• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一種簡便的拓寬噬菌體宿主譜方法的建立 及其結果分析

    2020-02-09 06:47:16薛金鑫包紅朵
    中國動物傳染病學報 2020年1期
    關鍵詞:菌斑噬菌體菌液

    周 艷,薛金鑫,葉 敏,張 輝,包紅朵,王 冉

    (1.江蘇省農業(yè)科學院農產品質量安全與營養(yǎng)研究所 江蘇省食品質量安全重點實驗室 省部共建國家重點實驗室培育基地,南京210014;2.南京大學金陵學院化學與生命科學學院,南京210014)

    在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中,多年來抗生素的濫用不僅導致環(huán)境與動物機體中抗生素的大量殘留,而且多重耐藥菌和超級細菌的出現也給人類健康和畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了危害[1-5]。針對耐藥性致病菌,尤其是革蘭氏陰性菌,目前尚缺乏新型抗菌藥物,而裂解性噬菌體(Bacteriophage,phage)作為一類可侵染并裂解耐藥菌的細菌病毒,已成為各國研發(fā)新型抗菌制劑的熱點之一。因此,噬菌體療法(Phage Therapy)有望成為改善和解決耐藥性致病菌感染的有效策略[6-9]。

    產腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichia coli,ETEC)是一類致人和幼畜胃腸道感染以及腹瀉的病原性致病菌;腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicE. coli,EHEC)O157∶H7是世界公認的食源性病原菌和人獸共患病病原[10-14]。針對這兩種致病菌,相繼有研究表明從環(huán)境中分離到了裂解性ETEC噬菌體和EHEC O157∶H7噬菌體,并且目前已有商品化的EHEC O157∶H7裂解性噬菌體產品[12]。然而,自然界分離的噬菌體對宿主菌具有高度專一性[15],噬菌體宿主譜較窄,然而在畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中,動物疾病往往由多種致病菌導致,病原菌較為復雜,宿主單一的噬菌體很難對疾病進行有效控制[16-18],作為抗菌制劑在應用時會受到制約。如何在已有噬菌體的基礎上,簡便快速地拓寬噬菌體宿主譜,目前相關的研究報道較少。

    為解決噬菌體宿主譜窄的問題,本研究[19]將前期分離到的一株ETEC噬菌體vB_EcoM_JS09(簡稱JS09)與一株非宿主菌EHEC O157∶H7 47共培養(yǎng),通過優(yōu)化培養(yǎng)體系和條件,經過多輪共培養(yǎng)篩選到了能同時裂解ETEC和EHEC O157∶H7菌株的噬菌體,拓寬了親本噬菌體JS09的宿主譜,建立了一種拓寬噬菌體宿主譜的方法,并進一步研究了裂解性較好的寬宿主譜噬菌體Bp47-12的生物學特性和裂解特性。

    1 材料與方法

    1.1 菌株、噬菌體與試劑噬菌體vB_EcoM_JS09(簡稱JS09,GenBank登錄號:KF582788)由本實驗室分離并保存;ETEC EK99-F41菌株由本實驗室保存;EHEC O157∶H7 47菌株來源于牛,EHEC O157∶H7 86-24菌株來源于人,EHEC O157∶H7 363菌株來源未知,以上菌株均由江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)所贈與;EHEC O157∶H7 012和027菌株來源于豬,由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)所王少輝贈與;LB培養(yǎng)基購自海博(青島)生物技術有限公司。

    1.2 噬菌體的培養(yǎng)挑取ETEC EK99-F41的單個菌落接種于4 mL液體LB中,于37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜,得到宿主菌濃度約為1×109CFU/mL。取EK99-F41菌液(1×109CFU/mL)150 μL加入噬菌體JS09純培養(yǎng)液(1×1010PFU/mL)200 μL中,室溫靜置吸附15 min,加入10 mL液體LB培養(yǎng)基,37℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)6 h,于4℃條件下11 269 ×g離心10 min,收集上清,0.22 μm濾膜過濾,并保存于4℃。

