冷鮮灘羊肉貯藏中菌體蛋白質(zhì)的變化對 微生物代謝產(chǎn)物的影響

趙曉策，姬 琛，羅瑞明，胡倩倩，尤麗琴，苑昱東

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

冷鮮肉以其安全性、營養(yǎng)性、后熟速度及價格上的優(yōu)勢，成為了我國生肉消費(fèi)的主流產(chǎn)品。然而，冷鮮肉在清潔處理和排酸切割過程中易被微生物污染[1]，導(dǎo)致肉腐敗變質(zhì)，影響其安全性和營養(yǎng)性[2]；所以對微生物含量的控制和微生物群落演替驅(qū)動機(jī)制的研究在冷鮮肉加工貯藏過程中具有重要意義。楊文婷等[3]對手抓羊肉在加工過程中減菌真空包裝材料的選擇及殺菌條件工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。趙光輝[4]對冷卻豬肉在分割過程中微生物污染和增殖情況進(jìn)行了研究。隨著多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可以從宏基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等方面對微生物的菌種及其代謝途徑、代謝調(diào)控機(jī)制進(jìn)行闡述[5]。Lu Dongmei等[6]發(fā)現(xiàn)參與戊糖磷酸途徑的蛋白質(zhì)過量表達(dá)會增加鳥氨酸產(chǎn)量，而影響鳥氨酸合成的鳥氨酸合成酶可能不能限制鳥氨酸產(chǎn)量。Wendler等[7]的研究表明不同條件下的蛋白質(zhì)對糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑產(chǎn)生影響，導(dǎo)致菌體代謝物的差異。慕春龍[8]發(fā)現(xiàn)高蛋白日糧增加了大鼠體內(nèi)與炎癥相關(guān)微生物代謝物的產(chǎn)生，且低蛋白氨基酸日糧對大鼠和仔豬的腸道微生物影響大于高蛋白日糧。代謝途徑的變化會因代謝環(huán)境、代謝所需原料、酶活力等的變化而發(fā)生轉(zhuǎn)變[9]，Zampieri等[10]也研究發(fā)現(xiàn)部分代謝途徑中的產(chǎn)物以及細(xì)菌所處的生長環(huán)境能夠影響細(xì)菌代謝途徑的變化。Muroya等[11]通過電噴霧電離飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（capillary electrophoresis with electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry，CE-TOF-MS）的代謝組學(xué)分析法揭示了豬死后與肉質(zhì)相關(guān)的關(guān)鍵化合物和代謝途徑，并得出部分蛋白質(zhì)會對代謝途徑產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致代謝物變化。因此，微生物在代謝過程中蛋白質(zhì)的變化對其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生影響。而在冷鮮肉的貯藏過程中，對導(dǎo)致其變質(zhì)的微生物在貯藏過程中發(fā)生怎樣變化的研究相對較少。代謝組學(xué)作為一種系統(tǒng)生物學(xué)研究中十分有力的分析技術(shù)，可從整體角度出發(fā)對生命體系微妙的變化進(jìn)行深入挖掘，為食品微生物的研究分析開拓了新的方向與思路[12-13]。

本課題組胡倩倩等[14]前期采用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（surface enhanced laser desorption ionization-TOF-MS，SELDI-TOF-MS）技術(shù)找出了冷鮮灘羊肉貯藏中微生物的菌體差異蛋白質(zhì)，并通過氣相色譜（gas chromatography，GC）-TOF-MS技術(shù)檢測到了微生物主要差異代謝物[15]。本研究在此基礎(chǔ)上通過分析冷鮮灘羊肉貯藏中微生物的菌體差異蛋白質(zhì)及其差異代謝產(chǎn)物，研究二者的變化規(guī)律及代謝產(chǎn)物的代謝途徑，采用熱力圖分析菌體蛋白質(zhì)與代謝產(chǎn)物的關(guān)聯(lián)性，研究因微生物群落演替形成的差異菌體蛋白質(zhì)的變化在貯藏過程中與代謝產(chǎn)物的關(guān)系，及其對微生物代謝途徑的影響。為深入探究微生物群落演替的內(nèi)在驅(qū)動機(jī)制，通過抑制微生物新陳代謝和繁衍延長灘羊肉貨架期及開發(fā)保鮮新技術(shù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

