牛至精油對熒光假單胞菌的抑制作用及其 對冷藏三文魚品質(zhì)的影響

楊勝平，章 縝，程 穎，錢韻芳,，謝 晶,

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

三文魚又稱大西洋鮭（Salmo solar），屬于硬骨魚綱鮭形目鮭科魚類，為冷水域洄游魚類，主產(chǎn)地是挪威、蘇格蘭等北半球高緯度地區(qū)，其肉色呈鮮艷的橘紅色，富含ω-3系不飽和脂肪酸，是國際上流行的名貴食用魚類[1]。在過去10 年里，我國三文魚年消費量也逐年增加，如何在加工貯運過程中減少微生物對其品質(zhì)的影響，也成為了水產(chǎn)品保鮮領(lǐng)域的重要課題之一。在傳統(tǒng)三文魚貯運流程中，低溫下冷鏈物流是一種重要方式，但諸如假單胞菌、單增李斯特菌、嗜冷桿菌等在低溫下具有適冷特性的細菌仍能夠迅速適應(yīng)環(huán)境并大量代謝繁殖，從而導(dǎo)致魚肉質(zhì)的腐敗變質(zhì)[2]。有研究表明，在4 ℃冷鏈運輸條件下熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）數(shù)量仍可逐漸增長成為優(yōu)勢菌，且腐敗能力強[2]，是冷藏三文魚的特定腐敗菌[3]。微生物侵染會導(dǎo)致三文魚蛋白質(zhì)分解、魚體表面發(fā)黏，并產(chǎn)生小分子揮發(fā)性氨類物質(zhì)，形成難聞氣味，最終造成腐敗[4]。熒光假單胞菌的適冷能力是其能夠成為冷藏三文魚特定腐敗菌的關(guān)鍵，這類適冷菌一般都能夠通過調(diào)節(jié)細胞膜流動性來提高低溫下細胞膜磷脂雙分子層的柔性[5-6]。因此，如何抑制熒光假單胞菌的冷適應(yīng)能力有望成為研發(fā)新型保鮮技術(shù)延長水產(chǎn)品貨架期的潛在研究方向。

植物精油是從植物中提取的具有芳香氣味的揮發(fā)性油狀液體混合物，一直以來作為香料添加于食品中以起到提高食品風(fēng)味質(zhì)量的作用[7]。近年來研究表明，部分精油還具有良好的抑菌活性，其中牛至精油因在改善食品風(fēng)味和抑菌活性方面都具有良好作用而受到廣泛關(guān) 注[8]。牛至精油主要是從牛至草的莖和葉中提取而成，主要成分為百里香酚、香芹酚等，其主要作用位點可能是菌體細胞膜[9]。前人研究表明牛至精油對大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、霉菌以及水產(chǎn)品的特定腐敗菌熒光假單胞菌、副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌均有較強的抑制作用[10-11]，但關(guān)于不同溫度，尤其是傳統(tǒng)冷藏溫度（4 ℃）條件下，牛至精油對腐敗菌細胞膜流動性方面的作用還鮮見報道。因此，本實驗主要對比研究了在最適生長溫度（30 ℃）和傳統(tǒng)冷藏溫度（4 ℃）條件下，牛至精油對熒光假單胞菌SBW25生長、細胞膜完整性、流動性以及形態(tài)的影響，探討牛至精油對熒光假單胞菌適冷能力的抑制效果，并通過對接種熒光假單胞菌的三文魚片感官、微生物及理化指標(biāo)的測定，分析牛至精油在抑制熒光假單胞菌導(dǎo)致的三文魚腐敗進程中的作用，為研究與低溫具有協(xié)同作用的保鮮方法提供思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熒光假單胞菌菌株SBW25由本課題組前期從4 ℃冷藏三文魚肉中分離純化并經(jīng)生理生化鑒定，生工生物上海股份有限公司進行16S rRNA測序比對確定菌株，菌株保存于－80 ℃冰箱待用。三文魚購于上海浦東新區(qū)蘆潮港海鮮市場，魚體置于鋪滿碎冰的冷藏箱內(nèi)運至實驗室；牛至精油（產(chǎn)地：西班牙；萃取部位：葉）購自多特瑞上海貿(mào)易有限公司。

