膜聯(lián)蛋白A8在卵巢上皮性漿液性腫瘤中的表達(dá)及臨床意義

朱連成，勾睿，郭騫，李瀟，劉娟娟，于冠楠，郝瑩瑩，嚴(yán)麗梅，金山，林蓓

上皮性卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其死亡率最高、預(yù)后最差，大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是晚期，目前尚缺乏早期診斷的可靠生物學(xué)標(biāo)記物，其中上皮性漿液性癌是最常見的病理類型，因此探尋卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等機(jī)制可為卵巢癌早期診斷、綜合治療提供新的方法及治療靶點(diǎn)[1]。膜聯(lián)蛋白（Annexin）是一類至少12種基因編碼的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白家族，廣泛參與了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞吞及胞外分泌、細(xì)胞分化、凋亡、鈣離子通道形成、生長(zhǎng)發(fā)育和抗凝血反應(yīng)等[2]。近些年來發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白A參與了肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸鱗癌、卵巢癌等的侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成、耐藥等[3-6]。作為膜聯(lián)蛋白家族成員之一，膜聯(lián)蛋白 A8（Annexin A8，ANXA8）參與急性早幼粒細(xì)胞白血病[7]、胰腺癌[6,8-9]、乳腺癌[10-11]等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。但迄今為止，ANXA8在卵巢腫瘤中的表達(dá)情況及與上皮性卵巢癌相關(guān)性的研究國(guó)內(nèi)外少見報(bào)道。本研究擬利用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶連結(jié)法（SP法）檢測(cè)ANXA8在正常卵巢、卵巢漿液性良性腫瘤、卵巢漿液性交界性腫瘤和卵巢漿液性癌組織中的表達(dá)情況，探討其與卵巢上皮性漿液性癌患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系及預(yù)后的相關(guān)性，為深入研究ANXA8對(duì)卵巢癌生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制提供前期理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院（我院）婦科2008—2012年住院患者手術(shù)切除的卵巢組織石蠟標(biāo)本共75例，所有組織切片病理診斷均由我院病理科專家完成，其中正常卵巢組織組11例（來源于因罹患子宮肌瘤或?qū)m頸癌無生育要求而切除全子宮雙附件者），卵巢漿液性良性腫瘤組13例，卵巢漿液性交界性腫瘤組17例，卵巢漿液性惡性腫瘤組34例（均為原發(fā)性腫瘤，術(shù)前均未行放化療、生物或激素治療，術(shù)中均行全面分期探查術(shù)或卵巢癌腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，術(shù)后隨訪資料完整）。所有患者術(shù)前均簽署知情同意書。

所有患者中位年齡50.0（43，61）歲，其中正常卵巢組織組中位年齡44.0（40，51）歲，卵巢漿液性良性腫瘤組中位年齡50.0（45，57）歲，卵巢漿液性交界性腫瘤組中位年齡43.0（35，51）歲，卵巢漿液性惡性腫瘤組中位年齡58.5（48，63）歲，各組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.985，P=0.124）。卵巢漿液性惡性腫瘤組中年齡＜60歲者19例；根據(jù)組織病理分化分級(jí)：高－中分化及低分化分別為20例和14例；按照2009年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）臨床病理學(xué)分期標(biāo)準(zhǔn)分期：FIGOⅠ期5例，Ⅱ期5例，Ⅲ期23例，Ⅳ期1例；盆腔和（或）腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者11例；盆腹腔殘余病灶直徑＞1 cm者17例。