灘羊肉購自寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司，當(dāng)天屠宰切割后立刻密封包裝放入冷藏箱，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后迅速放入－20 ℃冰箱1 h，使其中心溫度降至0 ℃，后將其置于0 ℃冰箱中貯藏[16]。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀 美國Agilent公司；Chroma TO F P E G A S U S H T 質(zhì)譜儀 美國L E C O 公司； JXFSTPRP-24研磨儀 上海凈信科技有限公司；TGL-16M 高速冷凍臺式離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；AE240分析天平 瑞士梅特勒公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

無菌條件下，隨機(jī)選取均等灘羊胴體分割（每塊約10 g），保鮮膜密封包裝，貯藏于0 ℃冰箱中，采集貯藏期分別為0、4、8、12 d的灘羊肉表面刮擦物150 mg（表面刮擦物含微生物、血液、肉汁液等[17]）。每組樣品3 個平行。

1.3.2 冷鮮灘羊肉貯藏過程中微生物菌體差異蛋白分析

參考胡倩倩等[14]的方法，采用SELDI-TOF-MS平臺對貯藏0、4、8 d的灘羊肉微生物菌體差異蛋白進(jìn)行檢測、分析和篩選，得到微生物菌體蛋白質(zhì)在貯藏期間的變化規(guī)律。

1.3.3 采用GC-TOF-MS技術(shù)分析冷鮮灘羊肉微生物差異代謝物

參考胡倩倩等[14]的方法，通過GC-TOF-MS技術(shù)對冷鮮灘羊肉微生物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，找出冷鮮灘羊肉表面微生物分別在0、4、8、12 d 4 個貯藏時間點(diǎn)呈現(xiàn)出2 次差異的代謝產(chǎn)物，并以Similarity值大于900且 OPLS-DA模型變異權(quán)重系數(shù)VIP值大于1.0作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出D-甘油酸、天冬酰胺、1-磷酸葡萄糖、5’-肌苷酸、核糖、乙酰苯胺、苯丙氨酸和天冬氨酸共8 種差異代謝產(chǎn)物，分析其在貯藏過程中的變化規(guī)律。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0軟件對灘羊肉在貯藏過程中微生物菌體蛋白質(zhì)及代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律進(jìn)行分析。然后使用R軟件的“Pearson”算法及SIMCA軟件（V 14.1）對菌體蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物進(jìn)行熱力圖分析，找出菌體蛋白質(zhì)與代謝產(chǎn)物之間的關(guān)聯(lián)性。并通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）找出差異代謝物的代謝途徑，研究冷鮮灘羊肉表面微生物的菌體蛋白質(zhì)對其差異代謝物的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷鮮灘羊肉貯藏過程中菌體蛋白質(zhì)及差異代謝物的變化規(guī)律

2.1.1 冷鮮灘羊肉貯藏過程中菌體蛋白質(zhì)的變化規(guī)律

表 1 冷鮮灘羊肉微生物的菌體蛋白質(zhì)相對含量在貯藏過程中的變化Table 1 Changes in bacterial proteins on fresh Tan sheep meat during chilled storage

采用SELDI-TOF-MS測得冷鮮灘羊肉在貯藏過程中微生物的16 個菌體蛋白質(zhì)，從表1可看出，在貯藏過程中，菌體蛋白中的壞死誘導(dǎo)疫霉蛋白質(zhì)、NADH-泛醌氧化還原酶鏈4L、生長抑制素-28、GRF/GHRH生長激素釋放素、抗菌肽、ATP合酶F（0）復(fù)合體亞基C1、ATP合成蛋白質(zhì)8、載脂蛋白質(zhì)C-II、朊蛋白質(zhì)類、載脂蛋白質(zhì)E的相對含量隨著貯藏時間延長出現(xiàn)明顯的變化。說明冷鮮灘羊肉在貯藏過程中，微生物的菌體蛋白質(zhì)在貯藏期間發(fā)生了明顯變化。

