張馨蕓,林慧嬌,李 欣,敬 舒,孫 微,蔣維海,王春梅,孫靖輝,李 賀,陳建光,
(1.北華大學(xué)藥學(xué)院,吉林 吉林 132013;2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林 吉林 132013)
統(tǒng)計資料表明,我國目前有半數(shù)以上的人群處于經(jīng)常疲勞的狀態(tài),在城市人口中已占70%[1]。氧化應(yīng)激損傷是疲勞產(chǎn)生的主要原因之一[2-5],以保護機體氧化損傷為靶點的抗疲勞產(chǎn)品,尤其是中藥抗疲勞保健食品日益受到人們的關(guān)注。五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill)是木蘭科植物五味子的干燥成熟果實,其主要活性成分為多糖、木脂素等[6-7]。目前,關(guān)于五味子多糖具有抗疲勞及耐缺氧作用的報道較多[8-10],而五味子木脂素的相關(guān)研究較少。前期研究發(fā)現(xiàn),五味子總木脂素能顯著提高小鼠的抗疲勞能力[11-12],但其中發(fā)揮主要作用的活性成分并未知曉。五味子酯甲(schisantherin A,SCA)是五味子木脂素的主要單體化合物成分,已有研究證實SCA具有較強的抗氧化功能[13-15],但關(guān)于其抗疲勞作用的研究鮮有報道。本實驗通過觀察SCA對小鼠的抗疲勞作用及其與Nrf2/ARE抗氧化通路的相關(guān)機制,以驗證五味子總木脂素抗疲勞作用的主要活性成分,為開發(fā)輔助抗疲勞功能的藥物及保健食品提供理論依據(jù)。
ICR小鼠,雄性,體質(zhì)量(19f 2)g,吉林大學(xué)實驗動物研究中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(吉)-2016-0003。
SCA 四川省維克奇生物科技有限公司;吐溫20(分析純) 天津永大試劑公司;血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)試劑盒、乳酸(lactic acid,LA)試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒、肌酸激酶(creatine kinase,CK)試劑盒、肝糖原(liver glycogen,LG)試劑盒、肌糖原(muscle glycogen,MG)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒、8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)試劑盒 南京建成生物工程研究所;HCl-Tris、過硫酸銨、30%丙烯酰胺、甘氨酸、四甲基乙二胺 北京鼎國試劑公司;脫脂奶粉 美國BD公司;Keap1、Nrf2、HO-1 武漢ABclone公司;電化學(xué)發(fā)光(electro-chemiluminescence,ECL)顯色液 美國Vazyme公司。
Western blot凝膠電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀 美國Bio-Rad 公司;全自動多色熒光及化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) 北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司;infinite M200全自動酶標(biāo)儀 瑞士TECAN集團。
1.3.1 動物分組及給藥
將120 只ICR小鼠隨機分為4 組:CON組:蒸餾水灌胃及靜坐實驗;MOD組:蒸餾水灌胃及負(fù)重游泳訓(xùn)練;SCA(C)組:SCA(2.5 mg/kg)灌胃及靜坐實驗; SCA(M)組:SCA(2.5 mg/kg)灌胃及負(fù)重游泳訓(xùn)練。各組小鼠每天給藥1 次(0.1 mL/10 g)。
1.3.2 動物造模方案
靜坐實驗,不施加其他外界刺激干擾,不進行運動訓(xùn)練,保持小鼠正常活動狀態(tài)。負(fù)重游泳訓(xùn)練,將小鼠置于(15f 2)℃、水面高度20 cm的塑料容器中,第一天30 min,第二天45 min,然后,每天60 min,每周訓(xùn)練5 d。游泳訓(xùn)練第2~6周每天保持1 h,負(fù)重為體質(zhì)量的10%。每周稱量體質(zhì)量,并且相應(yīng)地增加負(fù)荷。