    1.3 噬菌體宿主譜的拓寬方法按照MOI為100的比例,取1 mL噬菌體JS09(1×1010PFU/mL)與 100 μL EHEC O157∶H7 47(1×109CFU/mL)充分混合,室溫靜置吸附15 min后,進行雙層瓊脂平板試驗,加入3.5 mL 55℃左右的0.6%瓊脂LB培養(yǎng)基,迅速混勻倒入1.2%瓊脂LB平板上,凝固后37℃培養(yǎng)12 h,共3個雙層瓊脂平板。

    1.4 寬宿主譜噬菌體的分離與純化標記雙層瓊脂平板上的典型噬菌斑,分別編號,用槍頭分別移取噬菌斑于500 μL LB培養(yǎng)液中,37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)8 h。選取液體澄清的編號樣品,進行下一步擴大培養(yǎng)。

    取上述樣品,全部與100 μL EHEC O157∶H7 47(1×109CFU/mL)混合,室溫靜置吸附15 min后,接入5 mL LB培養(yǎng)液中。37℃靜置培養(yǎng)6 h,選取液體澄清的樣品,7826×g離心10 min,取上清液,0.22 μm濾膜過濾,保存于4℃。分別測定單一噬菌斑,重復該純化操作3~5次即得純化噬菌體。

    1.5 噬菌體宿主譜的點樣試驗通過點樣試驗分析純化的噬菌體宿主譜[19],當噬菌體能夠裂解細菌時會出現抑菌圈,統計噬菌體對各細菌的裂解情況得到該噬菌體的宿主譜(表1)。

    1.6 寬宿主譜噬菌體噬菌斑形態(tài)分析參照1.3中的雙層瓊脂平板試驗方法,將篩選到的裂解效果較好的寬宿主譜噬菌體Bp47-12,以EHEC O157∶H7 363為宿主菌進行雙層瓊脂平板試驗。

    1.7 寬宿主譜噬菌體最佳感染復數(multiplicity of infection,MOI)的測定 取對數期宿主菌EHEC O157∶H7 363,按不同感染復數1∶1000、1∶100、1∶10、1∶1、10∶1、100∶1加入噬菌體Bp47-12和宿主菌EHEC O157∶H7 363,37℃、 150 r/min振蕩培養(yǎng)5 h,4℃、10 000×g離心10 min,得上清液測定各組噬菌體效價。試驗重復3次,設置不加噬菌體的宿主菌培養(yǎng)液為試驗對照。

    1.8 寬宿主譜噬菌體一步生長曲線繪制參考Leuschner等[20]的方法,取對數期宿主菌EHEC O157∶H7 363,以MOI≥10加入噬菌體Bp47-12,37℃水浴15 min,10 000×g離心1 min,去上清,LB液洗滌2次,細菌沉淀加入37℃預熱的LB液中混勻,迅速于37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng),同時開始計時。每10 min取樣測噬菌體效價,設立不加噬菌體的宿主菌培養(yǎng)液和不加宿主菌的噬菌體作為試驗對照。以感染時間為橫坐標,噬菌體效價對數值為縱坐標,繪制一步生長曲線,試驗重復3次,每次設2個平行。

    1.9 寬宿主譜噬菌體吸附曲線分析培養(yǎng)過夜細菌EHEC O157∶H7 363(接種一個單菌落到5 mL LB中,37℃振蕩過夜培養(yǎng)),取0.5 mL該菌液加入到10 mL LB中,此時細菌濃度約為2×108CFU/mL,再置于37℃振蕩培養(yǎng)60 min。用LB稀釋噬菌體Bp47-12,制備10 mL效價為2×105PFU/mL的噬菌體Bp47-12(稀釋好后測定噬菌體效價);將步驟培養(yǎng)的細菌與制備好的噬菌體充分混合,搖勻后立即取1 mL樣品,于4℃、15 000×g離心1 min,取上清測定噬菌體效價;按照以上取樣方法,每隔5 min取樣測定噬菌體效價至30 min,重復3次取平均值,繪制吸附曲線。

    1.10 寬宿主譜噬菌體酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性測定配 制pH值分別為2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13的蛋白胨水,取不同pH值的蛋白胨水與噬菌體Bp47-12等量混合,37℃水浴2 h后測定效價;取100 μL噬菌體于離心管中,測定初始效價,將離心管分別置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的水浴環(huán)境中作用30 min和60 min,測定噬菌體效價變化。兩個試驗均重復3次,每次設2個平行,取平均值。