2.1.2 冷鮮灘羊肉貯藏過程中差異代謝物的變化規(guī)律

該研究中選取2012年7月—2013年7月在該單位接受口腔種植骨結(jié)合治療的糖尿病患者與非糖尿病患者各50例，并對這些患者進(jìn)行隨訪5年，對接受治療的兩組患者的牙齒成活情況進(jìn)行分析比較，對所得的糖尿病患者與非糖尿病患者種植體修復(fù)牙齒的3個月、1年以及5年失敗率的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)計算得出，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。通過得出的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)糖尿病的種植體修復(fù)牙齒失敗率略高于非糖尿病患者，所以糖尿病是可以對種植體骨結(jié)合有所影響的。

采用GC-TOF-MS技術(shù)測得冷鮮灘羊肉貯藏過程中的30 種微生物胞內(nèi)差異代謝物，以Similarity值大于900且OPLS-DA模型變異權(quán)重系數(shù)VIP值大于1.0作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出8 種差異代謝物：D-甘油酸、1-磷酸葡萄糖、天冬酰胺、核糖、磷酸-5’-肌苷酸、乙酰苯胺3、天冬氨酸1、苯丙氨酸1，這8 種差異代謝物在貯藏期間的變化規(guī)律見圖1。

圖1表明，在冷鮮灘羊肉貯藏過程中，差異代謝物D-甘油酸、天冬酰胺4、核糖、天冬氨酸1、苯丙氨酸1相對含量隨著貯藏時間的延長而增長，1-磷酸葡萄糖、磷酸-5’-肌苷酸、乙酰苯胺3相對含量隨著貯藏時間延長而下降。其主要原因可能是在不同貯藏時間的優(yōu)勢菌發(fā)生演替變化，優(yōu)勢菌經(jīng)過代謝途徑中三羧酸循環(huán)、苯丙氨酸代謝、甘油酯代謝等，與其相關(guān)的差異代謝物相對含量出現(xiàn)了或增或減的趨勢[16]。表1和圖1結(jié)果表明冷鮮灘羊肉在貯藏中微生物在演替過程中發(fā)生了變化，采用熱力圖研究菌體蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物之間的關(guān)聯(lián)性，以驗(yàn)證二者之間的關(guān)系。

圖 1 冷鮮灘羊肉貯藏過程中微生物差異代謝物變化規(guī)律Fig. 1 Changes of differential metabolites in bacteria of fresh Tan sheep meat during chilled storage

2.2 冷鮮灘羊肉貯藏過程中菌體蛋白質(zhì)與代謝物的相關(guān)性分析

利用R軟件的Spearman算法對冷鮮灘羊肉貯藏過程中微生物的菌體蛋白質(zhì)與差異代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析，根據(jù)其相關(guān)性系數(shù)矩陣分析的結(jié)果和相關(guān)性P值矩陣分析的結(jié)果作熱力圖（圖2）。

圖 2 冷鮮灘羊肉貯藏過程中菌體蛋白質(zhì)與其代謝物相關(guān)性熱力圖Fig. 2 Heat map of bacterial proteins and metabolites in fresh Tan sheep meat during chilled storage

由圖2可看出冷鮮灘羊肉貯藏過程中16 種菌體蛋白質(zhì)與8 種代謝物的相關(guān)性。通過KEGG數(shù)據(jù)庫查找這8 種代謝物的代謝通路，分析菌體蛋白質(zhì)對代謝物產(chǎn)生的影響。結(jié)合冷鮮灘羊肉貯藏過程中菌體蛋白質(zhì)和差異代謝物變化規(guī)律及二者之間的相關(guān)性可看出，微生物在生長代謝過程中，菌體蛋白質(zhì)對與其相關(guān)聯(lián)的代謝物的代謝過程產(chǎn)生著促進(jìn)或抑制的作用，導(dǎo)致代謝物的種類及含量也發(fā)生變化。

苯丙氨酸代謝（map00360）會產(chǎn)生苯丙氨酸1[17]，冷鮮灘羊肉在貯藏過程中苯丙氨酸1相對含量呈增長趨勢，該變化可能與壞死誘導(dǎo)疫霉蛋白（M8414-05）相對含量隨著貯藏時間延長而增長有關(guān)。

