冠心病病人自身相關(guān)因素對體外擴(kuò)增后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量的影響

楊宇輝，趙文強(qiáng)

作者單位：安徽省第二人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，安徽 合肥 230000

近年來，細(xì)胞治療作為新興的治療方式，被廣泛應(yīng)用于包括缺血性心臟病（Ischaemic heart disease，IHD）在內(nèi)的眾多疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的資料，IHD 是當(dāng)今世界上最主要的死亡原因［1］。而患有IHD的老年人口不斷增長以及IHD并發(fā)癥如頑固性心絞痛、心衰等可使國家負(fù)擔(dān)的健康預(yù)算進(jìn)一步增加。使用成人間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)、治療受損心肌的研究已有臨床以及臨床前研究。其中，大多數(shù)臨床試驗使用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stromal cells，MSCs）［2-4］。然而，也有部分臨床機(jī)構(gòu)使用脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose tissue-derived stromal cells，ASCs）進(jìn)行臨床試驗［5-6］。據(jù)信，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞通過其旁分泌效應(yīng)刺激血管（血管生成）和心臟組織（心肌發(fā)生）的生長［4］。因此，用于臨床治療的細(xì)胞數(shù)目與病人的治療效果有關(guān)聯(lián)性，同時，病人相關(guān)因素（病史、生活習(xí)慣等）在內(nèi)的多種因素可影響體外培養(yǎng)最終獲得的干細(xì)胞數(shù)量。有研究報道，IHD 引起的病人相關(guān)因素對間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量的影響以及自體細(xì)胞的分離及擴(kuò)增潛力［4，7-8］。Mozid 等［7］發(fā)現(xiàn)，IHD 病人年齡增加與外周血CD34+細(xì)胞收獲率降低和骨髓CD34+細(xì)胞濃度降低有關(guān)。然而，F(xiàn)riis 等發(fā)現(xiàn)，來自年輕健康供體的骨髓MSCs 與患有嚴(yán)重慢性IHD 老年病人的骨髓MSCs增殖能力沒有差異［3］。

本研究旨在探討病人自身相關(guān)因素尤其是可能導(dǎo)致IHD 的危險因素對體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)目的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料納入自2017年6 月至2018年1 月安徽省第二人民醫(yī)院收治的冠心病病人60例，男36例，女24 例，年齡（66.5±6.3）歲，體質(zhì)量（27.4±2.1）kg/m2；60例病人中，糖尿病18例，高血壓病60例，心肌梗死史15例，經(jīng)皮冠狀動脈介入治療史39例，曾吸煙或仍吸煙32 例，不吸煙28 例，射血分?jǐn)?shù)（56.1±10.8）%，收縮壓（143.74±10.97）mmHg，舒張壓（95.99±11.82）mmHg，總膽固醇（3.93±0.82）mmol/L，體外擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)（61.3±67.1）×106。所有病人均沒有嚴(yán)重的肝腎疾病、風(fēng)濕性疾病、惡性腫瘤等。病人或近親屬同意并簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)冠心病診斷依據(jù)和診斷原則參考CN-WS 2010年1月1日發(fā)布的冠狀動脈硬化性心臟病診斷標(biāo)準(zhǔn)。即至少滿足以下其中一條即可診斷冠心?。海?）依1997年WHO發(fā)布的冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)，即有典型的心絞痛及心肌梗死癥狀發(fā)作，卻無重度主動脈瓣關(guān)閉不全、狹窄重度主動脈炎，也無證據(jù)支持冠狀動脈栓塞或心肌??；（2）男性40歲、女性45歲以上病人，在休息時心電圖有明顯心肌缺血表現(xiàn)，或無其他誘因的心電圖運動試驗陽性，并有以下三項中的兩項者：高膽固醇血癥、糖尿病、高血壓；（3）做冠狀動脈造影檢查時顯示有多支或一支主要冠狀動脈狹窄且狹窄程度超過50%的病人；（4）做過冠狀動脈旁路移植手術(shù)或經(jīng)皮冠狀動脈介入治療手術(shù)的病人。

