黃芪破壁飲片4 種黃酮類成分分析及重金屬含量測定

王艷，鄭夏生，李文康，成金樂

作者單位：1廣州中醫(yī)藥大學中藥資源科學與工程研究中心、嶺南中藥資源教育部重點實驗室（廣州中醫(yī)藥大學）、國家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實驗室，廣東 廣州 510006；2國家中醫(yī)藥管理局中藥破壁飲片技術(shù)與應(yīng)用重點研究室，中山市中智藥業(yè)集團有限公司，廣東 中山 528437；3中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州510006

黃芪為2015年版《中國藥典》正文收錄的品種，來源于豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的 干 燥根［1］，具補氣固表，利尿，排膿，斂瘡生肌的作用［1］。中藥破壁飲片是通過現(xiàn)代粉碎技術(shù)將傳統(tǒng)中藥飲片加工至D90＜45 μm（300 目以上）的破壁粉體，進而通過無添加成型技術(shù)制成的30～100 目的干燥顆粒狀飲片［2］。隨著經(jīng)濟水平的提高、亞健康人群的增長，一些慢急性如糖尿病、高血壓等已經(jīng)成為困擾人們生活的主要因素。在現(xiàn)實生活中，越來越多的人群更愿意選擇中藥或中成藥以達到調(diào)節(jié)血糖血脂血壓、改善記憶睡眠等目的［3］。而中藥破壁飲片與傳統(tǒng)飲片相比，具有全成分入藥、均勻性好、利用率高、服用簡單、便攜的特點，經(jīng)過細胞破壁后中藥飲片的有效物質(zhì)溶出率更高［4］，因此受到人們的青睞?，F(xiàn)代藥理學研究表明：黃芪的藥理作用主要表現(xiàn)為增強機體免疫力、抗病毒，以及作用于心血管系統(tǒng)、延緩衰老等作用［5］。對心血管的作用則源于黃芪中所含皂苷類和黃酮類化合物。而目前對黃芪皂苷的研究較多，對多種黃酮類成分同時測定的研究報道相對較少，黃芪中黃酮類化合物主要包括毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、芒柄花苷、刺芒柄花苷［6-9］等成分，通過多種黃酮類成分評價黃芪的質(zhì)量更全面和具有說服力，因此本文收集了10個批次的黃芪原藥材，并制備成10批黃芪破壁飲片進行研究，利用高效液相色譜法（HPLC）建立一種可以同時測定黃芪破壁飲片中4種黃酮類成分含量的方法。由于藥材受其生長環(huán)境的污染以及藥材種類的自身特點，可能含有一定量的重金屬等有害元素，不僅會影響藥材的質(zhì)量，同時也會危害人體健康［10］，近年來，對于重金屬元素在環(huán)境中的毒害作用及其生物效應(yīng)的研究報道較多［11-13］，重金屬污染問題威脅人們所處生活環(huán)境及身體健康，因此對直接被用于口服的中藥破壁飲片有害元素的監(jiān)測是很有必要。安全有效是評價藥品的重要指標，圍繞這一中心不僅要對中藥有效成分進行控制，還要對藥物中的有毒、有害物質(zhì)進行控制。在確保了有效成分的含量后，監(jiān)測黃芪破壁飲片中5 種重金屬［鎘（Cd）、銅（Cu）、鉛（Pb）、汞（Hg）、砷（As）］的含量，為其生產(chǎn)中的質(zhì)量控制和安全用藥提供科學依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥物及試劑

1.1.1 藥物 10 批黃芪原藥材購自甘肅岷縣順興和中藥材有限公司，經(jīng)廣東省中山市中智藥業(yè)集團有限公司賈世清中藥師鑒定為豆科植物蒙古黃芪的干燥根。并制備成黃芪破壁飲片，批號：

20170601（S1）、20170602（S2）、20170701（S3）、20170702（S4）、20170703（S5）、20170704（S6）、20170705（S7）、20170706（S8）、20170707（S9）、20170708（S10）。

1.1.2 對照品 毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素購自中國食品藥品檢定研究院（批號分別是111920-201606，111703-201504），毛蕊異黃酮和刺芒柄花苷均購自成都曼斯特生物科技有限公司（批號分別是MUST-16120911，MUST-17041101）。Pb 1 000 μg/mL、Cd 1 000 μg/mL、As 1 000 μg/mL、Hg 1 000 μg/mL、Cu 1 000 μg/mL、銦（In）1 000 μg/mL、（鉍）Bi 1 000 μg/mL、鍺（Ge）1 000 μg/mL、（金Au）1 000 μg/mL均購于國家金屬及電子材料分析測試中心。