    1.11 寬宿主譜噬菌體體外裂解特性分析分別取過夜培養(yǎng)的EHEC O157∶H7 363,EHEC O157∶H7 47和ETEC EK99-F41菌液,用LB將其OD600值調整為0.86(約為2.5×106CFU/mL)左右,以MOI為10的比例加入噬菌體Bp47-12并至終濃度為1×107PFU/mL,于37℃靜置培養(yǎng),同時以不加噬菌體作為對照組。在培養(yǎng)的0~5 h,每1 h檢測一次OD600值的變化。

    2 結果

    2.1 寬宿主譜噬菌體的分離純化及其宿主譜分析噬菌體JS09與EHEC O157∶H7 47共培養(yǎng)后,以EHEC O157∶H7 47為宿主菌,在3個雙層瓊脂平板上共生長了12個較小的噬菌斑。對12個噬菌斑分別進行3次重復分離純化后,最終篩選到能夠使EHEC O157∶H7 47菌液由渾濁變澄清的寬宿主譜噬菌體,分別命名為Bp47-1、Bp47-2、Bp47-3、Bp47-8、Bp47-9和Bp47-12。

    通過點樣試驗觀察LB培養(yǎng)平板上是否出現抑菌圈,結果可知,對照組噬菌體JS09僅能夠裂解ETEC EK99-F41,而噬菌體Bp47-1、Bp47-2、Bp47-3、Bp47-8、Bp47-9和Bp47-12不僅能裂解ETEC EK99-F41,而且能裂解EHEC O157∶H7 47、363、86~24(圖1),以及從臨床分離的豬源EHEC O157:H7菌株012和027(重復3代噬菌體以上)(表1)。

    圖1 噬菌體JS09、Bp47-1、Bp47-2、Bp47-3、Bp47-8、Bp47-9 和Bp47-12 原液單層平板點樣試驗Fig.1 Spot tests of phages JS09, Bp47-1, Bp47-2, Bp47-3, Bp47-8, Bp47-9 and Bp47-12 in the liquid samples

    表1 噬菌體的宿主譜Table 1 Host range of phages

    2.2 寬宿主譜噬菌體的噬菌斑形態(tài)選取裂解效果較好的寬宿主譜噬菌體Bp47-12,以EHEC O157∶H7 363為宿主菌,雙層瓊脂平板試驗表明,噬菌體Bp47-12在平板上均呈現出了典型裂解性噬菌體特征,空斑透亮,邊緣整齊清晰,無暈環(huán)噬菌斑(圖2)。

    2.3 寬宿主譜噬菌體的最佳感染復數噬菌體Bp47-12在MOI為1∶1時,宿主菌EHEC O157∶H7 363釋放的子代噬菌體效價為5.5×108PFU/mL,在各試驗組中最高,為噬菌體擴增時的最佳MOI值(表2)。

    2.4 寬宿主譜噬菌體的一步生長曲線噬菌體Bp47-12感染宿主菌EHEC O157∶H7 363的潛伏期約 30 min,爆發(fā)持續(xù)時間約70 min,根據爆發(fā)末期的噬菌體效價和感染初期的宿主菌濃度算得平均爆發(fā)量為15(平均爆發(fā)量=爆發(fā)末期的噬菌體效價/感染初期的宿主菌濃度)(圖3)。

    2.5 寬宿主譜噬菌體的吸附曲線吸附曲線表明,在37℃時噬菌體Bp47-12在25 min內能夠完全吸附到宿主菌EHEC O157∶H7 363表面(圖4)。

    2.6 寬宿主譜噬菌體的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性測定噬菌體Bp47-12在各溫度下作用30、60 min后效價變化無太大差別,30℃、40℃、50℃、60℃下幾乎維持在初始時的效價,但70℃時下降較快,80℃之后已基本無噬菌體存在(圖5A)。

    噬菌體Bp47-12在pH3~9范圍內效價較穩(wěn)定,pH值小于3以及大于9噬菌體效價都會明顯降低,pH≤2或≥10時基本檢測不到噬菌斑,表明此時大部分噬菌體已經失活(圖5B)。