1.2 主要試劑 兔抗人ANXA8多克隆抗體購自Abcam公司（Cambridge，英國(guó)），免疫組織化學(xué)試劑盒購自福州邁新生物工程公司，其他試劑及設(shè)備由我院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 檢測(cè)方法 所有卵巢組織標(biāo)本均采用5 μm連續(xù)切片，采用SP法檢測(cè)ANXA8的表達(dá)。兔抗人ANXA8抗體的工作濃度為1∶75。每批切片中均設(shè)陽性和陰性對(duì)照，陽性對(duì)照使用結(jié)腸癌組織，陰性對(duì)照使用以磷酸鹽緩沖液（PBS）替代一抗染片。染色方法按SP試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 隨機(jī)選取切片中5個(gè)高倍視野，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)、細(xì)胞膜上有棕黃色顆粒著色為陽性。按照著色強(qiáng)度分為不著色、淡黃、棕黃、棕褐，分別計(jì)分為 0、1、2、3 分；觀察著色細(xì)胞所占整張切片組織的百分比為0%～5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%，分別計(jì)分為 0、1、2、3、4 分；兩項(xiàng)相乘得到該切片最終評(píng)分，0～2、3～4、5～8、9～12分并分別標(biāo)記為－、+、++、+++，其中+++及++認(rèn)為是高表達(dá)，+及－認(rèn)為是低表達(dá)。實(shí)驗(yàn)閱片過程中，為了控制誤差，由2位研究者分別獨(dú)立閱片，當(dāng)出現(xiàn)結(jié)果不一致時(shí)由第3位研究者再次閱片并集體討論判斷。

1.5 隨訪 用住院資料及電話聯(lián)系的方法對(duì)所有卵巢漿液性惡性腫瘤組患者進(jìn)行隨訪。末次隨訪日期為2017年9月30日，計(jì)算患者的總生存時(shí)間（OS），OS指自手術(shù)日期開始至患者因疾病死亡或至隨訪截止時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0和Graph Pad Prism 8.0.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖片制作。定量資料正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)（M）和百分位數(shù)（P25，P75）表示，采用秩和檢驗(yàn)。定性資料用例（%）表示，組間比較用卡方檢驗(yàn)；不符合卡方檢驗(yàn)條件的數(shù)據(jù)用Fisher確切概率法。多組間等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier法，以Log-Rank法分別對(duì)各種臨床病理參數(shù)進(jìn)行單因素分析，用Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANXA8在各組卵巢組織中的表達(dá) ANXA8以細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)著色為主，在各組卵巢組織中均可檢測(cè)到表達(dá)，見圖1（見后插一）。ANXA8在各組卵巢組織中的表達(dá)有差異（Z=25.315，P＜0.001），表達(dá)強(qiáng)度隨著腫瘤惡性程度的進(jìn)展逐漸增高。而正常卵巢組織組、卵巢漿液性良性腫瘤組和卵巢漿液性交界性腫瘤組的ANXA8表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.476，P=0.290）。見表1。

圖1 ANXA8在各種卵巢組織中的表達(dá) （免疫組織化學(xué)染色×20）

表1 ANXA8在各組卵巢組織中的表達(dá)情況

卵巢漿液性惡性腫瘤組的ANXA8陽性表達(dá)率（31/34，91.18%）高于正常卵巢組織組（2/11，18.18%）、卵巢漿液性良性腫瘤組（5/13，38.46%）及卵巢漿液性交界性腫瘤組（8/17，47.06%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。類似的，ANXA8在卵巢漿液性惡性腫瘤組中的高表達(dá)率（23/34，67.65%）明顯高于正常卵巢組織組（1/11，9.09%）、卵巢漿液性良性腫瘤組（3/13，23.08%）及卵巢漿液性交界性腫瘤組（5/17，29.41%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為＜0.001、0.007、0.010）。

2.2 ANXA8表達(dá)與卵巢漿液性惡性腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系 FIGOⅢ～Ⅳ期患者的ANXA8的高表達(dá)率明顯高于FIGOⅠ～Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；盆腹腔殘余病灶直徑＞1 cm患者的ANXA8高表達(dá)率明顯高于殘余病灶≤1 cm患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.010）。雖然年齡≥60歲組、低分化組及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組ANXA8的高表達(dá)率均高于年齡＜60歲、高－中分化組及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

