經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)術(shù)后病人CYP2C19*2、CYP2C19*3和PON1 基因多態(tài)性與氯吡格雷血藥濃度及療效的相關(guān)性分析

范潔，詹三華，袁孔現(xiàn)

作者單位：銅陵市人民醫(yī)院藥學(xué)部，安徽 銅陵 244000

阿司匹林和氯吡格雷雙聯(lián)抗血小板治療已成為目前急性冠狀動脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）和經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)（percutaneous coronary intervention，PCI）的標(biāo)準(zhǔn)化治療方案。然而，各種遺傳以及臨床的因素會導(dǎo)致氯吡格雷療效出現(xiàn)個體差異［1］。其中以氯吡格雷抵抗研究較多，而對出現(xiàn)出血、胃腸道損害等不良反應(yīng)的研究較少。不良反應(yīng)的產(chǎn)生亦是病人依從性降低，進(jìn)而導(dǎo)致心血管事件發(fā)生的重要影響因素。

氯吡格雷為前體藥物，口服后吸收快速但不完全，吸收率＞50%。氯吡格雷吸收后廣泛經(jīng)肝臟代謝，其中約85%經(jīng)酯酶水解為非抗血小板活性的羧酸氯吡格雷（SR26334），約15%進(jìn)行硫醇化的代謝活化［2］。代謝活化過程主要由CYP2C19 基因編碼的肝細(xì)胞色素（CYP）450 和對氧磷酶1（PON1）等介導(dǎo)，活化后的代謝產(chǎn)物與血小板膜上的P2Y12受體結(jié)合，會有效阻斷二磷酸腺苷（ADP）與其結(jié)合，最終抑制血小板活化和聚集［3-4］。若參與編碼此過程有關(guān)蛋白的基因發(fā)生遺傳變異，可能會引起活性藥物濃度差異，進(jìn)而會影響到藥物療效。

CYP2C19 基因作為影響氯吡格雷代謝最重要的基因，其遺傳變異已引起人們的極大重視。CYP2C19*2突變型是CYP2C19第5外顯子在第681位的突變導(dǎo)致的5’端40 bp 堿基缺失，從而改變了mRNA 的閱讀框架并產(chǎn)出無功能的CYP2C19*2酶［5］；CYP2C19*3突變型是第4外顯子在第636位的突變造成終止密碼子提前，產(chǎn)生出了代謝功能極低的CYP2C19*3 酶［5］。我國人群中CYP2C19*2、CYP2C19*3 分布的頻率分別約為24%～25%、2%～3%［6］，也是亞洲人群中最常見的突變位點(diǎn)［7］。除此之外，對氧磷酶1（PON1）作為參與氯吡格雷第二步生物轉(zhuǎn)化中的代謝的一種限速酶，其基因啟動子區(qū)域功能性位點(diǎn)突變（126C＞G）亦會影響PON1 基因表達(dá)水平，從而改變PON1 酶活性［8］，可能也是影響氯吡格雷血藥濃度及治療效果的關(guān)鍵因素。為此，本文以PCI術(shù)后行阿司匹林和氯吡格雷雙聯(lián)抗血小板治療病人為研究對象，對不同基因型與氯吡格雷及非抗血小板活性代謝產(chǎn)物羧酸氯吡格雷（SR26334）血藥濃度之間的關(guān)系進(jìn)行探討，試圖進(jìn)一步理解以上相關(guān)基因多態(tài)性與氯吡格雷藥物抗血小板聚集效果之間的聯(lián)系，以便為該類病人合理用藥方案提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 納入對象選取2017年12月至2018年5月在銅陵市人民醫(yī)院接受冠脈造影檢查和PCI術(shù)治療的住院病人51例，診斷為冠心?。–HD）或急性心肌梗死，年齡范圍為44～91歲。接受氯吡格雷+阿司匹林的雙聯(lián)抗血小板治療（圍手術(shù)期間均給予阿司匹林100 mg/d+氯吡格雷負(fù)荷劑量75 mg/d）。病人或其近親屬對本研究知情同意，簽署了知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 觀察指標(biāo)及隨訪納入符合條件的病人，詳細(xì)記錄病人臨床基本特征（如性別、年齡、吸煙史、飲酒史），疾病史（如高血壓病史、糖尿病病史等），合并用藥以及PCI相關(guān)信息（如病變血管數(shù)等）。通過再入院記錄、門診以及電話隨訪病人術(shù)后出血事件。隨訪半年內(nèi)所發(fā)生的出血事件。根據(jù)其嚴(yán)重程度分為輕度出血（包括皮膚、鼻腔、牙齦等出血）、中度出血（消化道出血）、重度出血（顱內(nèi)出血等）。心血管事件（MACE）包括支架植入后心絞痛、支架內(nèi)再狹窄、再發(fā)心梗等。

