微管相關蛋白樣激酶1 在胃癌組織中的表達及其臨床意義

賈長河，謝毅，袁媛，劉博偉，任穎

作者單位：河南省人民醫(yī)院，a消化科，b胃腸外科，c病理科，河南 鄭州 450003

微管相關蛋白樣激酶1（Doublecortin-like kinase 1，DCLK1）是一種微管相關蛋白（microtuble-associated proteins，MAPs），主要表達在腫瘤干細胞，被認為是胃腸道腫瘤干細胞標志物［1］，以往的研究顯示，DCLK1 高表達與結腸癌［2］、膀胱癌［3］和肺癌［4］等癌癥的發(fā)生與轉移有關。本研究通過免疫組化的方法檢測比較胃癌組織和癌旁正常組織中DCLK1的表達，分析DCLK1表達對胃癌發(fā)生發(fā)展及預后的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2006年5 月至2011年7 月在河南省人民醫(yī)院胃腸外科行胃癌根治術的267例胃癌病人的臨床資料，其中男170 例，女97 例；年齡（54±13）歲；中高分化腺癌129 例，低分化腺癌138例；T1～T2 期144 例，T3～T4 期123 例；神經侵犯153例，無神經侵犯114 例；脈管侵犯139 例，無脈管侵犯128 例；淋巴轉移206 例，無淋巴轉移61 例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期111 例，Ⅲ～Ⅳ期156 例。排除遠處轉移病例。同時選取癌旁正常組織標本138例作為對照。病人或其近親屬對本研究知情同意，簽署了知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 組織來源及試劑267例胃癌標本及138例癌旁正常組織學標本來自河南省人民醫(yī)院病理科保存的石蠟包埋組織標本，切片均經HE 染色復讀確認，術前未接受放化療。DCLK1 單克隆抗體（美國Abcam 公司，貨號：ab109029）。免疫組織化學試劑盒和DAB顯色液均購自武漢proteintech公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學檢測DCLK1 的表達 按免疫組織化學法的試劑盒說明書嚴格操作，一抗DCLK1單克隆抗體工作濃度為1∶100，每批染色均設立陰性對照（PBS液代替一抗）和陽性對照。所有切片采用盲法由兩名高年資病理科醫(yī)生進行獨立判定。在光學顯微鏡下觀察，陽性細胞出現(xiàn)棕褐色染色，免疫組化結果采用細胞染色陽性率和著色強弱雙評分半定量法進行評價，在顯微鏡下隨機選擇10個高倍視野（×400），每個視野統(tǒng)計100個細胞，計算染色陽性的細胞比例，按照細胞染色陽性率對其評分為1～4 分，分別代表染色陽性率≤25%，26%～50%，51%～75%，76%～100%。著色強弱范圍評分為0～3分，分別代表無著色，淡黃色，棕黃色，棕褐色。細胞染色陽性率與著色強弱的乘積分組：＞4 分為高表達組，≤4分為低表達組。

1.3.2 臨床資料收集 首先在病理科查找2006年5月至2011年7月期間病理確診為胃癌的病人資料，包括性別、年齡、病理分型、有無淋巴轉移、有無脈管侵犯和臨床分期等。

1.3.3 隨訪 通過復診、電話、微信和郵件等方式進行隨訪，記錄每例病人的生存狀況，術后是否復發(fā)及復發(fā)時間，復發(fā)是指局部區(qū)域復發(fā)或/和遠處轉移，根據(jù)病理活檢或2個以上影像學檢查確定，不能確定復發(fā)的按不復發(fā)計，對于失訪或因非腫瘤原因導致的死亡按刪失數(shù)據(jù)計，隨訪截止時間為2016年10 月。統(tǒng)計分析5年總生存期（overall survival，OS）和5年無病生存率（disease-free survival，DFS）。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0 進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較/單因素分析采用χ2檢驗。對于單因素分析中P≤0.10 的因素代入Cox 比例風險回歸模型分析預后的獨立影響因素。以Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank法比較生存率的差異。檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 胃癌病人臨床病理學特征及與DCLK1表達的關系DCLK1 主要在胃組織的細胞漿內呈棕黃色顆粒，DCLK1在癌旁正常組織和胃癌組織中均有表達，見圖1。

267 例胃癌組織中有232 例呈陽性表達，其中192 例為高表達，40 例為低表達，35 例為陰性。138例癌旁正常胃組織中有58例呈現(xiàn)陽性表達，其中36例為高表達，22 例為低表達，80 例陰性。胃癌組織中DCLK1總體表達率（86.9%，232/267）及高表達率（71.9%，192/267）均高于癌旁正常組織（42.0%，58/138；26.1%，36/138），差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）。見表1。

表1 DCLK1在胃癌及癌旁正常胃組織中的表達率/例（%）

DCLK1高表達與病人性別、年齡，腫瘤大小，位置等無關（P＞0.05）；與腫瘤分化程度，浸潤深度，神經侵犯，脈管侵犯，淋巴轉移及臨床分期等臨床病理因素有關（P＜0.05），見表2。