1.1.3 材料及試劑 甲醇、乙腈、硝酸均為色譜純；水為超純水；氬氣（廣東省中山市炬輝工業(yè)氣體有限公司）；其他試劑為分析純。

1.2 儀器Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；KQ-400KOE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；METTLER AB204-S 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）、島津AUW220D 電子天平（島津公司）、Thermo Fisher ICAP-Q 電感耦合等離子體質(zhì)譜（美國賽默飛）、MARS6 CLASSIC微波消解系統(tǒng)（美國CEM 公司）、TM D24UV 純水機（德國默克密理博公司）。

2 實驗方法

2.1 黃芪破壁飲片4種黃酮類成分含量測定方法

2.1.1 提取方式考察 本實驗比較回流提取、超聲提取、浸泡三種方法的提取效果，取3份黃芪破壁飲片（批號：20170705）各2.5 g，精密稱定，精密加入100%甲醇25 mL，稱重，其中1 份樣品回流1 h；1 份樣品以超聲功率80%超聲1 h；1份樣品浸泡1 h，放冷，用100%甲醇補足失重，搖勻，用濾紙過濾，續(xù)濾液經(jīng)過0.45 μm 微孔濾膜濾過，進樣10 μL，結(jié)果顯示回流提取、超聲提取和浸泡三種提取方式4 種黃酮類總量分別為0.494、0.317、0.298 mg/g，故選擇加熱回流的提取方式。

2.1.2 提取溶劑的考察 取黃芪破壁飲片（批號：20170705）2.5 g，精密稱定，分別精密加入100%甲醇、乙醇、50%甲醇、70%甲醇、80%甲醇25 mL，稱重，回流4 h，放冷，用相應(yīng)的提取溶劑補足失重，搖勻，用濾紙過濾，續(xù)濾液再經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜濾過，進樣10 μL，結(jié)果表明，用100%甲醇提取所測得的各主要色譜峰的峰面積之和最大，因此，選擇100%甲醇作為黃芪破壁飲片的提取溶劑。

2.1.3 回流時間的考察 取黃芪破壁飲片（批號：20170705）2.5 g，精密稱定，精密加入甲醇25 mL，稱重，考察不同回流時間：1、2、3、4 h，放冷，補足失重，搖勻，用濾紙過濾，續(xù)濾液再經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜濾過，進樣10 μL，結(jié)果顯示回流1、2、3、4 h 4種黃酮類的總量分別是0.744、0.898、1.067、1.193 mg/g，回流4 h時黃酮類總量最大，故選擇回流時間4 h。

2.1.4 供試品溶液的制備 取黃芪破壁飲片2.5 g，精密稱定，精密量取甲醇25 mL，稱重，加熱回流4 h，用甲醇補足失重，搖勻，用濾紙過濾，續(xù)濾液再經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.1.5 檢測條件的確定

2.1.5.1 檢測波長的選擇 用十八烷基硅膠為填充劑，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（B）-0.15%甲酸水溶液（A），按照程序梯度洗脫：0～10 min，5%～30 %（B）；10～30 min，30 %（B）；30～50 min，30 %～60%（B）；50 min～52 min，60%～5%（B）；52～60 min，5%（B）；柱溫：25 ℃；體積流量：0.6 mL/min；進樣量：10 μL。在選擇檢測波長過程中，采用全波長掃描，圖譜顯示在254 nm處樣品出峰數(shù)多，各主要峰面積面積之和較大，故選254 nm作為檢測波長。

2.1.5.2 流動相的確定 用十八烷基硅膠為填充劑，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為①甲醇-水，②乙腈-水，③乙腈-0.1%甲酸水溶液，④乙腈-0.15%甲酸水溶液，⑤乙腈-0.2%甲酸水溶液，⑥乙腈-0.1%磷酸水溶液和⑦乙腈-0.1%乙酸水溶液梯度洗脫。柱溫：25 ℃；體積流量：0.6 mL/min；進樣量：10 μL。比較各流動相下圖譜的分離度和半峰寬，結(jié)果選?、芴栂到y(tǒng)為流動相。