1.3 試劑氯吡格雷化學(xué)對照品（Clopidogrel，European Pharmacopoeia Reference Standard，ID：001C8D）、羧酸氯吡格雷化學(xué)對照品（Clopidogrel Carboxylic Acid，Vaughan Ontario L4K 4C7 Canada，Lot：1427-057A5）、艾司唑侖化學(xué)對照品（Estazolam，國家麻醉品實(shí)驗(yàn)室，1218-9802）。甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚均為色譜純（美國TEDIA 公司），KH2PO4和H3PO4為分析純試劑，水為經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾注射用水?？瞻籽獫{由本院血庫提供的健康獻(xiàn)血者血漿。

1.4 儀器高效液相色譜儀，日本島津生產(chǎn)，型號SPD-20AV。電動離心機(jī)，常州醫(yī)科諾儀器有限公司，型號800D。超低溫冰箱，日本三洋電機(jī)生物醫(yī)學(xué)有限公司生產(chǎn)，型號MDF-382E。電熱恒溫水浴鍋，上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠，型號XMTD-204。焦磷酸測序儀，凱杰公司生產(chǎn)，型號PyroMark*Q24 MDx。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 氯吡格雷及SR26334血藥濃度測定 病人服藥3 d后，在第4天服藥30 min后，靜脈采血2 mL入EDTA抗凝真空采血管，4 000 r/min離心10 min得血漿樣本，經(jīng)甲基叔丁基醚萃取、N2吹干后，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法（色譜柱：KromasilTM 100A C18（150 mm LD×4.6 mm ID，5μm），流動相：10 mmol/L KH2PO4溶液（含0.25% H3PO4）-乙腈（50∶50），流速：1.0 mL/min，檢測波長：220 nm，柱溫：40 ℃），并以艾司唑侖為內(nèi)標(biāo)測定氯吡格雷及SR26334的血漿藥物濃度。

1.5.2 基因檢測 按照核酸提取純化試劑盒（長沙三濟(jì)生物科技有限公司）說明書步驟提取基因組DNA，采用焦磷酸測序技術(shù)檢測CYP2C19*2（681G＞A）、CYP2C19*3（636G＞A）、PON1（126C＞G）三個位點(diǎn)。根據(jù)CYP2C19基因突變而引起酶代謝活性的不同，把攜有野生型基因（*1/*1）歸為快代謝型（EM），突變雜合型（*1/*2、*1/*3）為中間代謝型（IM），突變純合型（*2/*2、*2/*3、*3/*3）為弱代謝型（PM）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料以表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差（ANOVA-Bonferroni）分析。遺傳平衡采用Hardy-Weinberg平衡定律分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPLC 色譜圖分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白血漿、空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)品、樣品血漿經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)樣檢測，發(fā)現(xiàn)SR26334 保留時間為1.8 min（峰1）、內(nèi)標(biāo)化合物艾司唑侖保留時間為4.2 min（峰3）、氯吡格雷保留時間為7.4 min（峰2），基本無雜質(zhì)峰干擾。色譜圖中SR26334、艾司唑侖、氯吡格雷能得到基線分離且與各化學(xué)對照品保留時間一致，在此實(shí)驗(yàn)條件下所測得結(jié)果可以反映血藥濃度，見圖1。

