Ⅰ群禽腺病毒及其疫苗研究進展

劉吉山，孫培姣，于 雪，程志偉，沈志強,，柳增善，肖躍強

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，濱州 256600；3. 濱州市濱城區(qū)畜牧獸醫(yī)局，濱州 256618；4.吉林大學 動物醫(yī)學學院，長春130062）

禽腺病毒（Fowl adenoviruses，F(xiàn)AdV）是禽類常見的病原，在雞、鴨、鵝體內(nèi)普遍存在，給養(yǎng)禽業(yè)造成極大危害，國際病毒分類委員會（ICTV）將其歸為腺病毒科（Adenoviridae）、禽腺病毒屬（Aviadenovirus）。2018年7月，禽腺病毒屬成員被ICTV劃分為鴨腺病毒B（Duck adenovirus B）、隼腺病毒 A（Falcon adenovirus A）、鵝腺病毒A（Goose adenovirus A）、鴿子腺病毒A、B（Pigeon adenovirus A、B）、鸚鵡腺病毒B（Psittacine adenovirus B）、火雞腺病毒B、C、D（Turkey adenovirus B、C、D）及禽腺病毒 A、B、C、D、E（Fowl adenovirus A、B、C、D 、E）共14個種。根據(jù)血清交叉中和實驗和限制性內(nèi)切酶消化分析，將禽腺病毒分為12個血清型，即FAdV-1～FAdV-8a、FAdV-8b～FAdV-11。

1 病原學

FAdV是無囊膜的雙股DNA病毒，核衣殼呈正二十面體對稱，直徑70～90 nm，正二十面體加纖突是其特征性結(jié)構(gòu)（圖1[1]）。六鄰體（hexon）和五鄰體（penton base）是FAdV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，240個六鄰體和12個五鄰體組成了病毒的核衣殼。五鄰體的主體為蛋白Ⅲ，頂點有兩個纖突（fiber），F(xiàn)AdV-1纖突分別由兩個基因表達，長度不等，其它禽腺病毒兩個纖突長度相同，由同一基因表達；六鄰體由三個完全相同的多肽構(gòu)成，可分為頂部和基部兩部分（圖2[1]）。FAdV非結(jié)構(gòu)蛋白主要包括E4、pol、DBP、pIVa2、52K、EP、33K、100K 等。

Ⅰ群禽腺病毒在凍結(jié)狀態(tài)下穩(wěn)定、耐酸，故能通過胃腸道而繼續(xù)保持活性。無囊膜，對脂溶劑不敏感，但在丙酮中不穩(wěn)定，可被0.1%的甲醛滅 活[2]。

圖1 禽腺病毒9 型乙酸鈾負染電鏡照片（自Virus Taxonomy[1]）Fig.1 Electron micrograph of FAdV-9 particle negatively stained with uranyl acetate (from Virus Taxonomy[1])

圖2 禽腺病毒結(jié)構(gòu)示意圖（修改自Virus Taxonomy[1]）Fig.2 Schematic diagram of avian adenovirus structure (modified from Virus Taxonomy[1])

2 流行病學

FAdV主要在禽類的消化道和呼吸道復制，既可通過污染的飼料、飲水、排泄物或是接觸水平傳播，也可通過卵黃囊、雞胚絨毛尿囊膜及尿囊腔垂直傳播。大部分FAdV為條件性致病病原，當有其它免疫抑制性疾病存在時，可明顯增強其致病性。臨床上主要表現(xiàn)為心包積液綜合征（hydropericardium syndrome，HPS）、包涵體肝炎（inclusion body hepatitis，IBH）和肌胃糜爛（gizzard erosions，GE）。

HPS主要由FAdV-4血清型引起，屬于禽腺病毒C種成員，死亡率超過30%[3]。該病最早在巴基斯坦卡拉奇市附近的安卡拉地區(qū)發(fā)生，故也稱為安卡拉病。此后，在亞洲及中南美洲的許多國家或地區(qū)相繼發(fā)現(xiàn)該病，并且從發(fā)病的肉雞肝臟中分離到了腺病毒。我國自2015年山東省爆發(fā)HPS后，該病相繼在河南省、江蘇省、安徽省、湖南省、湖北省、廣東省、廣西壯族自治區(qū)等16省廣泛流行。FAdV的12個血清型都可引發(fā)IBH，主要由E種FAdV-7、8a、8b與D種FAdV-2、11血清型引起發(fā)病。肌胃糜爛（GE）主要由FAdV-1、FAdV-8血清型引起，目前只有在白來航雞上有較多報道[4-5]。