    2.7 寬宿主譜噬菌體的體外裂解特性加入噬菌體Bp47-12至菌液作用1 h后,Bp47-12組OD600值由0.86降至0.66左右;2 h后,該組OD600值仍在下降,肉眼可觀察到菌液明顯較對照組澄清;作用5 h后,Bp47-12組的OD600值降至0.20左右,下降了約0.66個OD600值,此時菌液變得較為透亮且澄清,而對照組OD600值仍在上升,達到1.4以上,上升了約0.55個OD600值,且菌液較為混濁(圖6A、6B)。

    當宿主菌為ETEC EK99-F41時,加入噬菌體Bp47-12至菌液作用2 h后,Bp47-12組OD600值開始下降,在5 h時OD600值降至0.20左右(圖6C),因此,當MOI為10時,噬菌體Bp47-12能夠有效裂解EHEC O157∶H7 363,EHEC O157:H7 47和ETEC EK99-F41。

    圖2 寬宿主譜噬菌體Bp47-12 雙層瓊脂平板試驗 Fig.2 Bp47-12 with expanded host range in double layer agar plate

    表2 噬菌體Bp47-12 的最佳感染復數測定Table 2 Determination of optimal MOI of Bp47-12

    圖3 噬菌體Bp47-12 一步生長曲線 Fig.3 One-step growth curve of Bp47-12

    圖4 噬菌體Bp47-12 吸附曲線Fig.4 Adsorption curve of Bp47-12

    3 討論

    噬菌體是地球上最豐富和具有多樣性的生物體,大約有1032個有尾噬菌體[21-22]。隨著抗生素在畜牧養(yǎng)殖業(yè)和醫(yī)學上的使用,抗生素耐藥性已經成為一個危害全世界公共健康的問題,大腸桿菌中耐多粘菌素MCR-1(plasmid-mediated colistin resistance)耐藥基因的發(fā)現,標志著細菌對抗生素的耐藥性已突破最后一道防線[23]。近年來,將噬菌體應用于畜牧獸醫(yī)和醫(yī)學領域,已受到全球科研機構和企業(yè)的重視。裂解性噬菌體雖能夠特異性侵染并裂解細菌,但從自然界中分離的裂解性噬菌體宿主譜較窄[24],盡管有研究者通過分離寬宿主譜噬菌體、改造噬菌體基因組以及混合多種噬菌體等方法來改變或擴大噬菌體的宿主譜和裂解特性,但這些方法比較費時費力[18,24]。

    圖5 噬菌體Bp47-12 對溫度(A)及酸堿度(B)的耐受能力Fig.5 Resistance of Bp47-12 to temperature (A), acid and alkali (B)

    圖6 噬菌體Bp47-12 的體外裂解特性分析 Fig.6 In vitro lytic assay of Bp47-12

    由于非宿主菌對噬菌體不敏感,本研究在前期分離的親本ETEC噬菌體JS09基礎上,建立了一種簡便的擴大噬菌體宿主譜的方法。試驗發(fā)現,通過提高MOI的比例將效價較高的噬菌體與非宿主菌共培養(yǎng)能夠有利于篩選到寬宿主譜噬菌體。噬菌體的生存離不開細菌,噬菌體在細菌的進化過程中發(fā)揮著重要的作用[24],噬菌體的宿主特異性不是一成不變的,噬菌體與細菌在生長循環(huán)過程中相互作用共進化,這種互相作用受到環(huán)境條件和整體模式的影響,使得噬菌體或細菌能夠發(fā)生適應性變異[25]。因此推測,在特定的生長條件和選擇壓力下,可促使親本噬菌體的宿主特異性發(fā)生變化。

    噬菌體的宿主譜由噬菌體在感染過程中受體結合蛋白與宿主菌的受體蛋白相互作用決定[2]。有尾噬菌體T4通過尾絲蛋白識別宿主受體,包括長尾絲蛋白和短尾絲蛋白[26]。研究表明,通過改變長尾絲蛋白基因的His box序列能夠拓寬T4噬菌體的宿主 譜[27]。與親本噬菌體JS09相比,噬菌體Bp47-12的短尾絲蛋白基因序列發(fā)生改變(數據尚未發(fā)表)可能導致宿主譜的拓寬,對此機制的研究仍在進行中。通過改變宿主受體結合蛋白基因能夠改變噬菌體宿主譜,Yoichi等[28]利用同源重組技術將T2噬菌體宿主受體識別基因gp37和gp38替換為EHEC O157∶H7特異性噬菌體pp01的gp37和gp38,構建了一株重組噬菌體T2ppD1,該重組噬菌體能夠侵染大腸桿菌O157∶H7及其近緣屬種,但是不能侵染原宿主菌大腸桿菌K12或其衍生菌。