2.2 影響胃癌病人預后的Cox 分析將上述幾個單因素存在統(tǒng)計學意義的自變量分別賦值（DCLK1低表達＝1，DCLK1高表達＝2；分化程度低＝1，分化程度高/中＝2；浸潤深度T1/T2＝1，T3/T4＝2；脈管侵犯＝1，脈管未侵犯＝2；淋巴轉移＝1，淋巴未轉移＝2），生存分別賦值為生存＝1，死亡＝0，無復發(fā)生存分別賦值為：復發(fā)生存＝1，無復發(fā)生存＝0，將自變量和因變量納入Cox分析，用Forward Conditional 逐步回歸分析，找出影響預后的獨立因素。

對5年OS 的Cox 分析顯示：DCLK1 表達、分化程度，浸潤深度和臨床分期是總生存（OS）的獨立影響因素，見表3。對5年無復發(fā)生存率（DFS）的Cox分析顯示：DCLK1 表達，分化程度，淋巴轉移，臨床分期是5年無復發(fā)生存率的獨立影響因素，見表4。

表2 DCLK1表達與胃癌臨床病理特征的關系

表3 Cox多因素回歸分析胃癌OS的影響因素

表4 Cox多因素回歸分析胃癌DFS的影響因素

2.3 DCLK1表達水平與病人生存預后分析截至2016年10月，267例病人中共有23例失訪，5例死于其他疾病，其中高表達組失訪12例，2例死于其他疾病，低表達組失訪11例，3例死于其他疾病。自手術之日起至死亡或隨訪截止，最長生存期為125.32個月，最短生存期5.6個月，中位生存期為32.68個月。DCLK1高表達組5年總生存率為56.10%，無病生存率為39.70%，中位生存期為26.38個月；DCLK1低表達組5年總生存率為68.90%，無病生存率為47.70%，中位生存期為42.63個月。Kaplan-Meier 生存分析顯示（圖2），與DCLK1 低表達的病人相比，DCLK1 高表達的胃癌病人的5年總生存率（χ2＝4.232，P＝0.040）和5年無病生存率（χ2＝3.905，P＝0.048）均較差。

圖2 Kaplan-Meier法分析DCLK1表達對胃癌病人5年總生存率和無病生存率的影響：A為總生存率；B為無病生存率

3 討論

在世界范圍，胃癌的發(fā)生率和死亡率在過去幾十年中雖然下降，但依然是排名第四的最常見的惡性腫瘤，排名第二的癌癥相關致死因素，是人類健康的重大威脅［5-6］。手術切除是唯一可能根治胃癌的治療方法，特別是對于處于疾病早期的胃癌病人［7］。但是對于許多胃癌病人來說，早期癥狀不典型，確診時已經處于疾病晚期階段，由于腫瘤轉移和術后復發(fā)率很高，晚期胃癌病人通常在術后24個月內發(fā)生死亡，預后很差［8-9］。為了提高胃癌早期診斷，有必要發(fā)展更加可信的生物標志物以預測病人臨床結局。

微管相關蛋白DCLK1 最早被發(fā)現(xiàn)是小腸毛細胞（tuft cell）標志［10］，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)DCLK1標記腸道和胰腺腫瘤干細胞［11-12］，結腸癌和胰腺癌的發(fā)生和進展依賴DCLK1陽性細胞［11，13-15］。肝癌、結腸癌、胰腺癌和食管癌等癌癥中均高表達DCLK1［12，16-19］。DCLK1 的表達對于腫瘤干細胞、癌癥生長及轉移均具有重要作用［20-22］。但是DCLK1 在胃癌中的表達以及對胃癌診斷治療預后的意義研究的較少。本研究通過免疫組化檢測比較了267 例胃癌組織及138 例癌旁正常組織中DCLK1 的表達，分析DCLK1 表達與胃癌臨床病理學特征及預后的關系，結果表明，胃癌組織中DCLK1 高表達率顯著高于癌旁正常組織，DCLK1 高表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、神經侵犯、脈管侵犯、淋巴轉移、臨床分期等臨床病理因素有關。Fan 等［23］的研究結果表明：DCLKl 高表達的肝癌病人無病生存期明顯縮短（HR＝1.546，95%CI：1.330～1.725）。梁東等［24］研究發(fā)現(xiàn)DCLKl 高表達的肝癌病人3年無瘤生存率（16.7%）明顯低于低表達者（46.2%）。孟慶彬等［25］的研究結果提示：胃癌病人中DCLKl 高表達者的5年生存率和5年無瘤生存率分別為39.0% 和37.0%，明顯低于DCLKl 低表達者的65.8% 和64.5%，以上研究報道均提示DCLKl 高表達的病人預后較差。本研究結果顯示：胃癌病人中DCLK1高表達組5年總生存率和無復發(fā)生存率均低于DCLK1 低表達組。Cox 分析提示，DCLK1 高表達是胃癌病人總體生存率和無復發(fā)生存率的獨立影響因素，提示DCLKl 高表達的胃癌病人預后較差，同上述文獻報道的結果一致。

綜上所述，DCLK1 是胃癌潛在的生物標記分子，可以作為一種新的胃癌的靶標，開發(fā)新的診治方法以及判斷預后的方法。