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    一種簡便的拓寬噬菌體宿主譜方法的建立 及其結果分析

    2020-02-09 06:47:16薛金鑫包紅朵
    中國動物傳染病學報 2020年1期
    關鍵詞:菌斑噬菌體菌液

    周 艷,薛金鑫,葉 敏,張 輝,包紅朵,王 冉

    (1.江蘇省農業(yè)科學院農產品質量安全與營養(yǎng)研究所 江蘇省食品質量安全重點實驗室 省部共建國家重點實驗室培育基地,南京210014;2.南京大學金陵學院化學與生命科學學院,南京210014)

    在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中,多年來抗生素的濫用不僅導致環(huán)境與動物機體中抗生素的大量殘留,而且多重耐藥菌和超級細菌的出現也給人類健康和畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了危害[1-5]。針對耐藥性致病菌,尤其是革蘭氏陰性菌,目前尚缺乏新型抗菌藥物,而裂解性噬菌體(Bacteriophage,phage)作為一類可侵染并裂解耐藥菌的細菌病毒,已成為各國研發(fā)新型抗菌制劑的熱點之一。因此,噬菌體療法(Phage Therapy)有望成為改善和解決耐藥性致病菌感染的有效策略[6-9]。

    產腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichia coli,ETEC)是一類致人和幼畜胃腸道感染以及腹瀉的病原性致病菌;腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicE. coli,EHEC)O157∶H7是世界公認的食源性病原菌和人獸共患病病原[10-14]。針對這兩種致病菌,相繼有研究表明從環(huán)境中分離到了裂解性ETEC噬菌體和EHEC O157∶H7噬菌體,并且目前已有商品化的EHEC O157∶H7裂解性噬菌體產品[12]。然而,自然界分離的噬菌體對宿主菌具有高度專一性[15],噬菌體宿主譜較窄,然而在畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中,動物疾病往往由多種致病菌導致,病原菌較為復雜,宿主單一的噬菌體很難對疾病進行有效控制[16-18],作為抗菌制劑在應用時會受到制約。如何在已有噬菌體的基礎上,簡便快速地拓寬噬菌體宿主譜,目前相關的研究報道較少。

    為解決噬菌體宿主譜窄的問題,本研究[19]將前期分離到的一株ETEC噬菌體vB_EcoM_JS09(簡稱JS09)與一株非宿主菌EHEC O157∶H7 47共培養(yǎng),通過優(yōu)化培養(yǎng)體系和條件,經過多輪共培養(yǎng)篩選到了能同時裂解ETEC和EHEC O157∶H7菌株的噬菌體,拓寬了親本噬菌體JS09的宿主譜,建立了一種拓寬噬菌體宿主譜的方法,并進一步研究了裂解性較好的寬宿主譜噬菌體Bp47-12的生物學特性和裂解特性。

    1 材料與方法

    1.1 菌株、噬菌體與試劑噬菌體vB_EcoM_JS09(簡稱JS09,GenBank登錄號:KF582788)由本實驗室分離并保存;ETEC EK99-F41菌株由本實驗室保存;EHEC O157∶H7 47菌株來源于牛,EHEC O157∶H7 86-24菌株來源于人,EHEC O157∶H7 363菌株來源未知,以上菌株均由江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)所贈與;EHEC O157∶H7 012和027菌株來源于豬,由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)所王少輝贈與;LB培養(yǎng)基購自海博(青島)生物技術有限公司。

    1.2 噬菌體的培養(yǎng)挑取ETEC EK99-F41的單個菌落接種于4 mL液體LB中,于37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜,得到宿主菌濃度約為1×109CFU/mL。取EK99-F41菌液(1×109CFU/mL)150 μL加入噬菌體JS09純培養(yǎng)液(1×1010PFU/mL)200 μL中,室溫靜置吸附15 min,加入10 mL液體LB培養(yǎng)基,37℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)6 h,于4℃條件下11 269 ×g離心10 min,收集上清,0.22 μm濾膜過濾,并保存于4℃。

    1.3 噬菌體宿主譜的拓寬方法按照MOI為100的比例,取1 mL噬菌體JS09(1×1010PFU/mL)與 100 μL EHEC O157∶H7 47(1×109CFU/mL)充分混合,室溫靜置吸附15 min后,進行雙層瓊脂平板試驗,加入3.5 mL 55℃左右的0.6%瓊脂LB培養(yǎng)基,迅速混勻倒入1.2%瓊脂LB平板上,凝固后37℃培養(yǎng)12 h,共3個雙層瓊脂平板。