    借助于噬菌體與宿主菌共進化,將噬菌體與非特異性細菌共同培養(yǎng),以期拓寬噬菌體的宿主譜,此技術無需繁瑣耗時的基因操作。Mapes等[24]通過將噬菌體與多株耐藥性不同的銅綠假單胞菌經過幾輪共培養(yǎng),拓寬了銅綠假單胞菌特異性噬菌體的宿主譜,并能夠有效抑制銅綠假單胞菌形成的生物膜。EHEC O157∶H7導致的食品污染和腹瀉嚴重威脅著人類健康[5]。研究表明,EHEC O157∶H7噬菌體主要應用于食品和食品加工器械表面的消毒,以及動物體內的殺菌試驗[29]。在37℃條件下,pp01、e11/2和e4/1c三種噬菌體混合制劑能夠有效地去除肉類中的EHEC O157∶H7[30]。因此,本研究中篩選的能夠裂解EHEC O157∶H7的寬宿主譜噬菌體具有潛在的應用價值。

    本研究建立的拓寬噬菌體宿主譜的方法和分離到的寬宿主譜噬菌體Bp47-12能夠同時裂解ETEC和EHEC O157∶H7菌株,因此具有潛在的應用價值和一定的研究意義,同時也為拓寬裂解性噬菌體宿主譜和應用噬菌體提供科學依據和可行性。