2.2 CYP2C19、PON1 基因型及頻率分布CYP2C19*2（681G＞A）、CYP2C19*3（636G＞A）、PON1（126C＞G）等位基因、基因型頻率分布（表1）。達(dá)到Hardy-Weinberg遺傳平衡（P＞0.05），具有群體代表性。

表1 CYP2C19和PON1基因型及等位基因的頻率分布

圖1 氯吡格雷和SR26334 HPLC色譜圖：A為標(biāo)準(zhǔn)品色譜，B為空白血漿色譜，C為空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)品色譜，D為樣本血漿色譜

2.3 氯吡格雷CYP2C19基因分型與體內(nèi)血藥濃度之間的關(guān)系氯吡格雷活性硫醇代謝物存在4種異構(gòu)體，其中有活性的為H4。H4極不穩(wěn)定，在空氣中易氧化，衍生化后的MP-H4穩(wěn)定性大大提高［9］。但體內(nèi)MP-H4血藥濃度極低，且半衰期只有0.5 h［10］，必須要使用HPLC-MS/MS 法，對檢測技術(shù)要求很高。而相同條件下，體內(nèi)SR26334 血藥濃度是活性代謝產(chǎn)物的千倍，常規(guī)RP-HPLC 法即可檢測SR26334。病人第4 天服藥30 min 后靜脈采血，測定氯吡格雷、SR26334血藥濃度。CYP2C19基因分型對血藥濃度的影響（表2）及各基因型之間血藥濃度的比較（圖2）：CYP2C19基因分型與SR26334相關(guān)性較好，快代謝型、中代謝型與弱代謝型SR26334 血藥濃度相比較，有明顯增加趨勢?？齑x型與弱代謝型SR26334血藥濃度之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 CYP2C19基因分型對血藥濃度的影響

圖2 CYP2C19不同基因型之間血藥濃度的比較

2.4 氯吡格雷PON1（126C＞G）基因型與體內(nèi)血藥濃度之間的關(guān)系PON1（126C＞G）CC 比CG，CC 比GG，CG 比GG 基因型組Bonferroni 矯正后均P＞0.05。但PON1（126C＞G）野生型（CC 型）與突變型（CG+GG 型）病人SR26334 血藥濃度：（1.45±0.63）μg/mL 比（1.09±0.32）μg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.047），見圖3。

2.5 SR26334 峰濃度與終點(diǎn)事件相關(guān)性分析本實(shí)驗(yàn)共收集到符合條件的病人51 例。隨訪期間27例病人術(shù)后良好，為正常組，15 例病人出現(xiàn)了心血管事件（MACE），分為MACE 組，其中心源性死亡1例，支架內(nèi)再狹窄7 例，心絞痛再發(fā)7 例。9 例在隨訪期間出現(xiàn)了出血事件，成為出血組。分別測定51例病人穩(wěn)態(tài)下的血藥峰濃度。

圖3 PON1（126C＞G）不同基因型之間血藥濃度的比較

測定結(jié)果：正常組（n＝25）血藥濃度為（1.51±0.48）μg/mL，MACE 組（n＝15）血藥濃度為（1.06±0.65）μg/mL，出血組（n＝9）血藥濃度為（1.85±0.32）μg/mL。正常組比MACE組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），正常組比出血組P＞0.05（均經(jīng)Bonferroni 校正）。見圖4。

圖4 三組之間SR26334血藥濃度比較的箱式圖

2.6 根據(jù)基因型進(jìn)行分組時MACE及出血事件的發(fā)生率 各基因型組MACE及出血事件的發(fā)生率見表3，4。經(jīng)統(tǒng)計(jì)比較，各基因型組MACE 及出血事件的發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 CYP2C19基因型與終點(diǎn)事件相關(guān)性分析