我國雞群感染流行病毒株主要有FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-10及FAdV-11等血清型[6-12]。Zhao等[13]收集了2014～2016年北京市、天津市、山東省等13個省市119個非免疫雞群的4544份血清樣本（圖3），ELISA方法檢測有4004份呈陽性，占總量的88.10%，且有逐年遞增趨勢；119個雞群中FAdV抗體陽性率100%，發(fā)病率從53.3%到100%不等，在75個分離株中，有71株與FAdV-C（參考株JSJ13）的同源性超過99%。

圖3 禽腺病毒流行態(tài)勢圖（引自Zhao 等[13]）Fig.3 Epidemic situation map of FAdV (from Zhao, et al[13])

3 臨床特征

3.1 心包積液綜合征（HPS）2～30周齡均可發(fā)病，發(fā)病越早，死淘率越高。肉雞多發(fā)，海藍蛋雞、京紅蛋雞以及麻雞、三黃雞均有發(fā)病。病雞表現(xiàn)精神沉郁、食欲減退或廢絕、翅膀下垂、羽毛蓬亂、曲腿蹲立、伏臥不起，有雞冠和肉髯發(fā)白癥狀，臨死前鳴叫、撲騰、掙扎，并出現(xiàn)角弓反張等神經(jīng)癥狀；心包囊內(nèi)多可見淡黃色清亮積液，肝臟和心臟有多處局灶性壞死，多伴有肺水腫及肝腎腫大。

3.2 包涵體肝炎（IBH）多見于3～7周齡肉雞，以6周齡以前的雞最常見，但也見于小母雞和產(chǎn)蛋雞，發(fā)病率不高，死亡率10%～30%。病雛雞生長受阻、羽毛粗亂、蹲伏，發(fā)病后48h內(nèi)死亡或逐漸康復。解剖可見肝臟蒼白、腫脹質(zhì)脆，肝實質(zhì)可見點狀出血，漿膜下可見出血斑。

3.3 肌胃糜爛（GE）感染雞群表現(xiàn)生長不均，羽毛無光澤，未見其它明顯的臨床癥狀，剖檢時發(fā)現(xiàn)肌胃糜爛和腸道病變，檢測并分離到禽腺病毒[14]。

4 疫苗研制

FAdV血清型多、致病力差異大。隨著其感染范圍越來越廣泛，許多國家和地區(qū)研制滅活疫苗、減毒活疫苗及亞單位疫苗等預防該病。在亞洲、非洲、拉丁美洲、大洋洲，包括巴基斯坦、印度、墨西哥、秘魯、埃及等50多個國家和地區(qū)已有商品化的滅活疫苗，大多是血清4型、8/8a型病毒單價、多價以及與其它禽源病毒聯(lián)苗，僅有1種非致弱8a毒株Esurient活疫苗，在澳大利亞用于產(chǎn)蛋前種雞免疫，詳見附表1（來源：http://www.cfsph.iastate.edu）。這些疫苗雖取得了一定的效果，但不能完全預防FAdV的感染。

4.1 全病毒滅活疫苗滅活疫苗是較早研發(fā)和投入到臨床使用的疫苗，巴基斯坦首次爆發(fā)HPS后，開始用肝勻漿滅活疫苗預防本地區(qū)的疾病，取得了顯著成效。免疫程序上，在15～18日齡免疫一次，或者是在10日齡首免、21日齡時加強免疫，保護效果最好。Chandra等[15]報道，10～15日齡雞肌肉注射肝臟組織勻漿滅活苗（0.25 mL/羽）滅活細胞苗（103.5LD50/羽）可以控制HPS，且在HPS爆發(fā)后免疫仍可以有效降低死亡率。

雖然肝勻漿滅活疫苗被廣泛用于防控肉雞的IBH和HPS，且取得一定成效，但該疫苗仍存在幾點不足，包括：①該疫苗一般是采集不同地區(qū)臨床病死雞的肝組織樣品制備而成，疫苗中的抗原含量差異較大，效果不穩(wěn)定；②病死雞肝組織勻漿容易混雜或引發(fā)細菌和其它病毒的污染，疫苗免疫反應的不可預知性發(fā)生機率較高[16]。Khan等[17]的研究表明，免疫過當?shù)豀PS病死雞肝組織滅活疫苗的肉雞仍然常發(fā)生該病。由于病毒可以通過SPF胚和細胞培養(yǎng)物傳播，建議停止使用肝組織滅活疫苗。