    猜你喜歡
    菌斑噬菌體菌液
    大學生牙齦炎齦上菌斑的微生物群落
    不同富集培養(yǎng)方法對噬菌體PEf771的滴度影響
    多糖微生物菌液對油菜吸收養(yǎng)分和土壤氮磷淋失的影響
    高效裂解多重耐藥金黃色葡萄球菌的噬菌體分離及裂解酶的制備
    Bonfire Night
    鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗中通過吸光度值測定菌液濃度的方法研究
    一種新型含穩(wěn)定亞錫-氟化鈉牙膏的菌斑滲透率和脂多糖中和效率的臨床評價
    缺血性腦卒中患者齦下菌斑中牙周致病菌檢測
    復合微生物菌液對黃瓜生長和抗病蟲性效應研究
    上海蔬菜(2015年2期)2015-12-26 05:03:40
    副溶血弧菌噬菌體微膠囊的制備及在餌料中的應用
    18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 如何舔出高潮| 天堂影院成人在线观看| 在线观看66精品国产| 久久国产乱子免费精品| 亚洲av一区综合| 人妻少妇偷人精品九色| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产老妇女一区| 黄片wwwwww| 国产精品日韩av在线免费观看| 日本一二三区视频观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲av五月六月丁香网| 成人国产麻豆网| 嫩草影院新地址| x7x7x7水蜜桃| av在线亚洲专区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 精品欧美国产一区二区三| 一进一出抽搐动态| 日本在线视频免费播放| 国产色婷婷99| 欧美+日韩+精品| 亚洲成人久久性| 国产一区二区三区av在线 | 搡老妇女老女人老熟妇| 夜夜爽天天搞| 国产精品久久视频播放| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 一本久久中文字幕| 久久午夜福利片| 国产欧美日韩一区二区精品| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 乱系列少妇在线播放| 91麻豆av在线| 免费观看精品视频网站| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日本熟妇午夜| 国产视频一区二区在线看| 22中文网久久字幕| 精品人妻视频免费看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 免费高清视频大片| 麻豆国产97在线/欧美| 俄罗斯特黄特色一大片| 性欧美人与动物交配| 国产午夜精品论理片| 国产爱豆传媒在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 国产精品久久久久久久久免| 天天一区二区日本电影三级| 无遮挡黄片免费观看| 黄色视频,在线免费观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲电影在线观看av| 在线免费观看的www视频| 日本一二三区视频观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲真实伦在线观看| or卡值多少钱| 99热这里只有精品一区| 熟女电影av网| 亚洲av美国av| 日本欧美国产在线视频| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产伦精品一区二区三区视频9| 九色成人免费人妻av| 天堂√8在线中文| 欧美zozozo另类| 欧美3d第一页| 欧美色欧美亚洲另类二区| 日本一本二区三区精品| 中文亚洲av片在线观看爽| 色综合色国产| 精品一区二区三区人妻视频| 国产三级在线视频| 精品久久久久久久久av| 99在线人妻在线中文字幕| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲精品456在线播放app | 少妇丰满av| 亚洲精品国产成人久久av| 日本欧美国产在线视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲在线观看片| 免费av观看视频| 在线天堂最新版资源| 成人国产麻豆网| 搡老妇女老女人老熟妇| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲av电影不卡..在线观看| 午夜视频国产福利| 免费无遮挡裸体视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 精品久久国产蜜桃| 国产黄色小视频在线观看| 观看美女的网站| 可以在线观看的亚洲视频| 免费观看的影片在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 国产探花极品一区二区| av中文乱码字幕在线| 免费看美女性在线毛片视频| 精品人妻熟女av久视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 91久久精品电影网| 久久中文看片网| 国产黄a三级三级三级人| 制服丝袜大香蕉在线| 久久国内精品自在自线图片| 岛国在线免费视频观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 麻豆成人午夜福利视频| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 亚洲av成人av| 麻豆av噜噜一区二区三区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 91av网一区二区| 搡老妇女老女人老熟妇| 观看免费一级毛片| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产免费一级a男人的天堂| 国产极品精品免费视频能看的| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国内精品一区二区在线观看| 精品人妻1区二区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 丰满人妻一区二区三区视频av| 午夜福利欧美成人| 国产一区二区在线av高清观看| 听说在线观看完整版免费高清| 国产欧美日韩一区二区精品| 一个人看视频在线观看www免费| 久久精品国产自在天天线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 色综合婷婷激情| av在线观看视频网站免费| 岛国在线免费视频观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲专区中文字幕在线| 天天躁日日操中文字幕| 内地一区二区视频在线| 欧美+日韩+精品| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 91久久精品电影网| 欧美bdsm另类| 免费大片18禁| 一本一本综合久久| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产淫片久久久久久久久| 免费一级毛片在线播放高清视频| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 联通29元200g的流量卡| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 一区二区三区免费毛片| 中文资源天堂在线| 国产精品人妻久久久影院| 久久久久性生活片| 亚洲成人免费电影在线观看| 色综合站精品国产| 国产久久久一区二区三区| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 久久国产精品人妻蜜桃| 2021天堂中文幕一二区在线观| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产成人a区在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久精品综合一区二区三区| 中文在线观看免费www的网站| 国产爱豆传媒在线观看| 午夜福利在线观看吧| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 99精品久久久久人妻精品| 老司机深夜福利视频在线观看| www.