高效液相色譜法測定硫酸沙丁胺醇有關(guān)物質(zhì)的含量

王鑫，劉宏大，薛雁，李萍，邸偉慶

作者單位：1蓬萊諾康藥業(yè)有限公司，山東 蓬萊 265600；2遼寧遠(yuǎn)大諾康生物制藥有限公司，遼寧沈陽 110171

硫酸沙丁胺醇為選擇性β2受體的激動(dòng)劑，能選擇性的激動(dòng)支氣管平滑肌β2受體，使平滑肌松弛，支氣管擴(kuò)張的作用較強(qiáng)［1-4］。硫酸沙丁胺醇原料藥在《美國藥典》（USP40）、《歐洲藥典》（EP9.0）［5］及《中國藥典》2015年版［6］中均有收載，硫酸沙丁胺醇有多種合成方法，根據(jù)圖1所示合成路線分析，在第5到第6反應(yīng)步驟中可能產(chǎn)生雜質(zhì)有A、C、D、F、M、J，在最后一步反應(yīng)中有可能產(chǎn)生雜質(zhì)O；根據(jù)圖2所以合成路線分析，有可能在最后一步生成雜質(zhì)C、E、F、G、O、J；除以上2條路線外，其他路線有可能產(chǎn)生B、K、L、Q、I等雜質(zhì)，為快速準(zhǔn)確的檢測以上合成工藝中產(chǎn)生的雜質(zhì)。本文參考EP9.0方法并對(duì)該方法優(yōu)化，建立檢測14種雜質(zhì)的有關(guān)物質(zhì)方法并按相關(guān)指導(dǎo)原則進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證［7］，其中雜質(zhì)G各國藥典中均未收錄，本方法可對(duì)雜質(zhì)G進(jìn)行檢測，雜質(zhì)G與其它雜質(zhì)分離度達(dá)到要求，由于在原料產(chǎn)品中未檢出雜質(zhì)G，所以沒有進(jìn)行方法學(xué)考察；根據(jù)原料中檢出的雜質(zhì)C、M并且結(jié)合EP9.0中的已知雜質(zhì)C、D、F、O，本文對(duì)雜質(zhì)C、D、F、M、O 進(jìn)行方法學(xué)考察。14種雜質(zhì)包括雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、K、M、O、L、Q、I、J（結(jié)構(gòu)式見圖3）。

圖1 硫酸沙丁胺醇合成路線1

圖2 硫酸沙丁胺醇合成路線2

圖3 硫酸沙丁胺醇合成過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、K、M、O、L、Q、I、J結(jié)構(gòu)圖

1 儀器與材料

LC-20A日本島津高效液相色譜儀；Mettler toledo天平；pH計(jì)美國Eutech Instrument公司。

硫酸沙丁胺醇原料藥，常州亞邦制藥有限公司；硫酸沙丁胺醇對(duì)照品100 毫克/瓶，批號(hào)100328-200703（純度99.3%），國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中國食品藥品檢定研究院；雜質(zhì)Salbutamol Impurity A 批號(hào)1592-081A2、C 批號(hào)1598-060A3、E 批號(hào)2480-016A3、K 批 號(hào)1711-012A1、M 批 號(hào)1989-055A2、O 批號(hào)1797-074A4、Q 批號(hào)1816-031A2（以上雜質(zhì)采購于加拿大TLC 公司）、B 批號(hào)Y0000030、D 批號(hào)Y0000071、F 批號(hào)Y0000031、G批號(hào)Y0000034、I 批號(hào)Y0000032、J 批號(hào)Y0001186（以上雜質(zhì)采購于歐洲EDQM）、L 批號(hào)9E-11-3（美國CATO 公司）。庚烷磺酸鈉，磷酸二氫鉀，磷酸，磷酸二氫鈉，三乙胺，鹽酸，氫氧化鈉，30%過氧化氫溶液（國藥），甲醇，乙腈（Fisher）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜條件如下：色譜柱：Hypersil Gold C8柱（250 mm×4.6 mm，3 μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A：3.45 g一水合磷酸二氫鈉用900 mL 0.05%的三乙酸胺溶液溶解，以稀磷酸調(diào)節(jié)pH 至3.0 之后用0.05%的三乙酸胺溶液定容至1 000 mL。流動(dòng)相B∶甲醇∶乙腈＝20∶80。按表1 進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長：273 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃。

表1 梯度洗脫程序表

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)取雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、K、M、O、L、Q、I、J及硫酸沙丁胺醇對(duì)照品各適量，精密稱定。以流動(dòng)相A 溶解，該混合溶液作為對(duì)照品溶液；進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。各雜質(zhì)之間分離度均符合要求，其中雜質(zhì)間最小分離度為1.6。扣除空白的HPLC圖譜見圖4。