代謝途徑為嘌呤代謝（map00230）的磷酸-5’-肌苷 酸[18-19]，其相對含量隨著貯藏時間延長呈下降趨勢，其原因可能為，40S核糖體蛋白質(zhì)S26（M12826-1）、載脂蛋白質(zhì)E（M34203-3）、ATP合成蛋白質(zhì)8（M7709-26）有利于代謝過程，NADH-泛醌氧化還原酶鏈4L（M10880-9）、 生長抑制素-28（M3130-58）、ATP合酶F（0）復(fù)合體亞基C1（M7668-64）、壞死誘導(dǎo)疫霉蛋白質(zhì)（M8414-05）會抑制代謝過程。

1-磷酸葡萄糖的代謝途徑為戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化[20]（map00040），1-磷酸葡萄糖相對含量隨著貯藏時間的延長而下降，可能是因?yàn)棣?-微球蛋白質(zhì)（M11870-3）、載脂蛋白質(zhì)E（M34203-3）、ATP合成蛋白質(zhì)8（M7709-26）促進(jìn)代謝過程，NADH-泛 醌氧化還原酶鏈4L（M10880-9）、生長抑制素-28 （M 3 1 3 0-5 8）、AT P 合酶F（0）復(fù)合體亞基C 1 （M7668-64）、壞死誘導(dǎo)疫霉蛋白質(zhì)（M8414-05）、朊蛋白質(zhì)類（M9074-86）抑制代謝過程。

天冬氨酸1的代謝途徑為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝[26]（map00250）、組氨酸代謝[27]（map00340）、氰基氨基酸代謝[28]（map00460），隨著貯藏時間的延長，天冬氨酸1的相對含量上升，與其呈正相關(guān)的菌體蛋白質(zhì)NADH-泛醌氧化還原酶鏈4L（M10880-9）、壞死誘導(dǎo)疫霉蛋白質(zhì)（M8414-05）相對含量呈增長趨勢。

核糖相對含量在貯藏期間呈趨勢增長，與其相關(guān)性較大的菌體蛋白質(zhì)硫氧還蛋白質(zhì)（M11722-8）、β2-微球蛋白質(zhì)（M11870-3）、載脂蛋白質(zhì)E（M34203-3）及磷脂結(jié)合蛋白質(zhì)（M38968-8）的相對含量隨著貯藏時間延長呈遞減趨勢，可能是這些菌體蛋白質(zhì)對其代謝途徑（戊糖磷酸途徑）產(chǎn)生了影響。

可產(chǎn)生天冬酰胺4的代謝途徑為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝[29]，氰基氨基酸代謝[30-31]，天冬酰胺4相對含量在貯藏過程中逐漸增加，在第0、4、8、12天時分別為2.10%、7.29%、9.80%和10.60%，與其呈負(fù)相關(guān)的菌體蛋白質(zhì)硫氧還蛋白質(zhì)（M11722-8）、β2-微球蛋白質(zhì)（M11870-3）、40S核糖體蛋白質(zhì)S26（M12826-1）、GRF/GHRH生長激素釋放素（M5109-45）、磷脂結(jié)合蛋白（M38968-8）、生長調(diào)節(jié)α蛋白質(zhì)（M7823-80）相對含量呈下降趨勢，但呈正相關(guān)的抗菌肽（M7451-79）、載脂蛋白質(zhì)C-II（M8136-55）相對含量呈遞增趨勢。因此可得出這些菌體蛋白質(zhì)可能對天冬酰胺4的代謝途徑產(chǎn)生影響。

乙酰苯胺3的代謝途徑尚未被收錄到KEGG數(shù)據(jù)庫，GRF/GHRH生長激素釋放素（M5109-45）、ATP合成蛋白質(zhì)（M7709-26）會促進(jìn)其產(chǎn)生，而NADH-泛 醌氧化還原酶鏈4L（M10880-9）、生長抑制素-28 （M3130-58）、載脂蛋白質(zhì)C-II（M8136-55）、壞死誘導(dǎo)疫霉蛋白質(zhì)（M8414-05）會抑制其生成。

