YY1通過轉(zhuǎn)化生長因子β1信號軸在滋養(yǎng)細(xì)胞功能調(diào)控中的探索

鮮舒，王艷清，程艷香

適當(dāng)?shù)呐吲葜踩牒吞ケP發(fā)育，對于成功妊娠是一個復(fù)雜而關(guān)鍵的過程。在正常妊娠期間，滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、分化并侵入子宮蛻膜，并伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)降解和子宮螺旋動脈重塑，確保胚胎有足夠的血液供應(yīng)。滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤不足或子宮脈管系統(tǒng)重塑失敗與妊娠并發(fā)癥相關(guān)，如流產(chǎn)和胎兒生長受限等[1-2]。

不明原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent miscarriage）是常見的妊娠并發(fā)癥。近年來，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生率為1%~5%，而約40%~60%的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者病因尚不明確[3]。目前已有的肝素、被動免疫和孕酮等療法未能有效改善其妊娠結(jié)局[4-6]，對家庭和社會人口健康都造成了嚴(yán)重不良影響。因此，更好地了解人類滋養(yǎng)細(xì)胞功能的調(diào)控和機制，對改善不孕癥和妊娠障礙的診治非常重要。

滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲是一個受到嚴(yán)格調(diào)控的過程，受細(xì)胞因子、生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)的成分等影響[7]。Yin Yang-1（YY1）是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，參與胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等過程的調(diào)節(jié)[8-9]。Tian等[10]的研究初步揭示了YY1-基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）在滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲中全新的調(diào)節(jié)途徑，認(rèn)為滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和侵襲類似于腫瘤轉(zhuǎn)移。Yan等[11]的研究表明，YY1可通過轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）信號通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。TGF-β家族由同種型TGF-β1、-β2和-β3組成，且以組織特異性方式表達(dá)[12]。TGF-β1在各種生理病理過程中具有多功能的作用，且TGF-β1能抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力[13-15]。

迄今為止，YY1是否能夠調(diào)控人滋養(yǎng)層細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)，TGF-β1是否介導(dǎo)了YY1對人滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲的抑制作用仍是未知。本研究結(jié)果證實了YY1可以通過TGF-β1信號通路調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的活性、侵襲和遷移能力，可能參與胚胎的著床和胎盤發(fā)育，致使流產(chǎn)的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 研究材料 人滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8/SVneo，購自武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司（ASPEN）。小干擾RNA（siRNA）——YY1以及陰性對照由廣州市銳博生物科技有限公司構(gòu)建；轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；胎牛血清、DMEM F12培養(yǎng)液購自HyClone公司；TGF-β抑制劑SD-208購自 Selleck 公司；Trans-well小室（Corning，3422）；光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，IX51）、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（Life technologies，StepOneTM Real-Time PCR System）。提取 RNA的Trizol購自 Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ELK Biotechnology公司，貨號EQ002）；實時熒光定量PCR引物由TaKaRa公司設(shè)計并合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 HTR8/SVneo細(xì)胞培養(yǎng)于含P/S抗生素、10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，每24 h換1次。將細(xì)胞按4×105/孔接種在6孔板，待融合度達(dá)60%~70%時進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染48 h。轉(zhuǎn)染分組：YY1敲低（siYY1）和正常表達(dá)（陰性對照，NC）組，靶序列分別如下。siYY1-1：5’-CGACGACTACATTGAACAA-3’；siYY1-2：5’-CAAAGATGTTCAGGGATAA-3’；siYY1-3：5’-GAACTCACCTCCTGATTAT-3’。藥物處理分組：NC 組、siYY1組和 siYY1+SD-208（TGF-β抑制劑，1 μmol/L，48 h）組。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測各組中基因的表達(dá)情況 用Trizol試劑抽提總RNA，用紫外分光光度計和2%的瓊脂糖凝膠測定其純度、濃度和完整性。用M-MLV Reverse Transcriptase合成cDNA。使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒，在StepOne?Real-Time PCR儀上進(jìn)行檢測，3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。引物序列見表1。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）檢測各組蛋白的表達(dá)水平 分別提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育和二抗孵育，最后應(yīng)用ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測蛋白表達(dá)情況，采用AlphaEaseFC軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值。實驗重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.2.4 CCK-8細(xì)胞活性實驗 將對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×104細(xì)胞/孔鋪96孔板，24 h細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)液，加入100 μL含藥培養(yǎng)基，對照為藥物溶劑的培養(yǎng)基，空白為無細(xì)胞培養(yǎng)液孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，所有孔中加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育1 h。酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度，并計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率＝（OD實驗組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）×100%。每個樣品均做3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 劃痕遷移實驗 在6孔板背后每孔均勻畫3條平行線，橫穿過孔。將2.5×105細(xì)胞/孔接種24 h貼壁長滿后，用槍頭垂直于預(yù)先畫的橫線劃掉細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕漂洗后加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、12、24 h取出孔板，拍照。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 Trans-well侵襲實驗 無菌條件下，取50 μL matrigel和培養(yǎng)基的1∶3比例稀釋液，均勻鋪于Trans-well小室上層后干燥過夜。將200 μL 105個/mL處理后的細(xì)胞懸液（無血清培養(yǎng)液）加入Trans-well小室中，再將小室放入每孔500 μL完全培養(yǎng)基的24孔板中，37℃下培養(yǎng)24 h。將小室取出，無菌棉簽擦去上室內(nèi)的基質(zhì)膠和細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察5個視野中穿膜細(xì)胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法。所有檢驗均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YY1調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞活性、遷移和侵襲能力 為揭示YY1參與流產(chǎn)發(fā)生的具體分子機制，構(gòu)建了siYY1作用于滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/SVneo，驗證對滋養(yǎng)細(xì)胞的影響。如圖1A所示，在構(gòu)建的3條siRNA中，siYY1-3效率最高，用于后續(xù)實驗。實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑相關(guān)基因MMP-2和MMP-9表達(dá)顯著降低，而TIMP1和TIMP2表達(dá)顯著增加（見圖1B）。進(jìn)一步檢測細(xì)胞功能發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性、細(xì)胞遷移和侵襲能力都明顯減弱（見圖1C～E）。以上結(jié)果都證實了YY1對于滋養(yǎng)細(xì)胞功能的重要作用。