2.1.6 對照品的制備 分別精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對照品適量，用甲醇溶解并定量稀釋制成濃度分別為0.203 48、0.119 97、0.048 108、0.035 576 mg/mL 的混合對照品儲備液。

2.1.7 方法學考察

2.1.7.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.1.6 項下混合對照品儲備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 分別置于10 mL容量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，進樣10 μL。以含量（C）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，得到回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)如下：毛蕊異黃酮葡萄糖苷：?＝5 422.7C+39.45（0.020 348～0.101 74 mg/mL，r＝0.999 9，n＝5）；刺芒柄花苷：?＝6 029.5C-20.44（0.011 997～0.059 985 mg/mL，r＝0.999 9，n＝5）；毛蕊異黃酮：?＝8 317.7C+8.45（0.004 810 8～0.024 054 mg/mL，r＝0.999 8，n＝5）；芒柄花素：? ＝9 360.3C+35.99（0.003 557 6～0.017 788 mg/mL，r＝0.999 5，n＝5）。以上結(jié)果表明4種黃酮類化合物在本分析方法中呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可用于定量分析。

2.1.7.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL 連續(xù)進樣6 次，計算4 種黃酮類成分的峰面積，RSD值分別為1.36%，3.01%，2.68%，3.11%，表明儀器精密度良好。

2.1.7.3 重復(fù)性試驗 取黃芪破壁飲片（批號：20170705）2.5 g，共6份，分別制備成供試品溶液，精密吸取供試品10 μL 分別進樣，計算毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素4 種化合物含量的RSD 分別是1.87 %、1.55 %、0.79 %、3.10%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.1.7.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取黃芪破壁飲片供試品溶液（批號：20170705）10 μL，分別于0、4、8、12、16、20、24 h 進樣，計算4 種成分峰面積RSD 值分別為2.62%、2.13%、1.33%、2.75%，表明樣品及方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的黃芪破壁飲片（20170705）1.25 g，分成3 組，分別加入“2.1.6”項下的混合對照品2、4、6 mL，按“2.1.4”項下的方法制備供試品，精密吸取10 μL 進樣，4 種成分的平均加樣回收率分別是：毛蕊異黃酮葡萄糖苷99.03%（RSD＝1.62%；n＝3）、刺芒柄花苷98.6%（RSD＝3.79%；n＝3）、毛蕊異黃酮102.2%（RSD＝1.67%；n＝3）、芒柄花素106.3%（RSD＝2.31%；n＝3），表明本方法對于目標化合物的提取效率高。

2.2 黃芪破壁飲片5種重金屬含量測定方法

2.2.1 標準品溶液的制備 取Pb 標準溶液分別配制制成濃度為1、5、10、20、40 ppb的溶液；取Cd標準溶液分別配制成濃度為0.5、2.5、5、10、20 ppb 的溶液；取Cu 標準溶液分別配制成濃度為25、50、100、200、500 ppb 的溶液；取As 標準溶液分別配制成濃度為1、5、10、20、40 ppb的溶液；取Hg標準溶液分別為0.2、0.5、1、2、5、10 ppb 的溶液；精密量取Ge 標準溶液0.1 mL，In、Bi 標準溶液1 mL，加水定量至濃度分別為100、10、10 ppb。精密量取Au標準溶液1 mL用水稀釋至1 000 mL配制成1 μg/mL的溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取上述10 批黃芪破壁飲片約0.5 g，精密稱定，置耐壓耐高溫微波消解罐中，加65%硝酸8 mL，密閉并按消解程序（10 min升至130 ℃保持3 min；3 min 升至130 ℃保持3 min；4 min 升至190 ℃保持20 min）進行消解。消解完全后，消解液冷卻至60 ℃以下，取出消解罐，放冷，將消解液轉(zhuǎn)入到50 mL 的量瓶中，用少量水洗滌消解罐3 次，洗液合并于量瓶中，加入金單元標準溶液，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。除不加金單元素標準溶液外，余同法制備試劑空白溶液。

3 實驗結(jié)果

3.1 黃芪破壁飲片含量測定結(jié)果取不同批次的黃芪破壁飲片，按照“2.1.4”項下的方法進行供試品的制備，根據(jù)色譜條件進行分析，含量測定結(jié)果見表1，混合對照和供試品圖譜見圖1。結(jié)果顯示毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量符合2015 版《中國藥典》的控制限度，同時10 批黃芪破壁飲片4 種黃酮類成分的總量RSD 值為3.32%，10 批不同批次黃芪破壁飲片中黃酮類成分含量較穩(wěn)定，質(zhì)量基本一致。

