fā)揮主動免疫抑制作用［12-14］。尋常型銀屑病患者局部皮損組織中Th17細(xì)胞反應(yīng)增強，Treg細(xì)胞的免疫抑制功能減弱，證實了在尋常型銀屑病局部皮損組織中存在Th17／Treg細(xì)胞的失衡［15-17］。表明銀屑病的發(fā)病與效應(yīng)性T細(xì)胞和自身反應(yīng)性T細(xì)胞的持續(xù)激活，缺乏有效的免疫抑制機制有關(guān)，提示銀屑病患者機體可能存在Treg細(xì)胞數(shù)量減少或功能障礙。通過抑制Th17細(xì)胞的活化及其細(xì)胞因子的表達(dá)，適當(dāng)上調(diào)Treg細(xì)胞免疫功能，有助于銀屑病的轉(zhuǎn)歸。

圖1 土大黃提取物對IMQ誘導(dǎo)銀屑病模型TGF-β1表達(dá)的影響（背部皮膚，×400）

圖2 土大黃提取物對IMQ誘導(dǎo)銀屑病模型NRP-1表達(dá)的影響（背部皮膚，×400）

CD4＋CD25＋Treg是目前研究得較多的一種亞型，其數(shù)量和功能異常是人類和動物自身免疫性疾病和其他炎性疾病的重要原因，其分子表面表達(dá)TGF-β1、白細(xì)胞介素10（IL-10）、NRP-1等膜分子，具有免疫抑制和免疫無能作用。研究表明，CD4＋CD25＋Teg通過膜相關(guān)TGF-β1發(fā)揮免疫抑制功能，Nrp-1能增強其共同表達(dá)的TGF-β1，從而起到免疫抑制作用［12-17］。銀屑病外周血和從皮損分離的CD4＋CD25＋Treg的抑制能力均減弱，而反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖活性過強［18-23］，提示Treg的抑制作用減弱使致病的T細(xì)胞增生，可能導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)。

本研究中TGF-β1檢測結(jié)果表明，小鼠局部皮損組織Treg細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能降低，導(dǎo)致局部皮膚組織Th17／Treg細(xì)胞失衡，導(dǎo)致引起銀屑病表皮免疫功能紊亂。與模型組比較，RE-M組TGF-β1表達(dá)升高或增強，表明RE-M能使局部皮膚組織Treg細(xì)胞免疫向上調(diào)節(jié)，使得恢復(fù)局部皮膚組織Th17／Treg細(xì)胞失衡，改善銀屑病表皮免疫功能紊亂。雖然DXM組、RE-L組、RE-H組能使TGF-β1表達(dá)升高或增強，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），提示上述藥物對小鼠局部皮損組織Treg細(xì)胞功能調(diào)節(jié)無明顯影響。NRP-1檢測結(jié)果表明，小鼠局部皮損組織Treg細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能降低，導(dǎo)致局部皮膚組織Th17／Treg細(xì)胞失衡，以引起銀屑病表皮免疫功能紊亂。與模型組比較，DXM組、RE-M組、RE-H組均能使NRP-1表達(dá)升高或增強（P＜0．05），提示上述藥物均能使局部皮膚組織Treg細(xì)胞免疫向上調(diào)節(jié)，使得恢復(fù)局部皮膚組織Th17／Treg細(xì)胞失衡，能改善銀屑病表皮免疫功能紊亂。RE-L組NRP-1差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），提示上述藥物對小鼠局部皮損組織Treg細(xì)胞功能調(diào)節(jié)無明顯影響。

綜上所述，IMQ誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型皮損中存在Th17／Treg細(xì)胞失衡，引起IL-23／IL-17軸失衡，效應(yīng)性T細(xì)胞功能活躍，Treg細(xì)胞免疫抑制功能減弱，最終導(dǎo)致免疫功能紊亂而引起疾病。通過土大黃干預(yù)能使小鼠背部皮膚組織TGF-β1和NRP-1表達(dá)升高，表明土大黃提取物能促進或增強Treg細(xì)胞功能，抑制效應(yīng)性T細(xì)胞和自身反應(yīng)性T細(xì)胞引起的免疫反應(yīng)，恢復(fù)Th17／Treg細(xì)胞失衡，調(diào)節(jié)IMQ誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型IL-23／IL-17軸，從而改善銀屑病表皮免疫功能紊亂，具有抗銀屑病作用［12-23］。