多囊卵巢綜合征病人卵泡液褪黑素與氧化應激的關(guān)聯(lián)研究

王麗佳

作者單位：無錫市婦幼保健院婦產(chǎn)科，江蘇 無錫 214002

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種內(nèi)分泌疾病，在生育期女性中較為常見。PCOS 病人卵泡液內(nèi)有氧化應激狀態(tài)的異常，PCOS 的發(fā)病與活性氧的代謝失衡有關(guān)，抗氧化劑能改善PCOS的預后［1-4］。褪黑素是松果體分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，其抗氧化活性很強［5-6］。近年的研究發(fā)現(xiàn)褪黑素具有抗氧化活性，能有效地清除自由基、調(diào)節(jié)抗氧化酶活性，具有極強的給電子活性和下調(diào)氧化應激水平的作用［7-9］。本研究通過測定PCOS 病人卵泡液中總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAC）以及褪黑素、丙二醛（malondialdehyde，MDA）表達，旨在探討PCOS 病人卵母細胞質(zhì)量降低的因素與機制，為改善輔助生殖技術(shù)治療提供科學根據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料按照納入和排除標準選取2016年1 月至2017年12 月無錫市婦幼保健院收治的不孕病人50 例，其中觀察組30 例為PCOS，對照組20 例為輸卵管因素導致的不孕病人。觀察組入組標準：①稀少排卵或沒有排卵；②有高雄激素血癥或者高雄激素的特點；③超聲檢查發(fā)現(xiàn)雙側(cè)卵巢都有≥12個直徑2～9 mm 的竇卵泡；④臨床資料完整者。對照組入組標準：①輸卵管因素導致的不孕病人；②基礎(chǔ)激素水平正常、月經(jīng)規(guī)律；③有＞5個雙側(cè)竇卵泡；④近半年沒有使用過甾體激素類藥物；⑤病人注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）當日有5個以上直徑≥14 mm的卵泡；⑥臨床資料完整者。病人排除標準：①最近進行過任何維生素類等抗氧化藥物治療的病人；②染色體異常、有子宮內(nèi)膜病變；③排除有精神疾病及性傳播病史；④由于男方原因不孕的病人；⑤子宮內(nèi)膜異位癥、子宮畸形、卵巢囊腫、卵巢腫瘤。病人或其近親屬對本研究知情同意，簽署了知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 研究方法

1.2.1 控制性卵巢刺激 觀察組中月經(jīng)不規(guī)律病人應用一次黃體酮撤退性出血，于月經(jīng)第3 天實施醋酸環(huán)丙孕酮治療。重組人促卵泡激素或者人絕經(jīng)期促性腺激素，進行控制性刺激卵巢?？刂菩月殉泊碳さ姆桨福捍傩韵偌に蒯尫偶に丶觿℅nRHA）方案（拮抗劑方案），Gn 啟動劑量100～200 IU/d。監(jiān)測過程以調(diào)節(jié)Gn為主，逐漸增量，一次增量37.5～75.0 IU，應用GnRH-A+HCH降量雙扳機防止卵巢過度刺激綜合征。對照組處理方案：亦采用GnRH-A方案（拮抗劑方案）。采用經(jīng)陰道B超測定病人卵泡以及子宮內(nèi)膜的生長情況。當出現(xiàn)2 個直徑≥18 mm的卵泡時，應立即停止促性腺素的使用，并對促黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、睪酮（T）水平進行抽血檢測，當天進行注射HCG，在HCG 注射后的34～36 h進行取卵。

1.2.2 體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）取卵后，在卵泡液中取出卵-冠-丘復合物，通過卵母細胞成熟度分型與精卵進行培養(yǎng)，在受精后的12～14 h 對受精狀況進行檢測，進行1 d受精后，對受精卵的卵裂狀況進行評估，在受精后第3 天，將胚胎放置到宮腔內(nèi)。之后進行黃體酮注射60 mg/d，第14～16 天后進行尿妊娠試驗或者對血清β-HCG進行檢測，測定為陰性的病人停止使用黃體酮，測定為陽性的病人進行黃體酮的繼續(xù)使用，移植1 個月后采用經(jīng)陰道超聲檢測妊娠結(jié)果，注射黃體酮直至移植后10～12周。

1.2.3 精子卵漿內(nèi)注射技術(shù)（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）采卵后，將卵-冠-丘復合物從卵泡液中取出，并于在采卵后4 h以去顆粒細胞的方式處理卵母細胞，卵胞質(zhì)內(nèi)ICSI 注射單個精子，16～18 h后，對受精情況進行檢測，受精后1～2 d 內(nèi)對卵裂情況進行評估，在受精3 d 后，將胚胎放置到宮腔內(nèi)。其他步驟與IVF-ET一致。

1.2.4 卵泡液收集 取卵日采用陰道超聲對卵泡進行穿刺，收集卵泡液，進行離心，將上清液收集在離心管中。按照可見分光度法對總TAC進行測定，按照硫代巴比妥酸法對MDA進行測定，按照酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法對褪黑素水平進行測定；分別采用葡萄糖氧化電極法、放射免疫法測定病人空腹血糖（FSG）以及空腹胰島素（FINS）水平，并計算胰島素敏感指數(shù)（ISI），ISI＝1/（FSG×FINS）。全部操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學方法本研究中數(shù)據(jù)全部采用SPSS20.0 統(tǒng)計分析軟件（美國IBM 公司）進行處理。計量資料采用表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2分析。P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計學意義。

表1 不孕病人50例觀察組和對照組基本資料比較

2 結(jié)果

2.1 兩組病人基本資料比較調(diào)查結(jié)果顯示，兩組病人年齡、體質(zhì)量（BMI）指數(shù)、不孕年限、不孕類型以及受精方式均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），故可排除上述因素對研究結(jié)果造成的影響，數(shù)據(jù)具有可比性，見表1。