    1.4 寬宿主譜噬菌體的分離與純化標記雙層瓊脂平板上的典型噬菌斑,分別編號,用槍頭分別移取噬菌斑于500 μL LB培養(yǎng)液中,37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)8 h。選取液體澄清的編號樣品,進行下一步擴大培養(yǎng)。

    取上述樣品,全部與100 μL EHEC O157∶H7 47(1×109CFU/mL)混合,室溫靜置吸附15 min后,接入5 mL LB培養(yǎng)液中。37℃靜置培養(yǎng)6 h,選取液體澄清的樣品,7826×g離心10 min,取上清液,0.22 μm濾膜過濾,保存于4℃。分別測定單一噬菌斑,重復該純化操作3~5次即得純化噬菌體。

    1.5 噬菌體宿主譜的點樣試驗通過點樣試驗分析純化的噬菌體宿主譜[19],當噬菌體能夠裂解細菌時會出現抑菌圈,統計噬菌體對各細菌的裂解情況得到該噬菌體的宿主譜(表1)。

    1.6 寬宿主譜噬菌體噬菌斑形態(tài)分析參照1.3中的雙層瓊脂平板試驗方法,將篩選到的裂解效果較好的寬宿主譜噬菌體Bp47-12,以EHEC O157∶H7 363為宿主菌進行雙層瓊脂平板試驗。

    1.7 寬宿主譜噬菌體最佳感染復數(multiplicity of infection,MOI)的測定 取對數期宿主菌EHEC O157∶H7 363,按不同感染復數1∶1000、1∶100、1∶10、1∶1、10∶1、100∶1加入噬菌體Bp47-12和宿主菌EHEC O157∶H7 363,37℃、 150 r/min振蕩培養(yǎng)5 h,4℃、10 000×g離心10 min,得上清液測定各組噬菌體效價。試驗重復3次,設置不加噬菌體的宿主菌培養(yǎng)液為試驗對照。

    1.8 寬宿主譜噬菌體一步生長曲線繪制參考Leuschner等[20]的方法,取對數期宿主菌EHEC O157∶H7 363,以MOI≥10加入噬菌體Bp47-12,37℃水浴15 min,10 000×g離心1 min,去上清,LB液洗滌2次,細菌沉淀加入37℃預熱的LB液中混勻,迅速于37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng),同時開始計時。每10 min取樣測噬菌體效價,設立不加噬菌體的宿主菌培養(yǎng)液和不加宿主菌的噬菌體作為試驗對照。以感染時間為橫坐標,噬菌體效價對數值為縱坐標,繪制一步生長曲線,試驗重復3次,每次設2個平行。

    1.9 寬宿主譜噬菌體吸附曲線分析培養(yǎng)過夜細菌EHEC O157∶H7 363(接種一個單菌落到5 mL LB中,37℃振蕩過夜培養(yǎng)),取0.5 mL該菌液加入到10 mL LB中,此時細菌濃度約為2×108CFU/mL,再置于37℃振蕩培養(yǎng)60 min。用LB稀釋噬菌體Bp47-12,制備10 mL效價為2×105PFU/mL的噬菌體Bp47-12(稀釋好后測定噬菌體效價);將步驟培養(yǎng)的細菌與制備好的噬菌體充分混合,搖勻后立即取1 mL樣品,于4℃、15 000×g離心1 min,取上清測定噬菌體效價;按照以上取樣方法,每隔5 min取樣測定噬菌體效價至30 min,重復3次取平均值,繪制吸附曲線。

    1.10 寬宿主譜噬菌體酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性測定配 制pH值分別為2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13的蛋白胨水,取不同pH值的蛋白胨水與噬菌體Bp47-12等量混合,37℃水浴2 h后測定效價;取100 μL噬菌體于離心管中,測定初始效價,將離心管分別置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的水浴環(huán)境中作用30 min和60 min,測定噬菌體效價變化。兩個試驗均重復3次,每次設2個平行,取平均值。

    1.11 寬宿主譜噬菌體體外裂解特性分析分別取過夜培養(yǎng)的EHEC O157∶H7 363,EHEC O157∶H7 47和ETEC EK99-F41菌液,用LB將其OD600值調整為0.86(約為2.5×106CFU/mL)左右,以MOI為10的比例加入噬菌體Bp47-12并至終濃度為1×107PFU/mL,于37℃靜置培養(yǎng),同時以不加噬菌體作為對照組。在培養(yǎng)的0~5 h,每1 h檢測一次OD600值的變化。

    2 結果

    2.1 寬宿主譜噬菌體的分離純化及其宿主譜分析噬菌體JS09與EHEC O157∶H7 47共培養(yǎng)后,以EHEC O157∶H7 47為宿主菌,在3個雙層瓊脂平板上共生長了12個較小的噬菌斑。對12個噬菌斑分別進行3次重復分離純化后,最終篩選到能夠使EHEC O157∶H7 47菌液由渾濁變澄清的寬宿主譜噬菌體,分別命名為Bp47-1、Bp47-2、Bp47-3、Bp47-8、Bp47-9和Bp47-12。