腦心浸肉湯、平板計數(shù)瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB）培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒 美國Sigma公司；12%電泳預(yù)制膠、電泳緩沖液 南京建成生物有限公司；雙色預(yù)染蛋白Marker、蛋白Loading Buffer 生工生物工程上海（股份）有限公司；十九烷酸甲酯、濃鹽酸、甲醇、正己烷、氯仿、甲醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PB LDZX-50KB S蒸汽滅菌器 上海申安公司； VS-1300L-U潔凈工作臺 蘇州蘇凈泰安集團；H-2050R臺式離心機 湖南湘儀儀器有限公司；SHA-2型制冷恒溫振蕩器 金壇市城西崢嶸實驗儀器廠；TDDS-307A 型電導(dǎo)率儀 上海雷磁儀器廠；i M a r k 酶標(biāo)儀、S-3400N型掃描電子顯微鏡 日本日立儀器有限公司； K j e l t e c 8 4 0 0 型全自動凱氏定氮儀 丹麥F O S S分析儀器公司；L C-2 0 1 0 C H T 型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、R F-6 0 0 0 熒光分光光度計 日本島津公司； ZE-2000型色差計 日本尼康公司；TA.XT Plus型質(zhì)構(gòu)儀 英國SMS公司；Bag MixerVW型拍打式均質(zhì)器 南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司；低場核磁共振成像分析儀 上海紐曼科技公司。

1.3 方法

1.3.1 牛至精油對熒光假單胞菌的抑菌活性分析

1.3.1.1 熒光假單胞菌的活化與培養(yǎng)

取保藏于－80 ℃冰箱中的熒光假單胞菌菌種，經(jīng)腦心浸肉湯培養(yǎng)基活化18 h后，分別接種1 mL于100 mL TSB培養(yǎng)基中，于30 ℃最適溫度下?lián)u床培養(yǎng)12～18 h至菌液濃度達到108CFU/mL，待用。

1.3.1.2 最小抑菌濃度的測定

在牛津杯均勻放置的培養(yǎng)皿中倒入一定量滅過菌的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，將制備好的菌懸液調(diào)整至106～107CFU/mL，吸取500 μL該菌懸液均勻涂布于培養(yǎng)基上；隨后小心取出牛津杯，在留下的孔洞中注入200 μL不同體積分數(shù)牛至精油；將培養(yǎng)皿放入37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)48 h，測量抑菌圈直徑[12]。做3 組平行，根據(jù)抑菌圈直徑確定最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.3.1.3 熒光假單胞菌抑菌生長曲線的繪制

取1 mL活化好的菌懸液接種于TSB培養(yǎng)液中，30 ℃下?lián)u床培養(yǎng)2 h后加入1、2 倍MIC的牛至精油，以不添加牛至精油處理的樣品為對照組，于30 ℃繼續(xù)搖床培養(yǎng)20 h或4 ℃培養(yǎng)48 h，并用酶標(biāo)儀每4 h（4 ℃）或每2 h（30 ℃）測定OD595nm。

1.3.1.4 菌液電導(dǎo)率的測定

每隔6 h（4 ℃）或2 h（30 ℃）參照Qian Yunfang等[13]的方法用電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率。每個樣品做3 組平行。

1.3.1.5 AKP活力的測定。

每隔6 h（4 ℃）或每2 h（30 ℃）取菌液，在4 ℃下5 000h g離心取上清液，按照AKP試劑盒說明進行測定，單位為U/100 mL，每個樣品做3 組平行。

1.3.1.6 細菌微觀結(jié)構(gòu)觀察

將待測菌液5 000 r/min離心5 min，取沉淀菌體用50 mmol/L、pH 7.0無菌磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3 次，小心固定于體積分數(shù)2.5%戊二醛溶液中6 h，后分別經(jīng)體積分數(shù)30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇梯度脫水自然風(fēng)干后粘至金屬箔片上噴金，于掃描電子顯微鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)變化[14]。

1.3.1.7 熒光假單胞菌膜流動性的測定

參照He Jing等[15]的方法，將分別在30 ℃和4 ℃條件下經(jīng)過MIC牛至精油處理的熒光假單胞菌菌液4 ℃、5 000hg離心收集菌體，用PBS（50 mmol/L、pH 7.0）沖洗3 次后，重懸于含0.5 mmol/L的二硫蘇糖醇和0.1% Tween 20的PBS（50 mmol/L、pH 7.0）中。在4 ℃下手動研磨10 min后離心（10 000hg、20 min），棄沉淀，對上清液進行蛋白質(zhì)量濃度測定并于－40 ℃下保存待用。ANS母液（5 mmol/L）由Tris-HCl緩沖液配制而成，使用前稀釋至1.0h 10－4mol/L。用上述PBS稀釋樣品使蛋白質(zhì)終質(zhì)量濃度為5 mg/L、ANS終濃度為10 μmol/L后，在室溫下靜置20 min，然后4 ℃、5 000hg離心，棄去上清液，蛋白質(zhì)沉淀重懸于PBS中，重復(fù)洗滌2 次后用熒光分光光度計測定其ANS熒光強度。熒光條件：激發(fā)波長385 nm，發(fā)射波長480 nm。