1.3.3 小鼠負(fù)重游泳實驗
在末次給予藥物30 min之后,進行負(fù)重游泳實驗(方法同1.3.2節(jié)),至小鼠沉于水面下10 s后不能浮出水面的時間作為力竭游泳時間[16]。
1.3.4 小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒實驗
在末次給予藥物30 min之后,進行疲勞轉(zhuǎn)棒實驗(轉(zhuǎn)速30 r/min)。正式實驗前進行適應(yīng)性訓(xùn)練3 次,開始記錄小鼠由于肌肉疲勞產(chǎn)生后,從轉(zhuǎn)棒上跌下的時間[17]。
1.3.5 SCA對小鼠體內(nèi)疲勞相關(guān)生化指標(biāo)的測定
在末次給予藥物30 min之后,小鼠不負(fù)重游泳60 min(溫度(15f 2)℃),休息60 min后進行摘眼球取血,制備血清。采血后即刻取小鼠的肝臟,用生理鹽水漂洗后濾紙吸干,備用。檢測血清中BUN、LA、LDH、CK的水平以及肝臟、肌肉中LG、MG的含量。
1.3.6 SCA對小鼠體內(nèi)氧化相關(guān)生化指標(biāo)的測定
取1.3.5節(jié)中制備的血清,按照試劑盒提供的方法檢測MDA、8-OHdG水平和SOD、GSH-Px活力。
1.3.7 Western blot法檢測血清中Keap1、Nrf2及HO-1的表達(dá)情況
在末次給予藥物30 min之后,小鼠不負(fù)重游泳60 min(溫度(15f 2)℃),休息60 min后,每組取3 只小鼠肝組織,冰上加入裂解液裂解1 h,離心后取上清液。測定肝組織蛋白濃度(二喹啉甲酸法[18]),十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離Keap1、Nrf2、HO-1蛋白。電轉(zhuǎn)移至偏聚氟乙烯膜(2 h),封閉1 h(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉的TBST緩沖液)。室溫孵育后棄去封閉液,分別加入一抗Keap1(1∶1 000)、Nrf2(1∶1 000)、HO-1(1∶1 000),4 ℃溫育過夜后使用TBST洗5 次,每次5 min。二抗(1∶2 000)室溫溫育1 h,TBST洗5 次,每次5 min,ECL顯影液顯色。
負(fù)重游泳實驗結(jié)果顯示(圖1A),與CON組相比,MOD組小鼠負(fù)重游泳時間極顯著縮短(P<0.01),SCA(C)組小鼠負(fù)重游泳時間顯著延長(P<0.05);與MOD比較,SCA(M)組小鼠負(fù)重游泳時間顯著延長(P<0.05)。如圖1B所示,轉(zhuǎn)棒實驗中,與CON組相比,MOD轉(zhuǎn)棒時間極顯著縮短(P<0.01),SCA(C)組小鼠轉(zhuǎn)棒時間顯著延長(P<0.05),與MOD組比較, SCA(M)組小鼠轉(zhuǎn)棒時間顯著延長(P<0.05)。
圖 1 負(fù)重游泳實驗(A)和轉(zhuǎn)棒實驗(B)觀察SCA對小鼠運動耐力的影響(n= 15)Fig. 1 Effect of SCA on exercise endurance in mice by weight-bearing swimming test (A) and rotarod test (B) (n = 15)
圖 2 SCA對疲勞小鼠血清中BUN(A)、LA(B)、LDH(C)、CK(D)水平的影響(n= 15)Fig. 2 Effect of SCA on the levels of BUN (A), LA (B), LDH (C) and CK (D) in serum of fatigue mice (n =15)
小鼠血清中B U N 濃度結(jié)果顯示(圖2 A),與CON組相比,MOD組小鼠血清BUN濃度極顯著增加 (P<0.01),SCA(C)組小鼠血清BUN濃度顯著降低(P<0.05);與MOD組相比,SCA(M)組小鼠血清BUN濃度顯著降低(P<0.05)。對各組小鼠血清LA濃度檢測結(jié)果顯示(圖2B),與CON組相比,MOD組小鼠血清中LA濃度顯著增加(P<0.05),SCA(C)組小鼠血清LA濃度降低,無統(tǒng)計學(xué)差異;與MOD組相比,SCA(M)組小鼠血清LA濃度極顯著下降(P<0.01)。對各組小鼠血清LDH活力檢測結(jié)果顯示(圖2C),與CON組相比,MOD組小鼠血清中LDH活力顯著升高 (P<0.05),SCA(C)組小鼠血清LDH活力降低,但無統(tǒng)計學(xué)差異;與MOD組相比,SCA(M)組小鼠血清LDH活力顯著下降(P<0.05)。對各組小鼠血清CK活力檢測結(jié)果顯示(圖2D),與CON組相比,MOD組小鼠血清CK活力升高(P<0.05),SCA(C)組小鼠血清CK活力極顯著降低(P<0.01);與MOD組相比, SCA(M)組小鼠血清CK活力顯著降低(P<0.05)。