    通過點樣試驗觀察LB培養(yǎng)平板上是否出現抑菌圈,結果可知,對照組噬菌體JS09僅能夠裂解ETEC EK99-F41,而噬菌體Bp47-1、Bp47-2、Bp47-3、Bp47-8、Bp47-9和Bp47-12不僅能裂解ETEC EK99-F41,而且能裂解EHEC O157∶H7 47、363、86~24(圖1),以及從臨床分離的豬源EHEC O157:H7菌株012和027(重復3代噬菌體以上)(表1)。

    圖1 噬菌體JS09、Bp47-1、Bp47-2、Bp47-3、Bp47-8、Bp47-9 和Bp47-12 原液單層平板點樣試驗Fig.1 Spot tests of phages JS09, Bp47-1, Bp47-2, Bp47-3, Bp47-8, Bp47-9 and Bp47-12 in the liquid samples

    表1 噬菌體的宿主譜Table 1 Host range of phages

    2.2 寬宿主譜噬菌體的噬菌斑形態(tài)選取裂解效果較好的寬宿主譜噬菌體Bp47-12,以EHEC O157∶H7 363為宿主菌,雙層瓊脂平板試驗表明,噬菌體Bp47-12在平板上均呈現出了典型裂解性噬菌體特征,空斑透亮,邊緣整齊清晰,無暈環(huán)噬菌斑(圖2)。

    2.3 寬宿主譜噬菌體的最佳感染復數噬菌體Bp47-12在MOI為1∶1時,宿主菌EHEC O157∶H7 363釋放的子代噬菌體效價為5.5×108PFU/mL,在各試驗組中最高,為噬菌體擴增時的最佳MOI值(表2)。

    2.4 寬宿主譜噬菌體的一步生長曲線噬菌體Bp47-12感染宿主菌EHEC O157∶H7 363的潛伏期約 30 min,爆發(fā)持續(xù)時間約70 min,根據爆發(fā)末期的噬菌體效價和感染初期的宿主菌濃度算得平均爆發(fā)量為15(平均爆發(fā)量=爆發(fā)末期的噬菌體效價/感染初期的宿主菌濃度)(圖3)。

    2.5 寬宿主譜噬菌體的吸附曲線吸附曲線表明,在37℃時噬菌體Bp47-12在25 min內能夠完全吸附到宿主菌EHEC O157∶H7 363表面(圖4)。

    2.6 寬宿主譜噬菌體的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性測定噬菌體Bp47-12在各溫度下作用30、60 min后效價變化無太大差別,30℃、40℃、50℃、60℃下幾乎維持在初始時的效價,但70℃時下降較快,80℃之后已基本無噬菌體存在(圖5A)。

    噬菌體Bp47-12在pH3~9范圍內效價較穩(wěn)定,pH值小于3以及大于9噬菌體效價都會明顯降低,pH≤2或≥10時基本檢測不到噬菌斑,表明此時大部分噬菌體已經失活(圖5B)。

    2.7 寬宿主譜噬菌體的體外裂解特性加入噬菌體Bp47-12至菌液作用1 h后,Bp47-12組OD600值由0.86降至0.66左右;2 h后,該組OD600值仍在下降,肉眼可觀察到菌液明顯較對照組澄清;作用5 h后,Bp47-12組的OD600值降至0.20左右,下降了約0.66個OD600值,此時菌液變得較為透亮且澄清,而對照組OD600值仍在上升,達到1.4以上,上升了約0.55個OD600值,且菌液較為混濁(圖6A、6B)。

    當宿主菌為ETEC EK99-F41時,加入噬菌體Bp47-12至菌液作用2 h后,Bp47-12組OD600值開始下降,在5 h時OD600值降至0.20左右(圖6C),因此,當MOI為10時,噬菌體Bp47-12能夠有效裂解EHEC O157∶H7 363,EHEC O157:H7 47和ETEC EK99-F41。

    圖2 寬宿主譜噬菌體Bp47-12 雙層瓊脂平板試驗 Fig.2 Bp47-12 with expanded host range in double layer agar plate