1.3.2 牛至精油對接種假單胞菌三文魚的品質(zhì)影響分析

1.3.2.1 樣品處理

將活化好的熒光假單胞菌菌液稀釋至105CFU/mL后接種于殺菌魚肉[16]，其中一組于提前配制好的體積分數(shù)0.0625%（MIC）牛至精油浸泡60 s，以接種了熒光假單胞菌但未用牛至精油浸泡為對照組。然后將處理好的魚塊放置于4 ℃條件下冷藏12 d，每隔1 d取樣檢測各項指標(biāo)。

1.3.2.2 感官評定

樣品放置于無菌白色托盤中，根據(jù)Sallam[17]的感官評分標(biāo)準(zhǔn)，選取5 名具有感官評定經(jīng)驗的人員分別從氣味、肌肉組織和體表色澤3 個方面進行綜合評分。分數(shù)按降序排列，其中10～9 分為優(yōu)秀，8～7 分為好，6～5 分為可接受，4～3 分為品質(zhì)差，2～1 分為品質(zhì)極差。評定小組成員均已事先熟悉評級標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2.3 菌落總數(shù)的測定

參照Gómez-Estaca等[18]的方法測定菌落總數(shù)。

1.3.2.4 揮發(fā)性鹽基氮含量的測定

稱取5 g左右的剁碎魚肉，與約0.5 g輕質(zhì)氧化鎂加入消化管中，使用凱氏定氮儀測定總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量[19]。

1.3.2.5 生物胺含量的測定

按照Qian Yunfang等[20]的方法，使用HPLC法測定生物胺含量。

1.3.2.6 自由水相對含量的測定

參照Wang Shuo等[21]的方法，采用低場核磁共振成像分析儀測定橫向弛豫時間T2。取體積約為1 cm3大小的魚塊，放入核磁管中進行測定。首先根據(jù)樣品在設(shè)置中選擇測量參數(shù)，確定中心頻率，檢測之后進行數(shù)據(jù)反演，得到T2的分布情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

所有處理做3 個平行，Excel 2010軟件記錄相關(guān)實驗結(jié)果，運用SPSS 19.0軟件進行方差分析和數(shù)據(jù)間的平均值比較，用Origin 9.0軟件繪制曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛至精油對熒光假單胞菌的抑菌活性分析結(jié)果

2.1.1 牛至精油對熒光假單胞菌MIC的確定

MIC是一種驗證保鮮劑抗菌活性的有效指標(biāo)，具體指保鮮劑對目標(biāo)菌株產(chǎn)生抑制作用時所需的最低濃度，常利用測定抑菌圈直徑的方法來確定[22]。由表1可知，抑菌圈直徑與牛至精油體積分數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)增長，與趙海伊等的研究結(jié)果[23]相一致。當(dāng)牛至精油體積分數(shù)達0.062 5% 時，抑菌圈直徑為（8.12f 0.27）mm，此時熒光假單胞菌對牛至精油達到低敏感度，表明此時牛至精油開始對熒光假單胞菌SBW25產(chǎn)生較明顯的抑制作用。由此可確定MIC為0.062 5%。

表 1 牛至精油作用于熒光假單胞菌的MICTable 1 MIC of oregano oil on Pseudomonas fluorescens

2.1.2 牛至精油對假單胞菌生長曲線的影響

由圖1可看出，30 ℃下經(jīng)MIC牛至精油處理的熒光假單胞菌，在培養(yǎng)的前5 h內(nèi)有一定的增長，之后增長則受到抑制，無明顯對數(shù)期；與對照組相比，MIC、2 MIC牛至精油處理組熒光假單胞菌總體增長較慢，說明其生長被抑制。4 ℃下實驗組與對照組熒光假單胞菌生長趨勢與30 ℃相似，說明在低溫下牛至精油也具有抑制熒光假單胞菌SBW25生長繁殖的能力。但4 ℃下，培養(yǎng)末期的OD595nm略高于30 ℃相應(yīng)組別，這可能與低溫下細菌細胞個體體積偏大，導(dǎo)致色散程度增強有關(guān)。Friedman等[24]利用混合了大蒜汁和牛至油的牛至葉提取物處理大腸桿菌及芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)60 min時可減少50%微生物數(shù)量；并進一步研究了不同溫度下抑菌能力（37、21 ℃及4 ℃），其結(jié)果與本研究較一致。

