ABC294640抑制卵巢癌侵襲及轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究

宋柯琦，戴嵐，田琦，狄文

卵巢癌發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，目前在發(fā)達(dá)國(guó)家卵巢癌發(fā)病率高達(dá)9.1/10萬(wàn)，在發(fā)展中國(guó)家也達(dá)到5.0/10萬(wàn)[1]。2017年美國(guó)約有22 440例卵巢癌新發(fā)病例而死亡病例數(shù)為14 080例[2]。根據(jù)國(guó)內(nèi)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我國(guó)每年約有52 100例患者被新確診為卵巢癌，約22 500例患者死于卵巢癌[3]。卵巢癌侵襲性高，易對(duì)化療耐藥，因此迫切需要尋找合理有效的治療靶點(diǎn)和治療手段以抑制卵巢癌的轉(zhuǎn)移，這也是提高卵巢癌患者生存率、延長(zhǎng)生存期的關(guān)鍵。鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SphK）作為鞘磷脂代謝途徑中的關(guān)鍵限速酶，作為腫瘤治療新靶點(diǎn)已被廣泛研究。磷脂作為重要的信號(hào)分子，參與調(diào)節(jié)許多關(guān)鍵的細(xì)胞功能。SphK失活導(dǎo)致S1P前體的積累，抑制特定原癌基因活性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)停滯。通過針對(duì)SphK1、SphK2作為靶點(diǎn)的抑制劑來調(diào)節(jié)Cer/S1P轉(zhuǎn)換為腫瘤的治療提供了一個(gè)新思路。Safingol作為靶向SphK1、SphK2以及蛋白激酶C的非特異性抑制劑，已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段，但其有一定的肝臟毒性[4]。2010年美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）已批準(zhǔn)唯一一種鞘脂類代謝通路中的藥物是Fingolimod（FTY720），該藥是一種S1P受體調(diào)節(jié)劑，在多發(fā)性硬化患者中能阻止淋巴細(xì)胞的再循環(huán)，降低復(fù)發(fā)率。同時(shí)，F(xiàn)ingolimod也能抑制SphK1活性，并在多項(xiàng)臨床前研究中被證明具有抑制腫瘤的作用，但其對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用卻對(duì)腫瘤的治療過程產(chǎn)生了不利影響[5]。因此仍需探索新的腫瘤治療的有效藥物。ABC294640最初由美國(guó)Apogee Biotechnology公司研發(fā)，全稱為3-（4-氯苯基）金剛烷-1-羧酸（吡啶-4-基甲基）酰胺，化學(xué)式為C23H25C1N2O，是一種靶向SphK2的小分子抑制劑。本研究致力于探索ABC294640對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 ABC294640購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。一抗c-Myc單克隆兔抗人抗體、一抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆鼠抗人抗體采購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，二抗羊抗兔抗體、二抗羊抗鼠抗體購(gòu)自美國(guó)LICOR公司。細(xì)胞組織蛋白裂解液、蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白免疫印跡（Western blotting）所用一抗稀釋液采購(gòu)于江蘇碧云天生物技術(shù)公司。聚偏二氟乙烯膜（PVDF，0.45 μmol）、電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯影試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。Transwell小室及24孔培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。Matrigel基質(zhì)膠采購(gòu)于美國(guó)BD公司。ABC294640用二甲基亞砜（DMSO）配制成100 mmol/L儲(chǔ)存（實(shí)驗(yàn)時(shí)DMSO終濃度小于0.2%）。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人源性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和HO8910由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心購(gòu)買取得，保存于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院上海市婦科腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃，5%的CO2條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合度時(shí)用胰蛋白酶消化傳代。

1.3 動(dòng)物及飼養(yǎng) 6～8周，體質(zhì)量16～18 g的SPF級(jí)BALB/c雌性裸鼠購(gòu)買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)在仁濟(jì)醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室內(nèi)溫度22℃，12 h光照周期，自由飲食飲水，動(dòng)物飼養(yǎng)及管理參照上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物房管理?xiàng)l例。