2.2 兩組病人基礎(chǔ)激素水平比較觀察組病人LH、T水平高于對照組，F(xiàn)SH、E2水平低于對照組，兩組間基礎(chǔ)激素水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 不孕病人50例觀察組和對照組基礎(chǔ)激素水平比較/

表2 不孕病人50例觀察組和對照組基礎(chǔ)激素水平比較/

注：LH 為促黃體生成素，T 為睪酮，F(xiàn)SH 為血清卵泡刺激素，E2為雌二醇

2.3 兩組病人胰島素水平比較觀察組病人FINS水平高于對照組、ISI 高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；兩組病人FSG水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 不孕病人50例兩組空腹血糖和空腹胰島素水平比較/

表3 不孕病人50例兩組空腹血糖和空腹胰島素水平比較/

注：FSG為空腹血糖，F(xiàn)INS為空腹胰島素

2.4 兩組病人褪黑素水平比較觀察組病人褪黑素水平（120.71±9.32）pg/mL 低于對照組（138.39±11.03）pg/mL，差異有統(tǒng)計學意義（t＝6.105，P＜0.05）。

2.5 兩組病人卵泡液中氧化/抗氧化能力指標比較觀察組病人TAC水平低于對照組，觀察組病人MDA 水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 不孕病人50例觀察組和對照組卵泡液中氧化/抗氧化能力指標比較/（pg/mL，）

注：TAC為總抗氧化能力，MDA為丙二醛

2.6 卵泡液褪黑素與氧化應激指標間的相關(guān)性分析相關(guān)性分析結(jié)果顯示，卵泡液褪黑素水平與TAC水平呈正相關(guān)（r＝0.705，P＜0.05），未發(fā)現(xiàn)卵泡液褪黑素水平與MDA 水平之間的相關(guān)性（r＝-0.110，P＞0.05）。

3 討論

目前有關(guān)PCOS的具體產(chǎn)生機制還沒有完全明確。大量研究證實，PCOS 卵母細胞質(zhì)量降低很大程度上與氧化應激相關(guān)，推測PCOS 的產(chǎn)生因素之一是由于氧化應激，引發(fā)卵母細胞質(zhì)量變差的主要因素或許是氧化損傷［10-12］。病人卵泡液中氧化應激水平升高，且與卵母細胞中紡錘體缺失比例增多有關(guān)，致使其受精率、優(yōu)胚率及臨床妊娠率降低，推測過氧化損傷可能是卵母細胞質(zhì)量下降的原因之一［13-14］。褪黑素屬于吲哚類的神經(jīng)內(nèi)分泌激素之一，其分布范圍較廣，在多種生物體內(nèi)均可發(fā)現(xiàn)。研究表明，褪黑素的分泌會受到多種外界因素的影響（光照等），能夠根據(jù)外界環(huán)境發(fā)生的變化而對機體產(chǎn)生適應性生理的過程進行調(diào)控，在生物的生長、發(fā)育、繁殖過程中均扮演重要角色［15-17］。較早研究結(jié)果指出，褪黑素的主要功能為調(diào)控體內(nèi)晝夜節(jié)律，隨著科技的發(fā)展與研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)褪黑素屬于強效的內(nèi)源性抗氧化劑之一，能夠調(diào)節(jié)機體的卵泡發(fā)育、性發(fā)育且在維持妊娠方面具有十分重要的作用。臨床研究證實，褪黑素在卵泡液中的表達較高。近年來，有學者提出卵泡液中的褪黑素能夠保護卵母細胞使其免受氧化應激損傷。

多囊卵巢綜合征屬于一類多見的生育年齡婦女的內(nèi)分泌和代謝異常所出現(xiàn)的疾病，卵泡液成分以及水平的改變對婦女生殖功能有十分關(guān)鍵的作用［18-20］。研究人員以SD大鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)采取摘除松果體或長時間的光照等方式能夠?qū)ν屎谒氐姆置谄鸬揭种谱饔茫瑢е麓笫蟪霈F(xiàn)PCOS 的癥狀以及病理改變。目前針對PCOS病人卵泡液中褪黑素濃度是否有變化在國內(nèi)外的研究中均較為少見，因此，本研究對PCOS 病人卵泡液中褪黑素水平與氧化應激指標的相關(guān)性進行分析，探討其是否參與了PCOS 卵母細胞質(zhì)量下降。研究表明，觀察組病人卵泡液中褪黑素表達降低、TAC 表達下降、MDA表達上升；而且，病人卵泡液中褪黑素表達與TAC呈正相關(guān)關(guān)系。該結(jié)果說明在PCOS病人的卵泡液褪黑素與TAC呈正相關(guān)，提示褪黑素可能為卵泡液中重要的抗氧化劑，具有保護卵母細胞使其避免受氧化應激損害的作用，在卵泡發(fā)展過程中扮演重要角色［21，22］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，PCOS 病人可能有卵母細胞質(zhì)量下降，且該類病人卵泡液中MET 水平降低，卵泡液中MET 水平與TAC 成正相關(guān)，即MET 可能參與了PCOS 病人卵母細胞過氧化損傷，這些研究結(jié)果與本研究可以相互印證。

多囊卵巢綜合征病人的卵母細胞由于其受到氧化應激損害，并引發(fā)卵母細胞質(zhì)量變差，從而對治療效果產(chǎn)生嚴重影響，推測可能與卵泡液中褪黑素水平的降低具有一定的關(guān)系，這為PCOS 的發(fā)病因素的研究及診治提供了科學的依據(jù)。因此對褪黑素在PCOS發(fā)病中的具體機制進行進一步的研究探索，為提升PCOS病人的診治提供新的治療思路。