DR5、FADD在子宮肌瘤組織中的表達(dá)水平及意義

唐亮，王敏，張利軍，王梅，肖燕

子宮肌瘤是婦科最常見的良性腫瘤，在育齡期婦女中的發(fā)病率高達(dá)20%～25%[1]。臨床癥狀為月經(jīng)紊亂、疼痛、白帶增多、腹部包塊及不孕癥等。目前子宮肌瘤的發(fā)病機制尚未明確，探尋子宮肌瘤發(fā)病的分子及細(xì)胞機制具有現(xiàn)實意義。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis ligand，TRAIL）屬于腫瘤壞死因子超家族成員，死亡受體 5（death receptor5，DR5）是一種 TRAIL 特異性受體，TRAIL通過與其死亡受體DR4和DR5結(jié)合，選擇性地誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[2]。凋亡促進蛋白（Fas-associating protein with a novel death domain，F(xiàn)ADD）是一種死亡域蛋白，與Fas胞漿區(qū)呈特異性結(jié)合，故又名Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白[3]。FADD介導(dǎo)多種死亡受體誘導(dǎo)的凋亡信號傳導(dǎo)通路，在凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起承上啟下的作用[4]。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)異常會導(dǎo)致各種疾病，如免疫失調(diào)、惡性腫瘤等。近年對DR5和FADD在子宮肌瘤中作用機制的研究較為少見，本研究將著重探討DR5和FADD在子宮肌瘤中的表達(dá)情況以及臨床意義，以期為兩者在子宮肌瘤中的作用機制的研究提供參考。

1 對象與方法

1.1 臨床資料 選取2017年3月—2018年5月在本院進行子宮肌瘤切除術(shù)的72例患者作為研究對象，年齡30～56歲，平均（43.82±6.84）歲；將手術(shù)切除的子宮肌瘤組織為肌瘤組織組，距離腫瘤邊緣5 cm以外的瘤旁組織為瘤旁組織組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)《子宮肌瘤的診治中國專家共識》臨床指南[5]且術(shù)后病理診斷為子宮肌瘤者；②年齡≥18歲；③術(shù)前6個月內(nèi)未接受激素治療；④無其他盆腔病變者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤疾病者；②合并血液系統(tǒng)疾病者；③合并嚴(yán)重心肝腎功能不全者。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，組織樣本的獲取均取得研究對象的知情同意。

1.2 主要儀器與試劑 RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自于北京天根生化有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）試劑盒購自德國QIAGEN公司；兔抗人FADD多克隆抗體、兔抗人DR5多克隆抗體均購自美國Zymed公司；免疫組織化學(xué)通用試劑盒購自武漢博士德生物工程公司；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒購自凱基生物科技發(fā)展公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集 收集手術(shù)切除的肌瘤組織作為樣本，同時采集距離腫瘤邊緣5 cm以外的瘤旁組織為對照樣本。所有收集的組織樣本分為兩部分，一部分保存于-80℃中用于RNA抽提，另一部分制作石蠟切片。

1.3.2 qRT-PCR法測定子宮肌瘤組織中DR5和FADD mRNA表達(dá)量 從-80℃取出保存的樣本，提取組織總RNA：將樣本超聲勻漿，按照RNA提取試劑盒的說明書提取總RNA，檢測RNA的純度以及完整度；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：將所得RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，嚴(yán)格依據(jù)說明書進行操作，產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。qRT-PCR反應(yīng)體系20 μL：10 μL 2×SYBR Mix，上下游引物各 1 μL，cDNA 模板 1 μL，H2O 7 μL，每個樣品做3個重復(fù)，反應(yīng)條件為95℃反應(yīng)30 s，95℃反應(yīng) 15 s，60℃反應(yīng) 30 s，40個循環(huán)，72℃延伸 10 min，在qRT-PCR儀上進行反應(yīng)。其中DR5上游引物：5’-GGGAGCCGCTCATGAGGAAGTTGG-3’，下游引物：5’-GGCAAGTCTCTCTCCCAGCGTCTC-3’，F(xiàn)ADD 上游引物：5’-GTGAAGACCCAGCAGGAAGC-3’，下游引物：5’-ACGCCACAGTGGTTGAGCAT-3’，兩者均以β-actin為內(nèi)參，上游引物：5’-CTCGTCATACTCCTGCTTGCTG-3’，下游引物：5’-CGGGACCTGACTGACTACCTC-3’。使用 ΔΔCt法對結(jié)果進行相對定量分析，根據(jù)各樣本的平均Ct值，采用2-ΔΔCt法計算DR5和FADD mRNA相對表達(dá)量。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法檢測子宮肌瘤組織中DR5和FADD蛋白的表達(dá)情況 將石蠟切片脫蠟后，分別在100%、95%、80%、70%乙醇中孵育2~3 min，經(jīng)蒸餾水漂洗后在3%H2O2常溫孵育10 min，抗原熱修復(fù)，檸檬酸鹽緩沖液中加熱5 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，加入山羊血清孵育15 min，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗?jié)窈兄蟹跤^夜，PBS清洗3遍，加入二抗孵育25 min，PBS清洗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液常溫孵育10 min，DBA顯色液進行顯色反應(yīng)，染色成功后，蒸餾水沖洗，在蘇木素中復(fù)染1 min，蒸餾水沖洗后置于1%鹽酸中5 s，繼續(xù)用蒸餾水沖洗，最后分別置于70%、80%、95%、100%乙醇中脫水3 min，進行透明處理后，封片鏡檢。DR5蛋白位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，偶可表達(dá)于細(xì)胞膜，但細(xì)胞核不著色，呈現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒狀為陽性表達(dá)；細(xì)胞不著色則為陰性表達(dá)。FADD蛋白位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)上，呈黃色、棕黃色顆粒狀表達(dá)為陽性；FADD蛋白表達(dá)缺失則為陰性。