圖 1 牛至精油在30 ℃（A）及4 ℃（B）下對熒光假單胞菌 生長曲線的影響Fig. 1 Effect of oregano essential oil on the growth curves of Pseudomonas fluorescens at 30 (A) and 4 ℃ (B)

2.1.3 牛至精油對假單胞菌菌液電導(dǎo)率的影響

圖 2 牛至精油在30 ℃（A）及4 ℃（B）下對熒光 假單胞菌電導(dǎo)率的影響Fig. 2 Effect of oregano essential oil on electrical conductivity of Pseudomonas fluorescens at 30 (A) and 4 ℃ (B)

細菌的細胞膜具有穩(wěn)定胞內(nèi)離子濃度的功能，如果細胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞，細胞內(nèi)的電解質(zhì)會以離子的形式滲出胞外，導(dǎo)致菌液電導(dǎo)率的變化[25]。因此，通過測定菌液電導(dǎo)率的變化可知細胞膜通透性的變化。如圖2所示，各組假單胞菌菌液電導(dǎo)率均隨培養(yǎng)時間延長而增加，但牛至精油處理組比對照組上升速率更快，相同培養(yǎng)時間時，其電導(dǎo)率明顯高于對照組，可能是由于牛至精油中香芹酚及百里香酚影響了熒光假單胞菌細胞膜陰陽離子，改變了離子梯度；且精油體積分數(shù)越高，菌液電導(dǎo)率越高，這與謝強等[26]對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌細胞膜通透性的研究結(jié)果一致。對于兩個牛至精油處理組，低溫條件下的電導(dǎo)率均低于高溫條件下的電導(dǎo)率，這可能與低溫下精油有效成分擴散較慢有關(guān)。

2.1.4 牛至精油對假單胞菌液中AKP活力的影響

圖 3 牛至精油在30 ℃（A）及4 ℃（B）下對熒光假單胞菌 AKP活力的影響Fig. 3 Effect of oregano essential on AKPase activity of Pseudomonas fluorescens at 30 (A) and 4 ℃ (B)

AKP在生物體內(nèi)細胞物質(zhì)代謝中有著重要的作用。熒光假單胞菌的細胞膜受到破壞會導(dǎo)致AKP滲出到細胞外，引起菌液中AKP活力的變化。如圖3所示，牛至精油處理組和對照組的AKP活力均隨著培養(yǎng)時間延長呈總體上升的趨勢，且牛至精油處理組AKP活力明顯高于對照組。30 ℃條件下，添加牛至精油組菌液中AKP活力先急速上升，隨后逐漸趨于穩(wěn)定增長；低溫下存在同樣趨勢，且培養(yǎng)末期MIC組AKP活力與30 ℃下的相近。4 ℃條件下，2 MIC牛至精油組AKP活力在12 h內(nèi)增至2.31 U/100 mL，增速慢于30 ℃實驗組。這可能因為低溫下精油有效成分擴散較慢，部分熒光假單胞菌膜通透性在一定時間仍能保持完整，AKP未能滲出至胞外。

2.1.5 牛至精油對菌假單胞菌菌體超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖4所示，30 ℃和4 ℃下對照組熒光假單胞菌均呈具有光滑細胞膜的正常形態(tài)。經(jīng)MIC牛至精油作用后，菌體在形態(tài)上發(fā)生了較大的改變，細胞表面褶皺、凹陷，失去了原有的細胞形態(tài)，表明細胞膜被破壞。牛至精油處理組菌體在30 ℃下有黏聚現(xiàn)象發(fā)生，且菌體變小，細胞破裂形成細胞碎片，細胞褶皺下凹而畸形；4 ℃下則能明顯觀察到細胞膜粗糙且附有顆粒，這與Oussalah等[27]的研究結(jié)果一致。由此推測，牛至精油可能是作用于細胞膜（如蛋白質(zhì)和脂質(zhì)）。Tyagi等[28]利用掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡等儀器同樣觀察到另一種植物精油檸檬草精油及其蒸氣對大腸桿菌形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷，與本研究結(jié)果相似。