1.3 骨髓穿刺與培養(yǎng)采用密度梯度離心法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞［9］。使用局部麻醉的方法從病人髂前上棘抽取3～6 mL 骨髓液，其中，骨髓穿刺液的稀釋使用等量鹽酸鹽緩沖鹽水（PBS）加入含有Percoll 分離液的離心管中以2 000 r/min 離心2 min，收集單個核細(xì)胞層。這些細(xì)胞在PBS 中洗滌2 次，離心后重新收集。完全培養(yǎng)基（使用Dulbecco 的改良Eagle 培養(yǎng)基（DMEM））、10%醫(yī)藥級低糖胎牛血清（FBS）和1%青霉素/鏈霉素用于MSC 的培養(yǎng)［3，10］。在37 ℃、5%二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，2 d 后進(jìn)行換液（半量），之后每3 天換液1次，觀察細(xì)胞生長情況，這些細(xì)胞的培養(yǎng)、擴(kuò)增過程約4～6 周，由于供體機(jī)體條件的不同，骨髓MSCs 的擴(kuò)增潛力也不同，因此擴(kuò)增的持續(xù)時間也不同。待達(dá)到80%～90%細(xì)胞融合率以上時用0.25%胰蛋白酶消化，并傳代2次。流式細(xì)胞儀檢測CD45、CD34、CD105、CD73、CD13和CD90的表達(dá)［11-12］，最終，所得細(xì)胞在NucleoCounter上對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件包內(nèi)進(jìn)行統(tǒng)計分析，連續(xù)型變量以，表示，采用兩獨立樣本t檢驗。分類變量以例（%）表示，采用χ2檢驗。采用Pearson 線性回歸分析細(xì)胞總計數(shù)與各因素的關(guān)聯(lián)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 性別、病史、吸煙對骨髓MSCs 體外擴(kuò)增后所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)量的影響如圖1所示，本研究發(fā)現(xiàn)，從未吸煙病人骨髓MSCs體外擴(kuò)增所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)量多于吸煙病人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝2.491，P＝0.015 6）；男性、無糖尿病史、無梗死病史、無PCI 治療史、病人的骨髓MSCs 體外擴(kuò)增所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)量多于女性、有糖尿病史、有梗死病史、有PCI 治療史的病人，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 性別、病史、吸煙對骨髓MSCs體外擴(kuò)增后所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)量的影響

2.2 年齡、BMI、射血分?jǐn)?shù)、膽固醇、血壓對骨髓MSCs體外擴(kuò)增后所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)量的影響本研究發(fā)現(xiàn)，年齡與骨髓MSCs 體外擴(kuò)增后所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)目呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.502，P＜0.000 1）；BMI、射血分?jǐn)?shù)、膽固醇、收縮壓、舒張壓與骨髓MSCs 體外擴(kuò)增所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)目無明顯相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）。見圖2。

圖2 年齡、BMI、射血分?jǐn)?shù)、膽固醇、血壓對骨髓MSCs體外擴(kuò)增后所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)量的影響

3 討論

本研究納入了60例冠心病病人，探索病人相關(guān)因素對骨髓MSCs體外擴(kuò)增所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)量是否有影響。

我們發(fā)現(xiàn)年齡和骨髓MSCs 體外擴(kuò)增所達(dá)到的數(shù)量之間存在關(guān)聯(lián)。這與Mozid 等［7］的研究結(jié)果相同，他們在201例IHD、擴(kuò)張型心肌病或AMI病人中發(fā)現(xiàn)年齡與外周血和骨髓中的CD34+細(xì)胞之間存在顯著的相反關(guān)系。其原因可能是由于研究的細(xì)胞類型與目前的干細(xì)胞不相同。然而，F(xiàn)riis 等［3］以前的研究表明，在16例年輕健康供體的骨髓來源的MSCs的增值能力和已知患有嚴(yán)重慢性IHD的15例老年病人的增殖能力的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

Neef等［8］研究表明，糖尿病病人骨髓MSCs體外擴(kuò)增后的集落形成單位數(shù)量高于無糖尿病病人。但本研究無法證實糖尿病病人和無糖尿病病人之間存在相同的差異。