表1 10批樣品4種黃酮類成分含量測定結(jié)果/（mg/g，）

表1 10批樣品4種黃酮類成分含量測定結(jié)果/（mg/g，）

3.2 黃芪破壁飲片5種重金屬含量測定結(jié)果 參照《中國藥典》2015年版四部通則0412 電感耦合等離子質(zhì)譜法測定。單位：mg/kg。結(jié)果見表2。建立鉛、鎘、銅、砷、汞金屬溶液的標準曲線，以鍺、銦、鉍三者為內(nèi)標，采用ICP-MS 進樣檢測。根據(jù)我國《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》限量指標規(guī)定重金屬總量≤20.0 mg/kg，鉛≤5.0 mg/kg，鎘≤0.3 mg/kg，汞≤0.2 mg/kg，銅≤20.0 mg/kg，砷≤2.0 mg/kg［14］。實驗結(jié)果均符合規(guī)定。

4 結(jié)論

4.1 同時監(jiān)測多個成分的意義中藥的成分復(fù)雜，僅用某一種有效成分的含量來評價黃芪破壁飲片的質(zhì)量不夠客觀真實，通過測定黃芪破壁飲片中4種黃酮類成分同時評價其質(zhì)量更全面。同時，藥典方法用于毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定的處理方法較為繁瑣，需要蒸干及定容等多步操作；而本實驗只進行了回流提取后過濾即可，大大簡短了操作時間。加樣回收實驗的結(jié)果也證明了本文優(yōu)化的方法并不影響對4種黃酮類化合物的提取。通過收集多批次黃芪原藥材制備成的黃芪破壁飲片同時測定其4 種黃酮類成分含量，加樣回收率和穩(wěn)定性試驗均表明其方法可行、穩(wěn)定性好，可用于黃芪破壁飲片黃酮類成分的定量分析。對于黃芪中另一類無紫外吸收的皂苷類成分，其與黃酮類成分同時應(yīng)用的方法還需要做進一步的摸索。從實驗結(jié)果也可以看出，10批黃芪破壁飲片中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量均大于0.2 mg/g，均符合2015年版《中國藥典》的要求，所測定結(jié)果中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和刺芒柄花苷的含量比毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量要大得多，在臨床應(yīng)用上，應(yīng)注意黃芪破壁飲片中總黃酮的含量及比例關(guān)系，其比例關(guān)系是否會對其療效產(chǎn)生影響應(yīng)做進一步的探索，同時不同批次的黃芪破壁飲片4種黃酮類成分含量存在一定的差異性，可能與采收期及存儲時間有一定的關(guān)系。

圖1 10批樣品（S1-S10）和混合對照品色譜圖

表2 10批樣品重金屬檢測結(jié)果/（mg/g，）

表2 10批樣品重金屬檢測結(jié)果/（mg/g，）

4.2 同時評價黃芪破壁飲片質(zhì)量和安全性的意義中藥中金屬元素的含量除與其基原植物自身對重金屬的富集有關(guān)之外，還與中藥的栽培環(huán)境有著密切關(guān)系。不同種類的重金屬可對神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、人體新陳代謝等產(chǎn)生危害。重金屬超標已成為影響中藥出口、阻礙我國中醫(yī)藥走向世界的主要問題［15］。所以了解中藥中重金屬的含量情況對于正確制訂重金屬的限定標準具有指導意義，并為藥材的GAP規(guī)?；N植提供重要的數(shù)據(jù)參考。同時甘肅是我國藥材的重要銷售區(qū)，本實驗收集甘肅產(chǎn)黃芪原藥材，對其所含鎘、砷、鉛、鎘、銅5 種重金屬進行了測定分析，為企業(yè)產(chǎn)品原料質(zhì)控提供參考。同時由于種植環(huán)境對中藥質(zhì)量有較大的影響，所以也有必要檢查土壤中重金屬的含量，確保中藥質(zhì)量的穩(wěn)定性，從源頭上解決重金屬含量超標問題。本實驗將黃芪破壁飲片4種黃酮類成分及重金屬含量同時測定，在確定有效成分含量的基礎(chǔ)上，保證其用藥的安全性。