圖 4 30 ℃（A）及4 ℃（B）下經(jīng)牛至精油作用的熒光 假單胞菌掃描電子顯微鏡圖Fig. 4 Scanning electron micrographs of Pseudomonas fluorescens treated with oregano essential oil at MIC at 30 (A) and 4 ℃ (B)

2.1.6 牛至精油對假單胞菌膜流動性的影響

圖 5 牛至精油在30 ℃及4 ℃下對熒光假單胞菌膜熒光光譜的影響Fig. 5 Effect of oregano essential on the fluorescence spectrum of ANS-labeled membrane in Pseudomonas fluorescens at 30 and 4 ℃

一般而言，低溫下，細菌細胞膜脂肪酸鏈逐漸形成規(guī)則排列的晶型，從而發(fā)生凝固，導(dǎo)致細胞膜流動性下降，但嗜冷菌能夠通過改變細胞膜脂肪酸組成維持一定的細胞膜流動性，以保持細胞膜的生理功能。因此，細胞膜流動性的變化能夠在一定程度上反映牛至精油對細菌冷適應(yīng)能力的影響。熒光強度的大小可反映細胞膜的流動性，一般來說熒光強度越大則細胞膜流動性越差。如圖5所示，兩個溫度條件下，對照組熒光強度均低于MIC牛至精油組，表明對照組細胞膜流動性最好，添加牛至精油后膜流動性降低。這可能是因為有機溶劑精油使細胞膜上形成孔道，導(dǎo)致小分子物質(zhì)從膜內(nèi)滲出；同時精油進入疏水區(qū)會改變細胞膜中脂肪酸組分，從而影響細胞膜的流動性。對于相同處理組，4 ℃下熒光假單胞菌細胞膜的熒光強度明顯高于30 ℃，表明低溫能夠降低細胞膜的流動性，進一步說明牛至精油在低溫條件下具有增效作用。Siroli等[29]研究發(fā)現(xiàn)，牛至精油可以誘導(dǎo)部分與單增李斯特菌、大腸桿菌和沙門氏菌細胞膜相關(guān)的脂肪酸組成發(fā)生轉(zhuǎn)變，具體表現(xiàn)為不飽和脂肪酸、反式異構(gòu)脂肪酸和特定游離脂肪酸的變化，表明牛至精油可以影響細胞膜流動性。

2.2 牛至精油對接種假單胞菌三文魚貯藏過程中品質(zhì)的影響

2.2.1 感官評定

表 2 牛至精油對三文魚4 ℃貯藏過程中的感官評分結(jié)果Table 2 Sensory evaluation scores of salmon during storage at 4 ℃

如表2所示，隨著貯藏時間的延長，對照組和牛至精油處理組感官評分都出現(xiàn)顯著下降；對照組在貯藏第6天時已達到4 分左右，處于感官不可接受范圍，在第8天出現(xiàn)明顯的腐臭味；牛至精油處理組感官評分在前期緩慢下降，在第8天時仍有5.33 分，仍處于可接受范圍內(nèi)，到第10天才低于5 分，達到感官不可接受范圍。從感官方面的判斷，牛至精油有效地改善了三文魚的感官品質(zhì)，可使三文魚感官可接受度貨架期從對照組的6 d延長至8 d，可將貨架期延長2 d。這與van Haute等[30]的研究結(jié)果一致，即添加精油可以有效抑制接種的熒光假單胞菌增殖，減緩三文魚和豬肉的腐敗變質(zhì)。

2.2.2 菌落總數(shù)

圖 6 牛至精油對三文魚貯藏過程中菌落總數(shù)的影響Fig. 6 Effect of oregano essential oil on total viable count of salmon during storage

微生物數(shù)量是影響魚類貨架期的主要因素，是衡量魚肉新鮮程度的主要標(biāo)準(zhǔn)，如圖6所示，牛至精油處理組和對照組的菌落總數(shù)隨著貯藏時間延長均總體呈上升趨勢，且處理組菌落總數(shù)增速明顯小于對照組。與對照組相比，牛至精油處理組菌落總數(shù)在前4 d增長緩慢，這可能因為牛至精油作用于熒光假單胞菌細胞膜，起到了抑菌作用，這與體外抑菌的結(jié)果類似。貯藏末期牛至精油處理組菌落數(shù)未超過對照組，說明MIC牛至精油處理能夠較好地抑制冷藏魚肉中假單胞菌的生長。貯藏12 d后，牛至精油處理組菌落總數(shù)較對照組低 1.34（lg（CFU/g））。