2.2 YY1調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞TGF-β1信號通路相關(guān)基因的表達(dá) 為了揭示YY1與TGF-β1的關(guān)系，運用GTRD （Gene Tranion Regulation Database，http://gtrd.biouml.org/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子與靶基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)YY1在TGF-β1基因上有多位點結(jié)合，見圖2A（見封三）。進(jìn)一步進(jìn)行Real-Time PCR和Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，在滋養(yǎng)細(xì)胞中敲低YY1后，TGF-β1信號通路相關(guān)分子TGF-β1、Smad2和Smad3的表達(dá)都顯著增高，而抑制性Smad7的表達(dá)卻降低（見圖2B和2C，見封三）。提示YY1可能直接通過TGF-β1信號通路相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的功能。

2.3 YY1可能通過TGF-β1信號通路調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移能力 為了驗證上述結(jié)果，本研究在滋養(yǎng)細(xì)胞中敲低YY1后使用TGF-β特異性抑制劑SD-208處理細(xì)胞，隨后進(jìn)行細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低YY1能顯著降低細(xì)胞的遷移能力，而用TGF-β抑制劑SD-208處理后能夠顯著改善細(xì)胞的遷移能力（見圖3）。這種抑制劑的反轉(zhuǎn)作用說明YY1可能通過TGF-β1信號通路發(fā)揮對滋養(yǎng)細(xì)胞功能的調(diào)控作用。

圖1 YY1調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞活性、遷移和侵襲能力

圖2 YY1調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞TGF-β1信號通路相關(guān)基因的表達(dá)

圖3 YY1通過TGF-β1信號通路調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移能力

圖4 YY1通過TGF-β1信號通路調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力和細(xì)胞活性

2.4 YY1通過TGF-β1信號通路調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力和細(xì)胞活性 運用預(yù)先matrigel處理的Trans-well小室檢測細(xì)胞的侵襲能力。敲低YY1后細(xì)胞的侵襲能力和細(xì)胞活性顯著降低，而用TGF-β抑制劑SD-208處理后，細(xì)胞侵襲能力和細(xì)胞活性顯著增強（見圖4，見封三）。

3 討論

滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲被精確調(diào)控，這是胚胎成功植入和胎盤發(fā)育的先決條件，然而復(fù)雜的分子機制尚未完全揭示。TGF-β1及其受體在人滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)，并調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞功能[16]，且在絨毛膜癌中TGF-β1和TβRI的水平顯著降低，表明TGF-β信號傳導(dǎo)途徑的紊亂可能是導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞惡變的因素[17]。與先前研究結(jié)果[18]一致，本文筆者所在課題組的實驗結(jié)果也證實了TGF-β1可以改變MMP的表達(dá)來抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲。TGF-β1可通過多種信號傳導(dǎo)途徑抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲，但其上游信號傳導(dǎo)途徑仍不明確。滋養(yǎng)細(xì)胞顯示出與惡性腫瘤細(xì)胞相似的表型，本研究發(fā)現(xiàn)YY1敲低可以上調(diào)TGF-β1表達(dá)，且人滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲能力被顯著抑制，而使用TGF-β1抑制劑可逆轉(zhuǎn)siYY1對滋養(yǎng)細(xì)胞活性、遷移和侵襲的抑制作用。這提示了YY1-TGF-β1信號通路調(diào)控人滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲的新機制。在本研究中，由YY1-TGF-β1信號通路調(diào)節(jié)的侵襲抑制與MMP-2和MMP-9表達(dá)的降低相關(guān)。TIMP是組織中MMP活性的主要內(nèi)源性抑制劑，YY1敲低顯著增加了滋養(yǎng)細(xì)胞中TIMP1和TIMP2的表達(dá)，其反過來抑制MMP-2/9活性并減少滋養(yǎng)層侵襲。這些結(jié)果提示了YY1-TGF-β1可能是通過影響MMP的活性來發(fā)揮對滋養(yǎng)細(xì)胞功能的調(diào)控作用。

TGF-β通過獲得性免疫耐受在外周免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用[19-21]。耐受性對于預(yù)防不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)至關(guān)重要，且是子宮免疫環(huán)境的重要組成部分，能夠使胚胎成功植入和維持正常妊娠狀態(tài)。TGF-β可以抑制對妊娠有害的T輔助細(xì)胞1型（Th1）反應(yīng)[22]，并且阻斷TGF-β信號傳導(dǎo)可以增強胎兒NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的反應(yīng)[23]。因此，來自子宮內(nèi)膜和滋養(yǎng)層細(xì)胞的內(nèi)源性TGF-β的平衡狀態(tài)可能有助于建立抗排斥策略從而允許半同種異體胚胎植入。因此，YY1-TGF-β1信號通路是否在母胎界面的免疫耐受環(huán)境的建立中發(fā)揮作用需要進(jìn)一步探索。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)YY1可以調(diào)節(jié)人滋養(yǎng)層細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)，并證明YY1-TGF-β1信號通路參與調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞活性、遷移和侵襲，滋養(yǎng)層侵襲能力的減弱可能與MMPs活性的降低有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)證明了YY1-TGF-β1調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞功能的新機制，也為不明原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等妊娠相關(guān)疾病的診治提供了新策略。