Kim等[18]給禽免疫FAdV-4油乳劑細胞滅活疫苗，可有效抵御其它血清型病毒的感染，其中對FAdV-5、8a和11均能夠完全保護，并且這種保護作用能傳遞給免疫禽的子代。類似研究表明FAdV-4疫苗可以有效地預防FAdV-4以及其它血清型FAdV感染在家禽中的傳播。

Icochea等[19]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV-4油乳劑滅活疫苗可以預防IBH。Junnu等[20]制備了引起泰國IBH的FAdV-2雙乙烯亞胺滅活疫苗，對免疫雞及其子代的保護率分別達到了100%和90%。韋悠等[21]以FAdV-4、8血清型病毒制備了單價及雙價油乳劑滅活疫苗，3種疫苗能夠較好地誘導免疫抗體的產(chǎn)生，在免疫后第4周達到峰值，至免疫后第8周仍維持較高抗體水平，且安全性好；攻毒后，3種疫苗的保護率均為100%；田間試驗結(jié)果顯示，免疫保護期在6個月以上，雙價苗效力與單價苗基本相同。

自2013年起，高致病性的FAdV-4腺病毒引起的HPS和IBH給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。國內(nèi)研究人員發(fā)現(xiàn)[22-23]，麻鴨、櫻桃谷鴨也可感染FAdV-4并發(fā)病，其中櫻桃谷鴨場病死率數(shù)據(jù)不詳，麻鴨場鴨群發(fā)病后死亡率達到40%，使用同源組織滅活疫苗后成功控制了該病。Du等[24]比較了FAdV-4雞胚苗和細胞苗在雞體內(nèi)的免疫保護效力，用AGP和ELISA檢測抗體水平，結(jié)果顯示，細胞苗誘發(fā)的免疫應答顯著提前，且抗體水平更高，攻毒后，細胞苗免疫組動物未見明顯的組織損傷和病理學病變，而雞胚苗免疫組有包涵體肝炎發(fā)生，但兩個免疫組均未見死亡，該研究提示，腺病毒細胞苗可能是防控FAdV-4腺病毒的更好選擇。

4.2 弱毒活疫苗HPS活疫苗系FAdV流行株適應雞胚或某些細胞系后，通過培養(yǎng)傳代的方法使其毒力減弱而制備成的疫苗。

Mansoor等[16]研發(fā)了一種預防HPS的弱毒活疫苗，將一株引發(fā)HPS的病毒分離株在雞胚中盲傳4代使之適應雞胚，連續(xù)傳代12代后得到弱毒活疫苗株，通過口服和非口服途徑感染14日齡的肉雞，測試致弱病毒的效果。分別用16代的弱毒株制備成疫苗和商品化肝組織甲醛滅活疫苗免疫肉雞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，減毒活疫苗組的抗體水平顯著高于肝組織勻漿組。免疫后24 d攻毒，減毒活疫苗組和肝組織勻漿組的保護率分別為95%和55%，前者雞群肝臟和心臟的病變損傷率更小。因此，在預防肉雞的HPS上，減毒活疫苗更有潛力。

然而，Gupta等[25]研究表明活疫苗和滅活疫苗的保護效力差異不顯著。將雞群分為3組，對照組口服生理鹽水；活疫苗組在雞16周齡時口服FAdV-8b-SK + FAdV-11-1047二價活疫苗，滅活組分別在16周和19周齡時肌注FAdV-8b-SK + FAdV-11-1047二價滅活疫苗，分別檢測19、22、30和48周齡血清中抗體濃度。檢測抗體能中和D種和E種的各個血清型，活疫苗組和滅活疫苗組19周齡、30周齡和48周齡雞血清中的抗體水平差異不顯著；用致死劑量的FAdV-8b-SK、FAdV-11-1047或FAdV-2-685病毒對14日齡的肉雞進行攻毒，其保護率為98%～100%。

活疫苗雖然免疫效果確切，但容易發(fā)生毒力返強或與強毒株重組，有的活疫苗株毒力偏強，在生產(chǎn)過程中存在生物安全隱患，臨床推廣使用受到嚴格的限制。因此，亟需開發(fā)更為安全、且免疫保護效率更高的疫苗制劑。

4.3 亞單位疫苗由于病毒滅活或致弱不徹底，以及腺病毒具有潛在的致瘤性，限制了減毒活疫苗和滅活疫苗的應用，而亞單位疫苗避免了傳統(tǒng)疫苗的這些風險。

圖4 禽腺病毒屬基因組結(jié)構(gòu)（自Virus Taxonomy[1]）Fig.4 Schematic illustration of the genome organization found in Aviadenovirus (from Virus Taxonomy[1])