1.4 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) ABC294640 50 μmol作用于SKOV3和HO8910細(xì)胞2 h后，消化細(xì)胞磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后用無(wú)血清DMED培養(yǎng)基重懸至2.5×105/mL。取100 μL加入在24孔Transwell小室上室，下層培養(yǎng)孔加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。37℃、5%CO2孵育箱孵育24 h。從孵育箱中取出24孔板，將Transwell小室在PBS中輕柔洗滌2遍，小室浸入95%乙醇中固定5 min。PBS再次洗滌后，用棉簽輕擦，拭去膜上未穿過細(xì)胞。細(xì)胞固定風(fēng)干，置于0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗去多余結(jié)晶紫。將已固定、染色、清洗后的Transwell小室放置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。每張膜隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野（×400），計(jì)數(shù)穿過小室底膜細(xì)胞數(shù)目，取平均值，以穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)表示各組細(xì)胞的遷移能力。每次實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel膠與無(wú)血清的培養(yǎng)基以1∶3稀釋均勻混合，取50 μL均勻平鋪于Transwell小室上室底膜，37℃溫箱靜置30 min。清洗上室后，加入50 μL含血清的培養(yǎng)基，37℃孵育箱中靜置30 min。ABC294640 50 μmol作用SKOV3和HO8910細(xì)胞2 h后，消化細(xì)胞PBS洗滌后用無(wú)血清DMED培養(yǎng)基重懸至2.5×105/mL。取100 μL加入24孔Transwell小室上室，下層培養(yǎng)孔加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。37℃、5%CO2孵育箱孵育24 h。培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室上室，擦掉小室內(nèi)表面未穿過膜的細(xì)胞，固定后結(jié)晶紫染色。將已固定、染色、清洗后的Transwell小室放置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。每張膜隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野（×400），計(jì)數(shù)穿過小室底膜細(xì)胞數(shù)目，取平均值，以穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)表示各組細(xì)胞的侵襲能力。每次實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blotting法檢測(cè) 收集不同處理細(xì)胞，然后用RIPA裂解液裂解細(xì)胞收集蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加5×上樣緩沖液混勻后100℃，10 min變性。將等量蛋白上樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，用含5%BSA的TBST室溫封閉1 h，用TBST充分洗滌后，加特異一抗，4℃孵育。過夜用TBST充分洗滌后加對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，充分洗滌后，滴上ECL發(fā)光液充分顯影。將GAPDH蛋白作為內(nèi)參。

1.7 腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型建立及實(shí)驗(yàn)干預(yù) 胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞，離心后PBS洗滌2次，計(jì)數(shù)重懸細(xì)胞，低溫放置。隨機(jī)將裸鼠分為2組；每只裸鼠腹腔內(nèi)注射2.5×106個(gè)細(xì)胞/200 μL。腹腔注射腫瘤細(xì)胞1周后，予以每周2次腹腔注射藥物（ABC294640 50 mg/kg）或者相同濃度DMSO配置PBS溶液。給藥后第28天以頸椎脫臼法處死小鼠，解剖小鼠后，剔除所有腹腔內(nèi)的轉(zhuǎn)移腫瘤。計(jì)數(shù)腫瘤數(shù)目，留取每只小鼠轉(zhuǎn)移瘤中最大者，以石蠟包埋進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)裸鼠腹腔腫瘤組織中c-Myc的表達(dá) 裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移瘤組織經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、切片后常規(guī)脫蠟水化，按照二步法試劑盒所示的操作步驟進(jìn)行，切片經(jīng)脫水、透明、封片、鏡檢。在低倍鏡下隨機(jī)選取相同大小的視野拍照，分析腫瘤組織中c-Myc表達(dá)情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABC294640對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響

2.1.1 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 在SKOV3細(xì)胞中，ABC294640藥物組和對(duì)照組穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)分別為（22.33±5.13）個(gè)和（41.67±7.02）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，t=16.086，P＜0.01）。在HO8910細(xì)胞中，ABC294640藥物組和對(duì)照組穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)分別為（22.67±14.64）個(gè)和（63.33±14.64）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，t=7.330，P＜0.05）。ABC294640作用于卵巢癌細(xì)胞后，細(xì)胞的侵襲能力顯著下降。見圖1（見后插二）。