2.3 ANXA8的表達(dá)與卵巢漿液性惡性腫瘤患者預(yù)后的關(guān)系 34例卵巢漿液性惡性腫瘤患者在隨訪期間內(nèi)死亡16例，存活15例，失訪3例，入組時(shí)間為24～111個(gè)月，患者平均生存期為80.6個(gè)月（95%CI：69.2～92.1）。Kaplan-Meier生存分析表明，F(xiàn)IGO分期、淋巴轉(zhuǎn)移、殘余病灶、ANXA8的表達(dá)都是影響OS的重要因素（均P＜0.05），見表3和圖2（見后插一）。將單因素分析中對(duì)預(yù)后有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的4個(gè)指標(biāo)納入到Cox多元回歸模型分析中表明，ANXA8的高表達(dá)是影響卵巢漿液性惡性腫瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P=0.019，HR=11.465，95%CI：1.498～87.757）。

圖2 卵巢漿液性惡性腫瘤患者Kaplan-Meier生存分析曲線

3 討論

膜聯(lián)蛋白是一類至少由12種基因編碼的鈣離子結(jié)合蛋白，能和帶負(fù)電荷的膜磷脂相結(jié)合，廣泛分布于動(dòng)植物的組織與細(xì)胞內(nèi)，其在細(xì)胞總蛋白中占比高達(dá) 1%～2%，超家族分為 A、B、C、D、E 5類，其中A類在脊椎（哺乳）動(dòng)物中表達(dá)，又分為A1～A11、A13共12種亞型[3,12]，B類家族存在于非哺乳動(dòng)物，C類家族存在于單細(xì)胞真核生物和真菌，D類家族存在于植物，E類家族存在于原生生物。

近年發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。ANXA2在肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸鱗癌、卵巢癌的組織及細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[4,13-14]，而在輸卵管癌中表達(dá)降低，且與不良預(yù)后相關(guān)[15]，其參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥過程，甚至可以作為肝癌、胰腺癌及子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后指標(biāo)[4]。ANXA4參與了卵巢透明細(xì)胞癌的增殖、遷移和耐藥[16]，其巖藻糖基化修飾可增強(qiáng)與核因子κB（NF-κB）P50的相互作用，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞腫瘤的進(jìn)展[1]。ANXA5的表達(dá)與結(jié)腸癌的淋巴轉(zhuǎn)移及更差的期別相關(guān)[5]，其低表達(dá)能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖[17]，還可通過影響鈣黏蛋白（E-cadherin）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達(dá)促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲能力[18]。ANXA7在子宮內(nèi)膜異位癥組織中高表達(dá)[19]，其可通過影響?zhàn)じ较嚓P(guān)分子[黏著斑激酶（FAK）、類固醇受體輔助活化因子（Src）、E-cadherin等]基因與蛋白表達(dá)水平改變小鼠肝癌細(xì)胞Hca-P細(xì)胞生物學(xué)行為[3]，ANXA7下調(diào)能夠通過影響細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和 MMP-1、MMP-2、細(xì)胞間黏附分子 1（ICAM-1）而抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移及浸潤(rùn)[20]。ANXA11受抑制后可能通過抑制胸腺嘧啶脫氧核苷合成酶（TS）、B細(xì)胞淋巴瘤2（bcl-2）的表達(dá)提高胃癌細(xì)胞對(duì)氟尿嘧啶（5-Fu）的敏感性[21]，其可通過蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β（AKT/GSK-3β）途徑調(diào)節(jié)胃癌的增殖、遷移及浸潤(rùn)[22]。

表2 ANXA8表達(dá)與卵巢漿液性惡性腫瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表3 34例卵巢漿液性惡性腫瘤患者的臨床病理特征及預(yù)后的單因素Kaplan-Meier生存分析