FAdV基因組為線狀雙鏈DNA分子，長度為 43 804～45 667bp，中間部分序列較為保守，兩端序列差別較大（圖4）。Hexon是禽腺病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，帶有屬和亞屬特異性抗原決定簇，與致病性密切相關(guān)，能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，是病毒主要保護性抗原之一。在感染過程中，纖突（fiber）最先與細胞表面的柯薩奇-腺病毒受體（coxsachievirus-adenovirus receptor，CAR）結(jié)合，隨后五鄰粒基底蛋白與細胞表面的整合素結(jié)合，誘發(fā)網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用，進入細胞[26]?；谝陨咸攸c，這些結(jié)構(gòu)蛋白常作為檢測試劑盒和亞單位疫苗研發(fā)的著手點。

Wang等[27]用大腸桿菌表達FAdV-4的衣殼蛋白（包括fiber-1、fiber-2、五鄰體蛋白和六鄰體蛋白），比較不同接種劑量對雞的免疫保護效果。發(fā)現(xiàn)fiber-2的保護效果最好，是FAdV-4亞單位疫苗的最佳選擇，其次是fiber-1和六鄰體蛋白，五鄰體蛋白只有在高劑量時能產(chǎn)生有效保護。

Schachner等[28]利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了FAdV-4的fiber-1、fiber-2和六鄰體環(huán)-1蛋白，制成亞單位疫苗后免疫雞群，于21 d后用FAdV-4攻毒檢測其保護效力。結(jié)果表明，fiber-2的保護率為96.4%，fiber-1的保護率為62%，而六鄰體免疫組的死亡率卻高達73%，這與Wang等[27]的研究結(jié)果相近。因此，fiber-2蛋白是FAdV-4的重要保護性免疫原，可以為心包積水綜合征的亞單位疫苗的研發(fā)提供參考。

Gupta等[29]用FAdV-8b病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）和FAdV-8b fiber亞單位疫苗免疫雞群，然后用FAdV-8b強毒對其后代進行攻毒，結(jié)果保護率分別為100%和82.7%。表明免疫該疫苗后，母源抗體可以保護仔雞，防止FAdV-8b的感染。

Shah等[30]用E.coli原核表達FAdV的Penton蛋白制備亞單位疫苗，在肉雞中開展了免疫原性測定和強毒攻毒保護試驗，結(jié)果顯示該疫苗保護率在90%以上，表明該亞單位疫苗可作為防控 HPS的候選制劑。

5 小結(jié)

目前，F(xiàn)AdV在世界范圍內(nèi)感染普遍，血清型眾多，不同血清型的致病性有較大差異。目前防控該病毒引發(fā)疫病還是以預防為主、防治結(jié)合，根據(jù)疫病的流行特征和發(fā)病規(guī)律等制定綜合防控方案，并注意協(xié)同致病疾病的防控。

同時，良好的飼養(yǎng)環(huán)境（如消毒、保證生物安全、適當?shù)耐L）可顯著減少感染。在發(fā)生HPS的肉雞群飲水中添加0.07%～0.1%濃度的碘消靈可有效縮短肉雞的病程，并降低死亡率。在疾病爆發(fā)后，注射相應的高免卵黃抗體或高免血清，同時使用適當抗生素以預防細菌繼發(fā)感染，可以很大程度上降低死亡率，但對于飼養(yǎng)期長的品種禽療效并不顯著，亟待有效疫苗問世。