    表2 噬菌體Bp47-12 的最佳感染復數測定Table 2 Determination of optimal MOI of Bp47-12

    圖3 噬菌體Bp47-12 一步生長曲線 Fig.3 One-step growth curve of Bp47-12

    圖4 噬菌體Bp47-12 吸附曲線Fig.4 Adsorption curve of Bp47-12

    3 討論

    噬菌體是地球上最豐富和具有多樣性的生物體,大約有1032個有尾噬菌體[21-22]。隨著抗生素在畜牧養(yǎng)殖業(yè)和醫(yī)學上的使用,抗生素耐藥性已經成為一個危害全世界公共健康的問題,大腸桿菌中耐多粘菌素MCR-1(plasmid-mediated colistin resistance)耐藥基因的發(fā)現,標志著細菌對抗生素的耐藥性已突破最后一道防線[23]。近年來,將噬菌體應用于畜牧獸醫(yī)和醫(yī)學領域,已受到全球科研機構和企業(yè)的重視。裂解性噬菌體雖能夠特異性侵染并裂解細菌,但從自然界中分離的裂解性噬菌體宿主譜較窄[24],盡管有研究者通過分離寬宿主譜噬菌體、改造噬菌體基因組以及混合多種噬菌體等方法來改變或擴大噬菌體的宿主譜和裂解特性,但這些方法比較費時費力[18,24]。

    圖5 噬菌體Bp47-12 對溫度(A)及酸堿度(B)的耐受能力Fig.5 Resistance of Bp47-12 to temperature (A), acid and alkali (B)

    圖6 噬菌體Bp47-12 的體外裂解特性分析 Fig.6 In vitro lytic assay of Bp47-12

    由于非宿主菌對噬菌體不敏感,本研究在前期分離的親本ETEC噬菌體JS09基礎上,建立了一種簡便的擴大噬菌體宿主譜的方法。試驗發(fā)現,通過提高MOI的比例將效價較高的噬菌體與非宿主菌共培養(yǎng)能夠有利于篩選到寬宿主譜噬菌體。噬菌體的生存離不開細菌,噬菌體在細菌的進化過程中發(fā)揮著重要的作用[24],噬菌體的宿主特異性不是一成不變的,噬菌體與細菌在生長循環(huán)過程中相互作用共進化,這種互相作用受到環(huán)境條件和整體模式的影響,使得噬菌體或細菌能夠發(fā)生適應性變異[25]。因此推測,在特定的生長條件和選擇壓力下,可促使親本噬菌體的宿主特異性發(fā)生變化。

    噬菌體的宿主譜由噬菌體在感染過程中受體結合蛋白與宿主菌的受體蛋白相互作用決定[2]。有尾噬菌體T4通過尾絲蛋白識別宿主受體,包括長尾絲蛋白和短尾絲蛋白[26]。研究表明,通過改變長尾絲蛋白基因的His box序列能夠拓寬T4噬菌體的宿主 譜[27]。與親本噬菌體JS09相比,噬菌體Bp47-12的短尾絲蛋白基因序列發(fā)生改變(數據尚未發(fā)表)可能導致宿主譜的拓寬,對此機制的研究仍在進行中。通過改變宿主受體結合蛋白基因能夠改變噬菌體宿主譜,Yoichi等[28]利用同源重組技術將T2噬菌體宿主受體識別基因gp37和gp38替換為EHEC O157∶H7特異性噬菌體pp01的gp37和gp38,構建了一株重組噬菌體T2ppD1,該重組噬菌體能夠侵染大腸桿菌O157∶H7及其近緣屬種,但是不能侵染原宿主菌大腸桿菌K12或其衍生菌。

    借助于噬菌體與宿主菌共進化,將噬菌體與非特異性細菌共同培養(yǎng),以期拓寬噬菌體的宿主譜,此技術無需繁瑣耗時的基因操作。Mapes等[24]通過將噬菌體與多株耐藥性不同的銅綠假單胞菌經過幾輪共培養(yǎng),拓寬了銅綠假單胞菌特異性噬菌體的宿主譜,并能夠有效抑制銅綠假單胞菌形成的生物膜。EHEC O157∶H7導致的食品污染和腹瀉嚴重威脅著人類健康[5]。研究表明,EHEC O157∶H7噬菌體主要應用于食品和食品加工器械表面的消毒,以及動物體內的殺菌試驗[29]。在37℃條件下,pp01、e11/2和e4/1c三種噬菌體混合制劑能夠有效地去除肉類中的EHEC O157∶H7[30]。因此,本研究中篩選的能夠裂解EHEC O157∶H7的寬宿主譜噬菌體具有潛在的應用價值。

    本研究建立的拓寬噬菌體宿主譜的方法和分離到的寬宿主譜噬菌體Bp47-12能夠同時裂解ETEC和EHEC O157∶H7菌株,因此具有潛在的應用價值和一定的研究意義,同時也為拓寬裂解性噬菌體宿主譜和應用噬菌體提供科學依據和可行性。

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