目前關(guān)于ANXA8在腫瘤中作用的研究較少。最早開始于1992年，研究者們發(fā)現(xiàn)ANXA8的基因表達(dá)在急性早幼粒細(xì)胞白血病中特異性增高[7]，其在白血病細(xì)胞的分化、增生、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到了一定作用[23]。2008年，研究者通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)ANXA8在原發(fā)浸潤(rùn)性導(dǎo)管胰腺癌中高表達(dá)，可作為預(yù)后、診斷的指標(biāo)及治療的靶點(diǎn)[8]。近些年的研究逐步發(fā)現(xiàn)，ANXA8在胰腺癌中能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的活性、遷移及集落形成，其高表達(dá)與更晚的分期及更差的預(yù)后相關(guān)[6]。ANXA8在口腔鱗狀細(xì)胞癌患者頸部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中[24]、糖尿病口腔鱗癌患者唾液中[25]、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中[26]及乳腺原位導(dǎo)管癌組織[10]中均表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)與乳腺癌患者的腫瘤分期、分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移、雌激素受體（ER）陰性、腫瘤細(xì)胞3D成型等相關(guān)[10-11]，且可作為早期診斷的標(biāo)記物[27]。還有研究發(fā)現(xiàn)，同 ANXA1、ANXA2、ANXA6 一樣，ANXA8 以 Ca2+依賴方式與磷脂酰肌醇和F肌動(dòng)蛋白相互作用，參與表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）受體定位，ANXA8的消耗損害EGF降解，導(dǎo)致絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）激酶的持續(xù)激活[28]。在胰腺癌中，ANXA8通過鈣信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）的轉(zhuǎn)錄激活，導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）活化[9]。鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子2（ZIC2）可調(diào)控ANXA8使其高表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移[29]。在乳腺原位導(dǎo)管癌中，全反式視黃酸（RA）協(xié)同全反式視黃酸受體α（RARA）共同作用于ANXA8調(diào)節(jié)區(qū)域的視黃酸-反應(yīng)元件（RARE），兩者形成 RA-RARA-ANXA8反饋環(huán)路參與乳腺癌的異常形態(tài)形成[11]。在膀胱癌中，ANXA8與VEGF-C的表達(dá)相關(guān)[30]。在肝膽管型肝癌細(xì)胞中，ANXA8可由EGF-叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O4（FOXO4）信號(hào)通路參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[31]。在宮頸鱗癌中，ANXA8與細(xì)胞角蛋白5（CK5）共同參與角質(zhì)細(xì)胞分化和p53介導(dǎo)的凋亡途徑[26]。

但是迄今為止，尚無關(guān)于ANXA8在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中研究的報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤病變程度的進(jìn)展，ANXA8的陽性表達(dá)率逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示ANXA8參與卵巢上皮性漿液性癌的發(fā)生與發(fā)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ANXA8高表達(dá)與FIGO分期晚、盆腹腔殘余病灶直徑大及預(yù)后差相關(guān)，且ANXA8高表達(dá)是影響卵巢癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以上發(fā)現(xiàn)均為ANXA8在卵巢癌中的作用機(jī)制提供了參考，同時(shí)也提示ANXA8有望成為判斷預(yù)后的指標(biāo)。當(dāng)然，由于本項(xiàng)研究樣本量較少，結(jié)論難免有所偏差，尚需后續(xù)大樣本的研究進(jìn)一步探討。

Zhu等[32]對(duì)高表達(dá)及低表達(dá)人附睪蛋白4（HE4）的卵巢癌細(xì)胞系進(jìn)行基因芯片分析，尋找與HE4相關(guān)的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)ANXA8隨著HE4基因受抑制而呈現(xiàn)低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（倍數(shù)變化－1.430），提示兩者存在某種程度的相關(guān)性；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)與HE4相關(guān)的差異表達(dá)基因中包括HIF1A（倍數(shù)變化 1.649）、FOXO4（倍數(shù)變化－1.087）、ZIC2（倍數(shù)變化－1.290）等。前文中已經(jīng)討論了這些基因通過ANXA8參與了肝癌的EMT[31]、胰腺癌的增殖凋亡[9,29]等，這些結(jié)果提示HE4可能在以上蛋白的協(xié)同下與ANXA8相互作用，從而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展，前期基因芯片的通路分析已經(jīng)提示HE4差異表達(dá)基因主要參與了MAPK、p53等信號(hào)通路的激活[32-33]，而上文已經(jīng)討論了ANXA8在MAPK激酶的持續(xù)激活[28]及p53介導(dǎo)凋亡[26]中起到了作用，故而有理由推測(cè)HE4與ANXA8的相互作用可能通過激活下游的MAPK、p53等信號(hào)通路而影響卵巢癌惡性生物學(xué)行為。以上推測(cè)為后續(xù)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了理論參考。