圖 3 SCA對疲勞小鼠肝組織及肌肉組織中LG(A)及 MG(B)含量的影響(n= 15)Fig. 3 Effect of SCA on the contents of LG (A) and MG (B) in liver and muscle tissues of fatigue mice (n = 15)
由圖3A可知,與CON組相比,MOD組小鼠LG含量顯著降低(P<0.05),SCA(C)組小鼠LG含量極顯著升高(P<0.01);與MOD組相比,SCA(M)組小鼠LG含量極顯著升高(P<0.01)。對肌肉組織中MG含量檢測結(jié)果顯示(圖3B),與CON組相比,MOD組小鼠MG含量顯著降低(P<0.05),SCA(C)組小鼠MG含量無統(tǒng)計學(xué)差異;與MOD組相比,SCA(M)組小鼠MG含量顯著升高(P<0.05)。
圖 4 SCA對疲勞小鼠血清中SOD(A)、MDA(B)、GSH-Px(C)、8-OHdG(D)水平的影響(n=15)Fig. 4 Effect of SCA on the levels of SOD (A), MDA (B), GSH-Px (C), and 8-OHdG (D) in serum of fatigue mice (n = 15)
由圖4A可知,與CON組相比,MOD組小鼠血清中SOD活力極顯著下降(P<0.01),SCA(C)組小鼠血清中SOD活力升高,但無統(tǒng)計學(xué)差異;與MOD組相比,SCA(M)組小鼠血清中SOD活力極顯著升高 (P<0.01)。各組小鼠血清中MDA濃度檢測結(jié)果顯示(圖4B),與CON相比,MOD組小鼠血清中MDA濃度極顯著升高(P<0.01),SCA(C)組小鼠血清中MDA濃度降低,無統(tǒng)計學(xué)差異;與MOD組相比,SCA(M) 組小鼠血清中MDA濃度顯著降低(P<0.05)。各組小鼠血清中GSH-Px活力檢測結(jié)果顯示(圖4C),與CON組相比,MOD組小鼠血清中GSH-Px活力降低,但無統(tǒng)計學(xué)差異,SCA(C)組小鼠血清中GSH-Px活力顯著升高(P<0.05);與MOD組相比,SCA(M)組小鼠血清中GSH-Px活力顯著升高(P<0.05)。各組小鼠血清中8-OHdG質(zhì)量濃度檢測結(jié)果顯示(圖4D),與CON組相比,MOD組小鼠血清中8-OHdG質(zhì)量濃度顯著升高 (P<0.05),SCA(C)組小鼠血清中8-OHdG質(zhì)量濃度顯著降低(P<0.05);與MOD組相比,SCA(M)組小鼠血清中8-OHdG質(zhì)量濃度顯著降低(P<0.05)。上述結(jié)果提示SCA可能通過提高小鼠機體的抗氧化能力而發(fā)揮抗疲勞作用。
圖 5 SCA對疲勞小鼠肝組織中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的 影響(n= 3)Fig. 5 Effect of SCA on the expression of Keap1, Nrf2 and HO-1 proteins in liver tissue of fatigue mice (n = 3)
本研究應(yīng)用Western blot方法從蛋白水平觀察各組小鼠Keap1、Nrf2、HO-1的表達(dá)情況。Western blot結(jié)果如圖5所示,與CON組相比,MOD組小鼠肝組織Keap1蛋白表達(dá)水平上升,Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平極顯著下降(P<0.01);SCA(C)組小鼠Keap1蛋白表達(dá)水平極顯著下降(P<0.01),Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平極顯著上升(P<0.01);與MOD組相比,SCA(M)組Keap1蛋白表達(dá)水平極顯著下降(P<0.01),Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平極顯著上升(P<0.01)。進一步驗證了SCA有可能通過影響Keap1/Nrf2/ARE信號通路中Keap1、Nrf2、HO-1表達(dá)而發(fā)揮相關(guān)作用。