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液的制備 取硫酸沙丁胺醇原料藥約20 mg，精密稱定，置50 mL 量瓶中，用2.1 項(xiàng)中流動(dòng)相A 溶解，定容后搖勻，配制成每1 mL 中約含硫酸沙丁胺醇0.4 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.3.2 雜質(zhì)對(duì)照品溶液的制備 分別取雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)F、雜質(zhì)M、雜質(zhì)O對(duì)照品各適量，精密稱定，置于量瓶中，用稀釋液溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含雜質(zhì)對(duì)照品45 μg的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.4 專屬性試驗(yàn)［8］精密稱取硫酸沙丁胺醇原料藥20 mg 4 份，分置于50 mL 量瓶中，分別經(jīng)過酸、堿、氧化、光照破壞后，加入流動(dòng)相A稀釋至刻度，作為破壞樣品溶液。（1）酸破壞：樣品中加入3 mol/L HCL 溶液6 mL，85 ℃水浴加熱2 h 后，加入3 mol/L NaOH 溶液6 mL 中和；（2）堿破壞：樣品中加入3 mol/L NAOH 溶液3 mL，85 ℃水浴中加熱2 h 后，加入3 mol/L HCL 溶液3 mL 中和；（3）氧化破壞：樣品中加入300 g/L 過氧化氫溶液1 mL，85 ℃水浴中加熱2 h；（4）光照破壞：樣品加入稀釋液溶解并定容，搖勻，置（4 500±500）lx 光照培養(yǎng)箱中照射5 d；（5）高溫破壞：取硫酸沙丁胺醇原料藥20 mg，于130 ℃烘箱中加熱1.5 h，冷卻，用稀釋液溶解并稀釋至50 mL；取上述各破壞供試品溶液，過濾后測定。扣除空白的HPLC圖譜見圖5。圖5可知，本品經(jīng)酸、堿、氧化、高溫、光照破壞后，各降解產(chǎn)物峰與硫酸沙丁胺醇峰均完全分離。2.5 線性考察與定量限和檢測限［9-10］的確定 精密稱取105 ℃干燥3.5 h 后的硫酸沙丁胺醇對(duì)照品約45 mg，置100 mL 量瓶中，用稀釋液溶解并定容，取1 mL定容至10 mL量瓶中，搖勻，作為硫酸沙丁胺醇對(duì)照儲(chǔ)備液；另精密稱取雜質(zhì)C、D、F、M、O 對(duì)照品適量，按“2.3.2”項(xiàng)方法制備各雜質(zhì)的對(duì)照儲(chǔ)備液。

圖4 《歐州藥典》方法高效液相色譜圖

圖5 專屬性試驗(yàn)色譜圖：A為酸破壞；B為堿破壞；C為氧化破壞；D為高溫破壞；E為光照破壞；F為無破壞

精密量取硫酸沙丁胺醇及雜質(zhì)C、D、F、M、O對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 mL，分別置于10 mL 量瓶中，以流動(dòng)相A 稀釋后定容，搖勻，檢測后記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（ρ，μg/L）為橫坐標(biāo)，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取硫酸沙丁胺醇及各雜質(zhì)對(duì)照儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋后檢測，以信噪比（10∶1）時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限、信噪比（3∶1）時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測限，結(jié)果見表2，線性關(guān)系良好，定量限及檢測限能夠滿足各特定雜質(zhì)檢測的要求。

2.6 精密度試驗(yàn)精密量取“2.5”項(xiàng)的硫酸沙丁胺醇對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.5 和1.0 mL，分置于10 mL 量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，制成低（0.45 μg/mL）、中（2.25 μg/mL）、高（4.5 μg/mL）3 個(gè)質(zhì)量濃度的供試品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度各配制3 份。分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果分別為3.6%、2.9%和2.2%，表明本法重復(fù)性良好。

精密量取“2.5”項(xiàng)的雜質(zhì)C、D、F、M、O對(duì)照品儲(chǔ)備液方法同上，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為：0.7%～2.6%（雜質(zhì)C）；0.8%～3.1%（雜質(zhì)D）；0.7%～3.5%（雜質(zhì)F）；0.8%～1.9%（雜質(zhì)M）；0.9%～3.5%（雜質(zhì)O），表明本法對(duì)雜質(zhì)C、D、F、M、O檢測的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取硫酸沙丁胺醇原料藥20.01 mg，按“2.3.1”項(xiàng)方法制備供試溶液，分別放置0、1、2、4、6、8、10和12 h進(jìn)樣，按外標(biāo)法計(jì)算。平均總雜質(zhì)為0.65%，RSD為1.6%（n＝8），在12 h內(nèi)各有關(guān)物質(zhì)含量無明顯變化。結(jié)果表明：供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn)［11-13］取硫酸沙丁胺醇原料藥約45 mg，置于100 mL量瓶中，取1 mL置于10 mL量瓶中，作為樣品，共9份，精密加入雜質(zhì)C、D、F、M、O的對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.5 和1.0 mL 各3 份，定容后搖勻，配制成低（0.45 μg/mL）、中（2.25 μg/mL）、高（4.5μg/mL）3 個(gè)濃度的供試品溶液。另精密量取雜質(zhì)C、D、F、M、O 對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.5 mL，置于同一個(gè)10 mL量瓶中，定容后搖勻，作為對(duì)照溶液。另取硫酸沙丁胺醇原料藥45 mg，置1 000 mL量瓶中，定容后搖勻，作為本底校正溶液。分別進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算雜質(zhì)C、D、F、M、O 含量，扣除本底量后計(jì)算回收率。雜質(zhì)C、D、F、M、O回收率分別為99.1%，99.3%、100.1%、100.5%、100.2%，RSD%分別為2.6%、2.1%、2.5%、1.7%、1.9%（n＝9）。