圖1 Transwell小室檢測(cè)ABC294640對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲的作用

2.1.2 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 在SKOV3細(xì)胞中，ABC294640藥物組、對(duì)照組穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)分別為（42.67±6.43）個(gè)和（101.33±12.58）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （n=3，t=13.538，P＜0.001）。在HO8910細(xì)胞中，ABC294640藥物組和對(duì)照組穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)分別為（55.67±12.22）個(gè)和（103.67±10.51）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，t=27.713，P＜0.01）。ABC294640作用于卵巢癌細(xì)胞后，細(xì)胞的遷移能力顯著下降。見圖2（見后插二）。

圖2 Transwell小室檢測(cè)ABC294640對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲的作用

2.2 ABC294640對(duì)體內(nèi)卵巢癌轉(zhuǎn)移的影響 裸鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（ABC294640）及對(duì)照組（Vehicle組），每組6只，分別腹腔成瘤，1周后開始腹腔內(nèi)注射用藥（用藥組予以ABC294640 50 mg/kg腹腔注射，對(duì)照組予以注射溶劑濃度DMSO溶液）。2組成瘤率為100%。成瘤35 d后，觀測(cè)小鼠行動(dòng)遲緩，反應(yīng)不靈敏，消瘦，部分小鼠腹部膨隆，但未見死亡。解剖小鼠，見小鼠腹腔內(nèi)散在大小不等的轉(zhuǎn)移瘤，腸系膜、橫膈下、肝臟、盆腹腔等均可見轉(zhuǎn)移瘤。解剖小鼠后，2組腹腔轉(zhuǎn)移瘤對(duì)比情況見圖3A。實(shí)驗(yàn)組裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（4.00±1.41 vs.7.33±1.87，n=6，t=3.492，P＜0.01）。見圖3（見后插二）。

圖3 對(duì)照組與ABC294640組裸鼠腹腔移植瘤情況

2.3 ABC294640作用對(duì)c-Myc表達(dá)的影響 Western blotting結(jié)果表明在體外ABC294640作用后卵巢癌細(xì)胞中c-Myc表達(dá)顯著下降（SKOV3:n=3，t=35.940，P＜0.01；H08910:n=3，t=21.072，P＜0.01） 見圖 4A（見后插二）。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)裸鼠腹腔腫瘤組織中c-Myc蛋白表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比ABC294640藥物作用后腫瘤組織中c-Myc表達(dá)率顯著下降[（7.76±0.72）%vs.（16.65±2.00）%，P＜0.01]，見圖 4B（見后插二）。

圖4 ABC294640作用對(duì)c-Myc表達(dá)水平的調(diào)控

3 討論

近年隨著各項(xiàng)治療技術(shù)不斷發(fā)展，卵巢癌的5年生存率并無(wú)明顯改善，其中卵巢癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者治療效果不佳和高死亡率的主要原因之一。卵巢癌在發(fā)現(xiàn)時(shí)多屬晚期，根治性切除機(jī)會(huì)少，術(shù)后極易發(fā)生局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致卵巢癌患者生存時(shí)間短，死亡率高居?jì)D科惡性腫瘤首位。卵巢癌轉(zhuǎn)移起源于一系列基因和表觀遺傳變化，這些變化能在分子水平上激活原癌基因并使抑癌基因失活，此過程涉及多級(jí)分子機(jī)制調(diào)控，是一個(gè)復(fù)雜的、多因素調(diào)控的動(dòng)態(tài)過程。探索卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移能力的分子調(diào)控機(jī)制，尋找腫瘤轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)和治療的新方法已成為卵巢癌基礎(chǔ)研究與臨床研究的熱點(diǎn)。