近年來，干細(xì)胞治療正作為一種治療選擇被廣泛研究應(yīng)用［13-15］。有報道指出，干細(xì)胞心肌內(nèi)注射治療心臟病的效果取決于注射的細(xì)胞量，因為冠心病與其他非冠心病病人骨髓MSCs 的生長曲線、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表型并無差別，因此體外擴(kuò)增所得到的細(xì)胞數(shù)目是此治療方式的基礎(chǔ)。大多數(shù)正在進(jìn)行的臨床試驗使用燒瓶進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，但趨勢已趨向于使用同種異體細(xì)胞和使用生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。在過去的幾年中，已經(jīng)開發(fā)了更多的技能和更好的工具來培養(yǎng)、收集細(xì)胞，同時，細(xì)胞的生長條件和傳代方法也已經(jīng)得到改善［16-18］。因此，合適的干細(xì)胞供體成為研究的重點。冠心病是由于全身系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的以心臟為突出表現(xiàn)的心臟?。?9］，因此冠心病病人的相關(guān)因素可能能影響骨髓MSCs體外擴(kuò)增所達(dá)到數(shù)量，并以此預(yù)測未患冠心病的供體的骨髓MSCs體外擴(kuò)增的能力。

關(guān)于年齡對骨髓MSCs 體外擴(kuò)增的影響，我們的結(jié)果與有關(guān)祖細(xì)胞體外擴(kuò)增數(shù)目的報道一致［20］，均顯示較大的年齡與較少的體外培養(yǎng)數(shù)目相關(guān)。這可能是由于隨著年齡增加，參與細(xì)胞生存、衰老、增殖調(diào)控的microRNAs 的表達(dá)也發(fā)生改變。Liu等［21］發(fā)現(xiàn)，miR-17-92 簇可以調(diào)控神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖及存活，同時，隨年齡增加其表達(dá)下調(diào)最為明顯。此外，有學(xué)者［22］發(fā)現(xiàn)，18 歲年輕人骨髓間間充質(zhì)干細(xì)胞體外傳代至第12 代時出現(xiàn)衰老征象，同時，這種傳代衰老一方面可能與體內(nèi)微環(huán)境和體外培養(yǎng)條件的差異有關(guān)，另一方面與端?？s短所致體細(xì)胞的有限增殖有關(guān)。他還指出，與取自老年人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，年輕人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中具有更高的群體倍增水平。

吸煙可從形態(tài)學(xué)、增殖凋亡、Ca+、尼古丁型乙酰膽堿受體表達(dá)變化等方面影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性及功能。例如，被吸入人體的尼古丁可通過影響NO 調(diào)控細(xì)胞增殖或凋亡，后者已被證實在高濃度的情況下可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，低濃度延緩細(xì)胞凋亡［23］。不僅如此，尼古丁還可以造成骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs 線粒體DNA 損傷，促進(jìn)ROS 產(chǎn)生。高濃度的ROS攻擊線粒體膜，線粒體膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，造成后者通透性改變，釋放凋亡誘導(dǎo)因子，形成ROS-線粒體DNA損傷的惡性循環(huán)，使細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡過程［24］。

我們的研究暫時限于骨髓MSCs，而外國學(xué)者發(fā)表的研究同時納入了脂肪源性干細(xì)胞，因此，僅分析了一種特定類型細(xì)胞的擴(kuò)增或分化潛能可能存在一定的偏倚，同時本研究的樣本量較少，如已戒煙和現(xiàn)在吸煙分別為11 和21 例，這兩組間雖然MSCs培養(yǎng)所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義（分別為59.7×106和60.4×106；t＝1.342，P＝0.118），但由于較小的樣本量限制了進(jìn)一步探究戒煙時長可能對病人體外MSCs培養(yǎng)擴(kuò)增結(jié)果的影響。

綜上所述，本研究表明病人相關(guān)因素可能影響MSCs 培養(yǎng)擴(kuò)增后的結(jié)果。BMI 與培養(yǎng)擴(kuò)增后的自體ASC 的數(shù)量以及所有病人的MSCs 和ASCs 聯(lián)合使用存在著顯著的相關(guān)性。此外，高血壓病人的ASCs 數(shù)量和所有病人的MSCs 和ASCs 的數(shù)量均達(dá)到了較高的水平。此外，性別，高血壓和左心室射血分?jǐn)?shù)可能影響體外培養(yǎng)擴(kuò)增后獲得的骨髓MSCs 的數(shù)量。