1.3.4 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法（terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）檢測細(xì)胞凋亡 TUNEL法顯示的凋亡細(xì)胞呈棕褐色，散在分布，核濃縮，胞體變小，大小不等，染色質(zhì)沿核膜呈半月形邊集或碎裂成片。凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）的計算：每張切片連續(xù)選取5個高倍（×200）視野，計算平均凋亡細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比，即AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%；增殖指數(shù)（prolifer-ationindex，PI）的計算：每張切片連續(xù)選取5個高倍（×200）視野，計算平均增殖細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比，即PI=增殖細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS24.0對數(shù)據(jù)進行分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本均數(shù)的t檢驗；定性資料用率表示，組間比較采用卡方檢驗；Pearson法分析各組數(shù)據(jù)的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組DR5和FADD mRNA的表達(dá)情況 肌瘤組織組DR5 mRNA的表達(dá)量高于瘤旁組織組，F(xiàn)ADD mRNA的表達(dá)量低于瘤旁組織組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表 1。

表1 子宮肌瘤組織中DR5和FADD mRNA的表達(dá)（±s）

表1 子宮肌瘤組織中DR5和FADD mRNA的表達(dá)（±s）

組別 n DR5/β-actin FADD/β-actin瘤旁組織組 72 4.61±0.99 2.18±0.56肌瘤組織組 72 2.49±0.68 4.23±0.97 14.978 15.530 P 0.000 0.000 t

2.2 2組DR5和FADD蛋白表達(dá)情況 肌瘤組織組DR5蛋白的陽性表達(dá)率高于瘤旁組織組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；FADD蛋白的陽性表達(dá)率低于瘤旁組織組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 子宮肌瘤組織中DR5和FADD蛋白陽性表達(dá)率例（%）

2.3 子宮肌瘤細(xì)胞凋亡及增殖檢測 本研究中采用TUNEL法，用辣根酶結(jié)合卵白素取代熒光素結(jié)合抗體，標(biāo)記后的細(xì)胞在光鏡下核呈棕黃色或棕褐色。子宮肌瘤組織中細(xì)胞彌散分布，可見凋亡小體的形成；在瘤旁組織中，也存在少量的凋亡細(xì)胞。見圖1（見后插一）。肌瘤組織組AI低于瘤旁組織組，瘤旁組織組PI低于肌瘤組織組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

圖1 子宮肌瘤細(xì)胞凋亡圖（TUNEL法×400）

表3 2組細(xì)胞凋亡及增殖率（%） （±s）

表3 2組細(xì)胞凋亡及增殖率（%） （±s）

組別 n A I P I χ 2 2 0.7 9 7 9.3 1 4 P 0.0 0 0 0.0 0 0瘤旁組織組 7 2 1 5.8 9±4.5 8 2 4.6 5±7.3 4肌瘤組織組 7 2 3 3.1 7±5.3 6 1 3.9 1±6.4 7

2.4 DR5和FADD mRNA的表達(dá)與子宮肌瘤細(xì)胞凋亡、增殖的關(guān)系 Pearson法分析結(jié)果顯示，在子宮肌瘤組織中，DR5表達(dá)與AI呈負(fù)相關(guān)（r=-0.431，P=0.000），與 PI呈正相關(guān)（r=0.508，P=0.000）；FADD表達(dá)與 AI呈正相關(guān)（r=0.642，P=0.000），與 PI呈負(fù)相關(guān)（r=-0.500，P=0.000）。

2.5 子宮肌瘤組織中DR5與FADD的關(guān)系Pearson法分析結(jié)果顯示，子宮肌瘤組織中DR5與FADD 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.556，P=0.000），見圖 2。

3 討論

子宮肌瘤是一種女性育齡期生殖系統(tǒng)良性腫瘤，可引發(fā)下腹疼痛、子宮異常出血及盆腔壓迫等癥狀，損傷女性的生殖系統(tǒng)，增加子宮切除的風(fēng)險，加重患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，對患者的生活質(zhì)量和生殖健康帶來極大的影響。然而目前子宮肌瘤的確切病因尚不十分清楚。