SphK2在多種腫瘤中被證實(shí)處于過表達(dá)狀態(tài)，并且在甲狀腺癌、結(jié)腸癌和膀胱癌中對(duì)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移能力起促進(jìn)作用[6-9]。在乳腺癌、肺癌和淋巴瘤等的研究中，研究已證實(shí)針對(duì)SphK的特異性抑制劑ABC294640能通過抑制磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（pERK）、磷酸化蛋白激酶 B（pAKT）、核因子 κB（NF-κB）等通路抑制S1P生成，增加細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺積累，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬和凋亡，最終抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖和抑制腫瘤細(xì)胞遷移。本課題組也發(fā)現(xiàn)ABC294640能顯著抑制卵巢癌增殖[10]，但對(duì)于ABC294640對(duì)卵巢癌的轉(zhuǎn)移所起的作用卻鮮有報(bào)道。本研究從體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)的角度探索了ABC294640對(duì)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，發(fā)現(xiàn)在體外Transwell實(shí)驗(yàn)中ABC294640作用后，SKOV3和HO8910細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)都顯著下降；在體內(nèi)試驗(yàn)中，裸鼠腹腔注射ABC294649后轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目減小。提示了ABC294640作用后能顯著抑制卵巢癌的轉(zhuǎn)移能力。

在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中涉及眾多基因的表達(dá)異常，其中轉(zhuǎn)錄因子c-Myc異常表達(dá)能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化狀態(tài)，并且增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。在惡性腫瘤中，c-Myc對(duì)許多腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為：包括細(xì)胞惡性增殖、轉(zhuǎn)移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤血管生成等均有促進(jìn)作用[11]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)c-Myc在卵巢癌細(xì)胞中處于過表達(dá)狀態(tài)，并且c-Myc高表達(dá)能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞無(wú)限增殖，同時(shí)對(duì)腫瘤早期轉(zhuǎn)移、化療耐藥等特點(diǎn)具有促進(jìn)作用[12-14]。有研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)c-Myc能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力[15-16]。另有研究表明調(diào)控鞘磷脂代謝軸能夠通過改變c-Myc的表達(dá)水平而調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力[17]。在此基礎(chǔ)上，本研究為了揭示ABC294640抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的原因，進(jìn)一步檢測(cè)了藥物作用后細(xì)胞中c-Myc的蛋白水平變化，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示ABC294640作用后，卵巢癌中c-Myc蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示ABC294640可能通過調(diào)控c-Myc蛋白表達(dá)而影響卵巢癌的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。由于目前尚沒有直接針對(duì)c-Myc作為靶標(biāo)的藥物，消除c-Myc的促癌作用中最可行的方法是靶向抑制上游調(diào)節(jié)因子以降低c-Myc的表達(dá)和活性，因此在卵巢癌中ABC294640能夠抑制腫瘤中c-Myc的表達(dá)，對(duì)于尋找卵巢癌潛在新的治療途徑具有重要的意義。可見，ABC294640能下調(diào)c-Myc的表達(dá)，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。但是對(duì)于ABC294640在卵巢癌中對(duì)生物學(xué)行為調(diào)控的具體分子機(jī)制和調(diào)控方法還需要進(jìn)一步研究。完善ABC294640在卵巢癌中的分子作用機(jī)制研究能為今后探索卵巢癌新的治療方法奠定基礎(chǔ)。

ABC294640針對(duì)腫瘤的研究已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。第一個(gè)ABC294640在晚期實(shí)體瘤患者中的Ⅰ期臨床試驗(yàn)已經(jīng)完成[18]。Ⅰ期臨床研究證明了ABC294640在不同類型腫瘤中的治療潛力，包括肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌和肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病等。目前還有多項(xiàng)ABC294640的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，包括肝細(xì)胞癌（NCT02939807）、復(fù)發(fā)/難治性彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（NCT02229981）和難治性/復(fù)發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤（NCT02757326）等。

綜上，本研究從體內(nèi)、體外兩方面證明ABC294640靶向SphK2可有效抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移，為靶向SphK2的藥物ABC294640成為卵巢癌治療新途徑提供了可靠的理論依據(jù)。