表4 PON1基因型與終點(diǎn)事件相關(guān)性分析/例（%）

3 討論

氯吡格雷作為血小板P2Y12 受體的拮抗劑，需要人體中經(jīng)過肝臟代謝轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物以發(fā)揮其藥理作用［11］。由于其代謝途徑復(fù)雜，包括病人體重、年齡，代謝途徑中關(guān)鍵酶的基因多態(tài)性，以及聯(lián)合用藥等因素可能影響該藥的抗血小板作用［12］。目前對可能影響氯吡格雷體內(nèi)代謝的CYP2C19*2、CYP2C19*3和PON1等基因研究較多。2010年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）在氯吡格雷的藥物說明書中增加了“黑框警告”，提醒醫(yī)生對病人進(jìn)行CYP2C19*2 和*3 等位基因的檢測［13］。但是對于這兩項(xiàng)結(jié)果的實(shí)際臨床意義以及就此作出治療方案的調(diào)整尚未明確。服用氯吡格雷后，SR26334 在血液循環(huán)中具有較高濃度，SR26334 半衰期約為7～8 h［14］，使得采用常規(guī)液相色譜-紫外檢測器聯(lián)用檢測SR26334成為可能，增加了該檢測方法的可推廣性。此外，有研究表明，血漿SR26334最大濃度及AUC與服用劑量成線性關(guān)系［15］，可為血漿SR26334 濃度檢測的必要性提供支持。本研究通過考察CYP2C19*2、CYP2C19*3 和PON1 基因多態(tài)性對SR26334 血藥濃度影響，以及對終點(diǎn)事件的影響，以便為臨床個體化用藥方案設(shè)計(jì)提供更多的方法與有效數(shù)據(jù)支持。

研究報(bào)道，CYP2C19*2和*3突變?yōu)楣δ苋笔У任换颍笴YP2C19 酶活性降低，氯吡格雷代謝減弱，甚至導(dǎo)致氯吡格雷抵抗［16］。人對氧磷脂酶1（PON1）是一種鈣依賴性的芳香酯水解酶，可以代謝氯吡格雷、阿司匹林等物質(zhì)［17］。納入本研究的51例病人，接受了氯吡格雷+阿司匹林的雙聯(lián)抗血小板治療（口服氯吡格雷負(fù)荷劑量300 mg+維持劑量75 mg/d）。進(jìn)行了CYP2C19*3 和PON1 基因檢測以及測定了氯吡格雷及非抗血小板活性代謝產(chǎn)物SR26334 血藥濃度。結(jié)果顯示，CYP2C19 快代謝型與弱代謝型SR26334血藥濃度之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），PON1（126C＞G）野生型（CC型）與突變型（CG+GG 型）病人SR26334 峰濃度間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從而提示，在病人未接受氯吡格雷基因分型前，SR26334 血藥濃度對于氯吡格雷抗血小板治療方案的調(diào)整以及藥物療效的評價(jià)具有一定的指導(dǎo)意義。SR26334血藥峰濃度與心血管事件的發(fā)生差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但與出血事件的發(fā)生差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能出血事件的發(fā)生與聯(lián)用其他藥物（如華法林、他汀類）、非抗血小板活性代謝產(chǎn)物SR26334 的藥理作用、以及伴隨疾病（如高血壓、糖尿?。┑?，都有可能導(dǎo)致術(shù)后氯吡格雷所致出血，還需進(jìn)一步研究考察。本研究結(jié)果顯示CYP2C19 基因型與終點(diǎn)事件的發(fā)生無明顯相關(guān)（P＞0.05），可能與參與氯吡格雷代謝途徑的基因較多有關(guān)，包括藥物吸收、代謝在內(nèi)等多種復(fù)雜因素的影響。