2.2.3 TVB-N含量

圖 7 牛至精油對三文魚貯藏過程中TVB-N含量的影響Fig. 7 Effect of oregano essential oil on TVB-N content of salmon during storage

三文魚富含的蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)極易被分解產(chǎn)生氨等堿性揮發(fā)性物質(zhì)，TVB-N含量是評價三文魚的新鮮度的重要指標(biāo)。如圖7所示，貯藏過程中，牛至精油處理組魚肉TVB-N含量始終低于對照組，對照組在第6天時TVB-N含量為24.43 mg/100 g，處理組在第12天時TVB-N含量為27.66 mg/100 g，這是因為牛至精油能抑制微生物生長繁殖，減緩蛋白質(zhì)的分解。Dolea等[31]研究發(fā)現(xiàn)，牛至精油能緩解三文魚海藻漢堡的TVB-N和三甲胺氮含量的增加，并具有較好的抗氧化性。貯藏12 d后，處理組TVB-N含量比對照組低7.48 mg/100 g。

2.2.4 生物胺含量

圖 8 牛至精油對三文魚貯藏過程中腐胺（A）和尸胺（B）含量的影響Fig. 8 Effect of oregano essential oil on putrescine (A) and cadaverine(B) contents of salmon during storage

腐胺和尸胺是三文魚低溫貯存中含量變化較為明顯的生物胺。由圖8可以看出，4 ℃貯藏初期（0～2 d），對照組和牛至精油處理組的腐胺和尸胺含量并未出現(xiàn)明顯差異。2 d之后，經(jīng)MIC牛至精油處理的魚肉生物胺含量增長受到明顯抑制，直至貯藏結(jié)束，牛至精油處理組腐胺和尸胺含量均低于對照組。第8天時，對照組腐胺、尸胺含量分別為68.18、45.41 mg/kg，牛至精油處理組則僅為35.14、30.21 mg/kg，分別比對照組低48.5%和33.5%。說明牛至精油對熒光假單胞菌有著明顯的抑制作用，能減緩其對魚肉的降解作用，這與Huang Zhan等[32]關(guān)于桂皮精油的研究結(jié)果一致。

2.2.5 低場核磁共振自由水分析結(jié)果

圖 9 牛至精油對三文魚貯藏過程中自由水峰面積比例的影響Fig. 9 Effect of oregano essential oil on peak area ratio of free water in salmon during storage

自由水峰面積的比例能反映自由水相對含量。 由圖9可知，在4 ℃下，隨著貯藏時間的延長，自由水相對含量呈現(xiàn)上升趨勢，這表明魚肉中肌原纖維內(nèi)的水不斷減少，不易流動水逐漸向外流失，并以自由水的形態(tài)存在[33]。整個貯藏期內(nèi)牛至精油處理組自由水相對含量的變化趨勢較對照組更平緩，說明經(jīng)牛至精油處理的魚肉可能具有更好的持水力，水分損失更少。 劉楠等[34]采用低場核磁共振技術(shù)研究了經(jīng)迷迭香、葡萄籽提取物復(fù)合保鮮劑處理后，魚丸貯藏過程中的橫向弛豫時間T2，結(jié)果顯示復(fù)合保鮮劑可有效減少魚丸自由水的生成，與本研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

牛至精油作用于熒光假單胞菌時的MIC為0.062 5%；體外抑菌實驗表明，牛至精油在30 ℃和4 ℃條件下均表現(xiàn)出了較好抑菌效果，經(jīng)牛至精油處理的熒光假單胞菌，掃描電子顯微鏡顯示細胞膜破壞明顯，細胞膜熒光強度變化表明其流動性下降，且電導(dǎo)率及AKP活力均高于對照組，表明牛至精油通過破壞細胞膜、降低細胞膜流動性有效抑制了假單胞的生長代謝。

在4 ℃低溫貯藏過程中，與對照相比，MIC牛至精油處理可有效抑制接種有熒光假單胞菌的三文魚菌落總數(shù)的增長，延緩三文魚肉在低溫貯藏下的品質(zhì)劣變，減少魚肉中自由水的流失和TVB-N、生物胺產(chǎn)量，其能有效抑制冷藏三文魚特定腐敗菌熒光假單胞菌的致腐敗能力，延長了接菌三文魚肉低溫下的貨架期。本研究為冷藏三文魚的保鮮方法研發(fā)提供了一定的理論與實踐依據(jù)。