綜上所述，冷鮮灘羊肉貯藏過程中，微生物發(fā)生變化的菌體蛋白質(zhì)與一同發(fā)生變化的代謝產(chǎn)物的關(guān)聯(lián)性很大，通過查找KEGG數(shù)據(jù)庫，分析其相關(guān)代謝途徑，具體見圖3。

圖 3 菌體蛋白質(zhì)對微生物代謝通路的影響Fig. 3 Effect of bacterial proteins on microbial metabolic pathways

苯丙氨酸代謝及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路對氰基氨基酸代謝通路有間接影響作用，硫氧還蛋白質(zhì)、β2-微球蛋白質(zhì)、壞死誘導(dǎo)疫霉蛋白質(zhì)和NADH-泛醌氧化還原酶鏈4L促進(jìn)了這些代謝通路產(chǎn)生相應(yīng)的代謝物，而抗菌肽、載脂蛋白質(zhì)C-II、朊蛋白質(zhì)類、磷脂結(jié)合蛋白質(zhì)和生長調(diào)節(jié)α蛋白質(zhì)抑制了這些代謝過程；因氰基氨基酸代謝通路對丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝通路起間接調(diào)控作用，所以上述菌體蛋白質(zhì)對丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝通路仍有影響。

糖醛酸途徑與戊糖磷酸途徑起相互調(diào)控作用，其中β2-微球蛋白質(zhì)、載脂蛋白質(zhì)E和ATP合成蛋白質(zhì)、硫氧還蛋白質(zhì)促進(jìn)相互的代謝過程產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，而NADH-泛醌氧化還原酶鏈4L、生長抑制素-28、ATP合酶F（0）復(fù)合體亞基C1、壞死誘導(dǎo)疫霉蛋白質(zhì)、抗菌肽、載脂蛋白質(zhì)C-II、和朊蛋白質(zhì)類會抑制相互間的代謝通路。

戊糖磷酸途徑、組氨酸代謝途徑及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑通過影響嘌呤代謝不同階段中間產(chǎn)物而影響嘌呤代謝途徑，即硫氧還蛋白質(zhì)、β2-微球蛋白質(zhì)、NADH-泛醌氧化還原酶鏈4L、壞死誘導(dǎo)疫霉蛋白質(zhì)和40S核糖體蛋白質(zhì)S26促進(jìn)代謝物的產(chǎn)生，而抗菌肽、載脂蛋白質(zhì)C-II、朊蛋白質(zhì)類、磷脂結(jié)合蛋白質(zhì)和生長調(diào)節(jié)α蛋白質(zhì)抑制代謝物的產(chǎn)生。

嘌呤代謝通路對甘氨酸的代謝通路起間接調(diào)控作用；甲烷代謝途徑調(diào)控絲氨酸代謝途徑，而絲氨酸代謝途徑又調(diào)控甘油酯代謝途徑。綜上所述，圖3表明菌體蛋白質(zhì)會對微生物代謝通路產(chǎn)生影響，其原因之一是菌體蛋白質(zhì)影響了代謝物的產(chǎn)生過程，即影響了產(chǎn)生該代謝產(chǎn)物的代謝途徑，推測是因?yàn)榫w蛋白含量在代謝期間有差異，導(dǎo)致其對代謝通路影響的程度發(fā)生變化。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用熱力圖分析了冷鮮灘羊肉貯藏過程中微生物的8 種差異代謝物和16 個菌體差異蛋白的關(guān)聯(lián)性，并通過KEGG查找了代謝產(chǎn)物的代謝通路，并探尋其中關(guān)系，研究了菌體蛋白質(zhì)的變化對代謝產(chǎn)物的影響。結(jié)果表明：冷鮮灘羊肉貯藏中菌體蛋白質(zhì)的變化與代謝產(chǎn)物有相關(guān)性，菌體蛋白所占比例上升，影響代謝產(chǎn)物的代謝途徑，導(dǎo)致相關(guān)代謝產(chǎn)物在貯藏過程中的含量也發(fā)生增加或減少。該發(fā)現(xiàn)不僅為微生物群落演替的內(nèi)在驅(qū)動機(jī)制提供了前期研究基礎(chǔ)，也為延長灘羊肉貨架期及開發(fā)保鮮新技術(shù)提供了理論參考。