色视频.com| 午夜爱爱视频在线播放| 欧美日韩综合久久久久久 | 久久久精品大字幕| avwww免费| 国产人妻一区二区三区在| 欧美精品啪啪一区二区三区| 有码 亚洲区| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲中文字幕日韩| 免费看美女性在线毛片视频| 日日夜夜操网爽| www日本黄色视频网| 日本欧美国产在线视频| 网址你懂的国产日韩在线| 99在线人妻在线中文字幕| 91麻豆av在线| 欧美又色又爽又黄视频| 国产精华一区二区三区| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 日本三级黄在线观看| 国产乱人视频| 欧美zozozo另类| av专区在线播放| 午夜a级毛片| 可以在线观看的亚洲视频| 免费无遮挡裸体视频| 久久久久久久午夜电影| 淫妇啪啪啪对白视频| 成人三级黄色视频| 国产美女午夜福利| 全区人妻精品视频| 舔av片在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 色噜噜av男人的天堂激情| av女优亚洲男人天堂| 黄色一级大片看看| 久久精品综合一区二区三区| 久久久精品大字幕| 日日撸夜夜添| 亚洲av电影不卡..在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 91久久精品国产一区二区成人| 精品国内亚洲2022精品成人| 美女黄网站色视频| 亚洲不卡免费看| 成人国产一区最新在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美激情久久久久久爽电影| 日韩人妻高清精品专区| 夜夜爽天天搞| 亚洲欧美日韩东京热| 长腿黑丝高跟| 99久久成人亚洲精品观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 给我免费播放毛片高清在线观看| .国产精品久久| 黄色视频,在线免费观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 久久热精品热| 久9热在线精品视频| 精品福利观看| 最近中文字幕高清免费大全6 | 国产精品,欧美在线| 美女高潮的动态| 国产精品一区二区性色av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 九色国产91popny在线| 91久久精品电影网| 精品久久国产蜜桃| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲精品亚洲一区二区| 成人无遮挡网站| 成人一区二区视频在线观看| 日本五十路高清| 99国产精品一区二区蜜桃av| 九色国产91popny在线| 免费av不卡在线播放| 婷婷精品国产亚洲av在线| 最近最新免费中文字幕在线| 国产欧美日韩精品一区二区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 熟女人妻精品中文字幕| 中文字幕av在线有码专区| 女同久久另类99精品国产91| 欧美bdsm另类| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 91麻豆av在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 97超视频在线观看视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 特级一级黄色大片| 草草在线视频免费看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 欧美最黄视频在线播放免费| 99国产极品粉嫩在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 日本五十路高清| 嫩草影院入口| 看十八女毛片水多多多| 丝袜美腿在线中文| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲av第一区精品v没综合| 看黄色毛片网站| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久人妻av系列| 成人国产麻豆网| 国产精品伦人一区二区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 干丝袜人妻中文字幕| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲最大成人手机在线| 熟女电影av网| 一本久久中文字幕| 一区二区三区激情视频| 日本 欧美在线| 免费看光身美女| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产精品一区二区免费欧美| 久久精品国产清高在天天线| 99久久成人亚洲精品观看| 午夜福利欧美成人| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产真实乱freesex| 中文亚洲av片在线观看爽| 色播亚洲综合网| 伊人久久精品亚洲午夜| 深爱激情五月婷婷| 成人综合一区亚洲| 91av网一区二区| 成人无遮挡网站| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 麻豆成人午夜福利视频| 两个人的视频大全免费| 国产精华一区二区三区| 亚洲第一区二区三区不卡| 天天躁日日操中文字幕| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 在线观看午夜福利视频| 精品不卡国产一区二区三区| 一区二区三区免费毛片| 久久香蕉精品热| 欧美成人一区二区免费高清观看| 在线a可以看的网站| 男女视频在线观看网站免费| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 一个人免费在线观看电影| 在线观看舔阴道视频| a级毛片a级免费在线| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 99精品在免费线老司机午夜| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 联通29元200g的流量卡| 久久久久久国产a免费观看| 99精品在免费线老司机午夜| 国国产精品蜜臀av免费| 色综合婷婷激情| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 成人欧美大片| 露出奶头的视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 中文字幕熟女人妻在线| 久久久久免费精品人妻一区二区| 超碰av人人做人人爽久久| 国产亚洲精品av在线| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品精品国产色婷婷| 91在线观看av| 亚洲av一区综合| 国产亚洲精品av在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 波多野结衣巨乳人妻| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产伦精品一区二区三区四那| 变态另类丝袜制服| 看片在线看免费视频| 亚洲内射少妇av| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 精品久久久久久久久av| 中文字幕久久专区| 九九热线精品视视频播放| 欧美潮喷喷水| 日韩强制内射视频| 欧美+日韩+精品| 一夜夜www| 久久久久久久久久成人| 久久6这里有精品| 白带黄色成豆腐渣| 欧美在线一区亚洲| 国产视频一区二区在线看| 桃红色精品国产亚洲av| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 99精品久久久久人妻精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 熟女人妻精品中文字幕| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产69精品久久久久777片| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲av不卡在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产精品,欧美在线| 精品久久久久久久久久免费视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 男女边吃奶边做爰视频| av在线亚洲专区| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲av二区三区四区| 成人无遮挡网站| 久久精品91蜜桃| 1024手机看黄色片| 一进一出抽搐gif免费好疼| bbb黄色大片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲一区高清亚洲精品| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 春色校园在线视频观看| 一区二区三区高清视频在线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产久久久一区二区三区| 日日撸夜夜添| av专区在线播放| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 天天一区二区日本电影三级| 97热精品久久久久久| av.