表2 線性關(guān)系及定量限與檢測限結(jié)果

2.9 樣品測定［14］取硫酸沙丁胺醇原料藥與各有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液、對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液并進(jìn)行稀釋，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。供試溶液的色譜圖中如出現(xiàn)與對(duì)照溶液中相應(yīng)已知雜質(zhì)保留時(shí)間一致的色譜峰，按外標(biāo)法計(jì)算各有關(guān)物質(zhì)含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品中硫酸沙丁胺醇有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果/%

3 討論

3.1 檢測波長的選擇采用二極管陣列檢測器對(duì)硫酸沙丁胺醇及各雜質(zhì)進(jìn)行全波長掃描，在本文色譜條件下，由混合對(duì)照品溶液PDA圖譜結(jié)果可知，雜質(zhì)I在262 nm附近有較強(qiáng)吸收，范圍較寬，雜質(zhì)D在255 nm處有較強(qiáng)吸收，范圍較寬，硫酸沙丁胺醇及其他雜質(zhì)在273 nm左右處有特征吸收峰；綜合考慮，確定273 nm作為硫酸沙丁胺醇有關(guān)物質(zhì)的檢測波長。

3.2 色譜條件的優(yōu)化根據(jù)圖2可知，其中雜質(zhì)L、M、C 之間分離度較小，根據(jù)圖1 中雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式可知，以上三種雜質(zhì)結(jié)構(gòu)較為相似，其中雜質(zhì)L極性最大，雜質(zhì)C 極性最小，在梯度選擇時(shí)，5～12 min 梯度變化10%，為了保證雜質(zhì)J 與主成分峰分離，在12～45 min 梯度變化75%，通過較大的極性變化使較難分離的雜質(zhì)L、M、C達(dá)到分離要求，其中L、M、C的出峰順序符合從極性從大到小的梯度變化。

3.3 雜質(zhì)分析本實(shí)驗(yàn)所使用的原料藥外購原料藥，由于不了解其具體的合成工藝，無法推斷圖3的F中保留時(shí)間為14.847 min的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)。雜質(zhì)G為中間體反應(yīng)過程中還原不完全的副產(chǎn)物，在進(jìn)行下一步反應(yīng)時(shí)可產(chǎn)生新的雜質(zhì)，有必要對(duì)雜質(zhì)G進(jìn)行控制，本方法可檢測該雜質(zhì)，提高反應(yīng)過程中的質(zhì)量控制。

3.4 檢測方法分析藥品不良反應(yīng)往往與其中雜質(zhì)相關(guān)，雜質(zhì)研究及控制是藥品安全保證的關(guān)鍵要素，在藥品研發(fā)中具有重要地位。隨著藥品研究的深入和發(fā)展，雜質(zhì)研究理念已經(jīng)由雜質(zhì)控制飛躍至雜質(zhì)譜控制，雜質(zhì)譜分析引入到工藝路線的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，本方法針對(duì)硫酸沙丁胺醇工藝路線中可能產(chǎn)生的大部分雜質(zhì)進(jìn)行檢測，達(dá)到多個(gè)雜質(zhì)同時(shí)檢測的目的，提高效率；與原有檢測方法比較，該方法可同時(shí)檢測雜質(zhì)數(shù)量更多，適用于多種合成方法的雜質(zhì)研究，更加符合雜質(zhì)譜分析的理念，對(duì)雜質(zhì)深入研究，建立針對(duì)性的分析方法，提高藥品質(zhì)量。

3.5 小結(jié)強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果表明，硫酸沙丁胺醇原料藥在高溫、光照條件下較穩(wěn)定，在強(qiáng)酸堿及氧化條件下發(fā)生降解。由使用本方法檢測的結(jié)果可知，破壞產(chǎn)生的各雜質(zhì)于硫酸沙丁胺醇均能達(dá)到較好分離，方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，利于硫酸沙丁胺醇有關(guān)物質(zhì)檢測。更好控制原料藥的質(zhì)量，也為制劑的質(zhì)量控制提供參考。