運動耐力是評價受試動物疲勞程度的重要指標(biāo)[19-20]。本研究應(yīng)用負(fù)重游泳及疲勞轉(zhuǎn)棒實驗兩種方法觀察SCA對小鼠運動耐力的影響。實驗設(shè)立慢性疲勞模型SCA給藥組,即SCA(M)組,通過持續(xù)28 d的冷水負(fù)重游泳訓(xùn)練致小鼠慢性疲勞,用以對照觀察SCA給藥對小鼠慢性疲勞的影響;此外,本實驗另設(shè)SCA未訓(xùn)練鼠給藥組即SCA(C)組,旨在觀察SCA對急性運動疲勞小鼠運動耐力的影響。實驗結(jié)果顯示,無論在負(fù)重游泳實驗還是疲勞轉(zhuǎn)棒實驗中,SCA(M)及SCA(C)組小鼠均表現(xiàn)出明顯的機體抗疲勞作用,提示SCA能夠提高慢性疲勞及急性疲勞小鼠的運動耐力。
BUN的濃度反映了蛋白質(zhì)分解代謝和身體對運動的耐受性,在劇烈運動的過程中,有氧能量供應(yīng)變?yōu)榧∪庵械臒o氧糖酵解,肌糖原被迅速消耗,產(chǎn)生大量的LA。LA在肌肉和血液中的累積會導(dǎo)致肌肉疲勞,而血清中LDH、CK的水平反映機體運動肌肉損傷的程度。MG在運動中直接提供能量,LG儲備能量,它們的氧化產(chǎn)物是運動能量的主要來源[21]。本研究結(jié)果顯示,SCA(M)組小鼠(與MOD組比較)及SCA(C)組小鼠(與CON組比較)血清BUN、LA、LDH及CK的水平均明顯降低,而肝糖原、肌糖原的濃度明顯增加。血清中LDH和CK的水平顯著降低,表明可能是由于SCA在強烈運動期間保護細(xì)胞免受損傷,且SCA加快了乳酸的分解,降低BUN濃度,延緩了疲勞的發(fā)生。MG與LG的含量增加為運動提供了更多的能量。進一步證實SCA具有抗疲勞作用。
小鼠的劇烈運動加速自由基的產(chǎn)生,并誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷[22-24]。SOD是最主要的抗氧化酶,在機體氧化與抗氧化平衡中起重要的作用;MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,是反應(yīng)自由基所致的機體損傷的重要指標(biāo),其在血清中的含量隨著機體的疲勞累積而升高;GSH-Px作為機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶,能夠催化GSH變?yōu)镚SSG,還原有毒的過氧化物變?yōu)闊o毒的羥基化合物,進而保護細(xì)胞不受過氧化物的損傷;8-OHdG可以反映機體細(xì)胞DNA氧化損傷的程度,該值越高提示DNA氧化損傷越嚴(yán)重[25-27]。本實驗結(jié)果顯示,SCA可以提高疲勞小鼠血清中SOD、GSH-Px的活力,降低MDA、8-OHdG水平,提示SCA在慢性疲勞小鼠及急性疲勞小鼠中都表現(xiàn)出顯著的抗氧化作用,該結(jié)果與其他研究酯甲抗氧化功能的結(jié)果[28]是一致的。
Nrf2/ARE信號通路是參與機體抗氧化反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)通路,Nrf2是細(xì)胞氧化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[29]。據(jù)報道,Nrf2缺陷小鼠表現(xiàn)出對肝臟組織中氧化應(yīng)激的極端易感性,通過改善體內(nèi)Nrf2的活性,可以有效地對抗氧化應(yīng)激損傷,進而減輕疲勞[30-31]。Keap1是Nrf2負(fù)調(diào)控因子,其自身的泛素化、磷酸化以及核穿梭機制都能影響Nrf2的活力[32]。HO-1是體內(nèi)較強的抗氧化劑,受Nrf2調(diào)控[33-34]。 本研究顯示SCA能夠下調(diào)慢性疲勞小鼠肝臟組織中Keap1蛋白的表達(dá),并上調(diào)Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá),提示SCA可能通過調(diào)節(jié)Nrf2/ARE信號通路減輕氧化應(yīng)激以產(chǎn)生抗疲勞作用。后續(xù)研究將繼續(xù)探討SCA對肝臟以外其他組織中Nrf2/ARE信號通路的影響,以進一步探明SCA抗疲勞作用機制。
綜上,SCA對小鼠具有顯著的抗疲勞作用。該作用可能與其提高小鼠能量儲備、抗氧化能力及調(diào)節(jié)肝臟Nrf2/ARE抗氧化通路有關(guān)。