在线天堂| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲专区中文字幕在线| 一级av片app| 热99在线观看视频| 天堂网av新在线| 国国产精品蜜臀av免费| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 男女视频在线观看网站免费| 不卡一级毛片| 韩国av在线不卡| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久精品国产亚洲av天美| 99热只有精品国产| 午夜视频国产福利| 日本爱情动作片www.在线观看 | 99久久精品热视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 九九热线精品视视频播放| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲五月天丁香| 男女下面进入的视频免费午夜| 色av中文字幕| 久久久久久久久大av| 亚洲人成网站高清观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 最后的刺客免费高清国语| av在线蜜桃| 亚洲人成伊人成综合网2020| 五月伊人婷婷丁香| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 有码 亚洲区| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲精华国产精华精| 亚洲中文字幕日韩| 在线免费观看不下载黄p国产 | 久久久久久久久久久丰满 | 精品人妻一区二区三区麻豆 | 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲专区国产一区二区| 午夜精品久久久久久毛片777| 日本五十路高清| 中文字幕免费在线视频6| 久久99热这里只有精品18| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 久久亚洲真实| 国产高清视频在线播放一区| 老司机午夜福利在线观看视频| 精品一区二区免费观看| 亚洲人成网站高清观看| av在线天堂中文字幕| 一个人看的www免费观看视频| 午夜福利视频1000在线观看| av天堂在线播放| 91麻豆av在线| 亚洲18禁久久av| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 1000部很黄的大片| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产在线男女| 亚洲av一区综合| 女同久久另类99精品国产91| 无人区码免费观看不卡| avwww免费| 免费观看精品视频网站| 日本爱情动作片www.在线观看 | 精品午夜福利在线看| 欧美高清成人免费视频www| 色播亚洲综合网| 两个人的视频大全免费| 如何舔出高潮| 深夜精品福利| 特级一级黄色大片| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲真实伦在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产精品日韩av在线免费观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 精品人妻熟女av久视频| 欧美bdsm另类| 可以在线观看毛片的网站| 国产伦人伦偷精品视频| 国产极品精品免费视频能看的| 成年免费大片在线观看| 高清日韩中文字幕在线| 欧美日本视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 日日啪夜夜撸| 国产av一区在线观看免费| 综合色av麻豆| av天堂中文字幕网| 国内精品久久久久久久电影| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 欧美日韩瑟瑟在线播放| a在线观看视频网站| 97碰自拍视频| 国产av一区在线观看免费| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲经典国产精华液单| 美女 人体艺术 gogo| 3wmmmm亚洲av在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美极品一区二区三区四区| 长腿黑丝高跟| 99久久九九国产精品国产免费| 午夜爱爱视频在线播放| 国产高清激情床上av| 国产在线男女| 97热精品久久久久久| 精品人妻1区二区| 亚洲美女搞黄在线观看 | 久久久久久大精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 麻豆成人午夜福利视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 热99re8久久精品国产| 婷婷精品国产亚洲av在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 日本黄色片子视频| 一a级毛片在线观看| 午夜久久久久精精品| АⅤ资源中文在线天堂| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲av免费在线观看| 看黄色毛片网站| av视频在线观看入口| 99视频精品全部免费 在线| 美女cb高潮喷水在线观看| 日韩欧美 国产精品| 韩国av在线不卡| 美女大奶头视频| 一本精品99久久精品77| 国产伦人伦偷精品视频| 91久久精品电影网| 高清在线国产一区| 我要搜黄色片| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲图色成人| 超碰av人人做人人爽久久| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久久久久久午夜电影| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美中文日本在线观看视频| 长腿黑丝高跟| 免费av不卡在线播放| 日本黄色片子视频| 久久精品影院6| 成人国产综合亚洲| 免费在线观看成人毛片| 日本精品一区二区三区蜜桃| 伦理电影大哥的女人| 久久精品国产亚洲网站| 精品乱码久久久久久99久播| 天天一区二区日本电影三级| bbb黄色大片| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 精品人妻熟女av久视频| 国产精品一及| 国内精品一区二区在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 香蕉av资源在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 色吧在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 99视频精品全部免费 在线| 欧美中文日本在线观看视频| 男女边吃奶边做爰视频| 在线天堂最新版资源| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 欧美成人a在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 欧美潮喷喷水| 高清毛片免费观看视频网站| eeuss影院久久| 国产精品不卡视频一区二区|