自從1987年爆發(fā)后，研究者們用各種方法預防和控制該病毒引發(fā)的疫病，由于其致病機理的研究尚未完全清晰，疫苗的研發(fā)仍是一項非常艱巨的任務。

生Company 司n 公產(chǎn)Agrovet Avivac Ltd.Investigació Aplicada, S.A. de C.V.Boehringer Ingelheim International GmbH Centrovet Laboratory Hester Biosciences Ltd.Venkateshwara Hatcheries Pvt. Ltd. Merck Animal Health Merck Animal Health Ottoman Pharma Saadat International Intervac (PVT) Ltd.Bio-Labs (PVT) Limited Boehringer Ingelheim International GmbH INDOVAX Pvt.Ltd.Jordan Bio-Industries Center (JOVAC)苗HPS/IBH 疫的市上準批已家國同1 不表Table 1 Licensed vaccine available against HPS/IBH in different countries區(qū)/地家國市上Licensed countries/area Russia Mexico劑佐Adjuvant Not Available Russia Oil Oil型/亞株毒Strain/subtype Serotype 4 (HS) LaSota (ND)類Type型Killed Not Available Killed Not Available Killed Se r ot ype 4/ Se r ot yp e 4/ Mexico Chile India Oil A l u m i n u m hydroxide gel Oil Killed Strain 127 (EDS) Serotypes 4, 8 (HS/IBH) Massachusetts (IB)Killed Serotype 4 Killed Type 4 India Oil Killed Serotype 4 Ecuador Australia Pakistan Pakistan Oil None Not Available Pakistan Oil Not Available Pakistan Aqueous Killed Clone 30 (ND)/Serotype 4 (HS) Esurient Live Killed Not Available Killed Type 4 Killed Not Available Killed Not Available Algeria, Bahrain, Egypt, Iran, Jordan, Kuwait, Lebanon, Libya, Oman, Qatar, Saudi Arabia, Sudan, Syria, United Arab Emirates, Yemen Bangladesh, Brunei Darussalam, Cameroon, Chad, Egypt, India, Indonesia, Kenya, Mozambique, Myanmar, Nepal, Nigeria, Sri Lanka, Tanzania, Uganda, Vietnam, Zambia Afghanistan, Azerbaijan, Egypt, Iran, Iraq, Kenya, Kuwait Lebanon, Oman, Pakistan, Qatar, Saudi Arabia, Sudan, Syria, Tunisia, United Arab Emirates Oil Oil Oil (IBH/HS)/LaSota Killed Group Ⅰassachusetts (IB)/(ND)Killed Type 4 Killed LaSota (ND)/Adenovirus group 1, serotype 4 (HS)Serotypes 4, 8a, 11 (HS)/LaSota (ND)/CEO Strain (ILT)/Serotype C (IC)Serotypes 4, 8a, 11 (HS)/LaSota (ND)/M Serotype C (IC)Serotypes 4, 8a, 11 (HS)/LaSota (ND)/Massachusetts (IB)Serotypes 4, 8 (HS)/LaSota (ND)名品產(chǎn)Product name HPS vaccine AVIVAC-ADENO Emulmax IBH/ Emulmax-C IBH/Emulmax IBH+ND Volvac? EDS+IBH+IB KV Inclusion Body Hepatitis Inactivated IBH/HPS IBH/HPS Inactivated Vaccine NOBILIS? Newcastle-Hepatitis NOBILIS? FAV OTTO HPS VAC Angavac Hydrofas/Hydro Plus HydroVac Volvac? IBH+ND KV H P Vax(HPS, IBH)Jova Zeit 1,6 (ND, HPS)-L TO L E O V A C H C I-N W CORIZA? (HPS, ND, ILT, IC)O L E O V A C H C I-N W-B RCORIZA? (HPS, ND, IB, IC)OLEOVAC HCI-NW-BR? (HPS, ND, IB)OLEOVAC HCI-NW? (HPS, ND)

生Company司公產(chǎn)Farmacológicos Veterinarios S.A.C. (FARVET)A v i m e x A n i m a l Health區(qū)/地家國市上Licensed countries/area Bolivia, Colombia, Ecuador, Peru, Venezuela劑佐Adjuvant Oil毒Strain/subtype型/亞株(ND)/Serotype C (IC)類Type型Killed Serotypes 4, 8a, 11 (HS)/LaSota Australia,Bangladesh, Costa Rica, Malaysia, ①Japan, Nepal, Pakistan, Saudi Arabia;⑤Bolivia, Colombia, Dominican Republic, Guyana, Indonesia, New Zealand, ⑤③④ ④①②Ecuador, Egypt, El Salvador, Guatemala, Honduras, Jordan, Mexico, Panama, Peru, Philippines, South Korea, Venezuela;② ③Nicaragua, Thailand, Trinidad and Tobago, Venezuela, Vietnam Oil Killed Se ro t ype 4/ Se ro t yp e 8/ Serotypes 4, 8/ Serotype 4 (HS) LaSota (ND)/ LaSota (ND) Serotype 4 (HS)）表續(xù)（名品產(chǎn)Product name OLEOVAC HCI-NW-CORIZA? (HPS, ND, IC)①Hepatitis 4 Emulsified Vaccine②Hepatitis 8 Emulsified Vaccine③Hepatitis 4/8 Emulsified Vaccine④ H e p a t i t i s 4 N e w c a s t l e C o n c e n t r a t e d E m u l s i f i e d Vaccine(HPS, ND)⑤Newcastle Hepatitis 4 Emulsified Vaccine(ND, HPS)