圖2 子宮肌瘤組織中DR5與FADD的相關(guān)性

TRAIL有4種高親和力的受體，分別是死亡受體DR4和DR5，誘導(dǎo)受體DcR1和DcR2；與TRAIL結(jié)合在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。其中DR4和DR5與TRAIL結(jié)合后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；DcR1和DcR2缺乏內(nèi)源性死亡結(jié)構(gòu)域，與TRAIL結(jié)合后再與DR競爭結(jié)合TRAIL而保護細(xì)胞[6]，因此TRAIL受體的表達(dá)水平影響細(xì)胞凋亡。外來的配體與DR5相結(jié)合時,可選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞[7]，但DR5本身對腫瘤的影響尚不明確。研究表明，DR5在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常細(xì)胞中表達(dá)較少[8]。本研究中DR5mRNA和蛋白陽性率表達(dá)升高，提示DR5在子宮肌瘤的發(fā)展過程中水平升高可能影響細(xì)胞凋亡從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展，可能受到某些因子的調(diào)控，從而發(fā)生子宮肌瘤組織的細(xì)胞凋亡逃逸。

人FADD基因定位于11號染色體11q13.3處，由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成，是一種胞質(zhì)蛋白，其羧基末端能與Fas蛋白的胞內(nèi)區(qū)結(jié)合，氨基末端則是引起死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的必需成分，因此FADD可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)通路從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。當(dāng)FADD蛋白表達(dá)異?；蚬δ軉适r，F(xiàn)as/Fas L結(jié)合后的促細(xì)胞凋亡信號不能有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞凋亡被阻止[10]。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)異常會導(dǎo)致多種疾病，如免疫失調(diào)、惡性腫瘤等，F(xiàn)ADD基因DD區(qū)或DED區(qū)發(fā)生缺失，亦無法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。研究顯示，F(xiàn)ADD基因的過表達(dá)能促進惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡[12]；但在膀胱癌、宮頸癌等組織中表達(dá)水平較低，造成細(xì)胞凋亡異常[13]。本研究結(jié)果顯示，肌瘤組織FADD基因mRNA和蛋白陽性率的表達(dá)低于瘤旁組織，提示FADD水平降低使細(xì)胞凋亡發(fā)生異常，從而影響疾病進程。

有報道指出死亡受體DR5誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡需要依賴于FADD和半胱氨酸蛋白酶8（caspase-8）[14]。TRAIL通過與死亡受體DR4或DR5結(jié)合，從而使受體細(xì)胞內(nèi)的DD活化，并與FADD的羧基端結(jié)合；FADD通過其氨基端的DED與半胱天冬酶8前體（procaspase-8）上的DED結(jié)合，從而形成了TRAILDR4/DR5-FADD-procaspase-8，即 DISC[15]。DISC 可促使procaspase-8形成有活性的凋亡起始蛋白caspase-8?；罨腸aspase-8釋放到人的胞質(zhì)中從而激發(fā)一系列下游的caspase-3等級聯(lián)反應(yīng)，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡。但當(dāng)FADD水平降低時，會阻礙DISC的形成，從而影響caspase-8的活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受限。本研究結(jié)果顯示，肌瘤組織AI低于瘤旁組織，PI高于瘤旁組織，提示子宮肌瘤組織中細(xì)胞凋亡降低、增殖升高。肌瘤組織DR5表達(dá)與AI負(fù)相關(guān)、與PI正相關(guān)，F(xiàn)ADD表達(dá)與AI正相關(guān)、與PI負(fù)相關(guān)，提示DR5和FADD與子宮肌瘤細(xì)胞凋亡、增殖密切相關(guān)，影響細(xì)胞凋亡、增殖；肌瘤組織DR5與FADD呈負(fù)相關(guān)，提示子宮肌瘤組織中細(xì)胞凋亡減弱、加速細(xì)胞增殖從而加速疾病進程，可能是FADD表達(dá)下降，使DR5與FADD的結(jié)合受阻，影響凋亡蛋白的激活，從而使細(xì)胞凋亡減弱、細(xì)胞增殖加速，進而調(diào)控子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，子宮肌瘤組織中DR5高表達(dá)、FADD低表達(dá)，且與子宮肌瘤凋亡密切相關(guān)。DR5與FADD兩者負(fù)相關(guān)，共同參與子宮肌瘤的發(fā)生。但本研究并未深入探究DR5、FADD在凋亡過程中的具體機制，存在一定的不足?？赡茈S著對DR5、FADD等抑癌基因、癌基因的調(diào)控機制的闡明，將有利于子宮肌瘤發(fā)病機制的明確，并為子宮肌瘤的診治提供更為準(zhǔn)確的理論支持。