脫脂米糠可溶性膳食纖維對小腸葡萄糖吸收和轉運的影響及其作用機制

丁曉萌，侯坤友，胡曉祎，賈夢云，謝建華，陳 奕，余 強

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

糖尿病尤其是2型糖尿病（type-2 diabetes mellitus，T2DM）作為一種常見病，其發(fā)病率正隨著人們生活質量的提高和生活方式的改變逐年增加，且患者趨于年 輕化[1]。飲食攝入的碳水化合物經過人體腸道中的淀粉酶和葡萄糖苷酶的催化水解后，釋放出的單糖最終被小腸上皮細胞吸收并進入血液循環(huán)。研究證明，餐后高血糖水平與心肌血容量和血流量下降、視網膜病變等大血管疾病有關[2]，對于T2DM患者，其危害遠大于空腹血糖水平。所以控制餐后血糖水平，可以有效預防糖尿病及其他并發(fā)癥的發(fā)生。

高纖維飲食或使用膳食纖維補充劑對健康有很多益處[3-4]。膳食纖維的眾多活性功能之一是能夠降低高糖食物攝入后人體對葡萄糖的吸收率，從而導致血糖反應曲線變鈍，對胰島素的需求減少[5]。根據(jù)膳食纖維在水中的溶解度，可將其分為不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）和水溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）。SDF由天然形成凝膠或黏性的纖維組成，如半纖維素、海藻多糖、瓜爾膠、果膠等[6]。目前，許多研究探討了SDF降低餐后血糖的機制，如減緩胃排空[7]；促進胰島素分泌、拮抗胰高血糖素[8]；抑制淀粉水解[9-10]；抑制小腸葡萄糖的吸收[11]等。曹龍奎等[12]研究發(fā)現(xiàn)，經超 聲-微波協(xié)同法改性的小米糠膳食纖維可以在體外抑制α-葡萄糖苷酶活性。但可溶性膳食纖維在小腸內抑制葡萄糖吸收和跨膜轉運的具體分子機制報道較少。

米糠是稻米加工的主要副產品之一，每年我國有 1 000多萬t米糠未被開發(fā)利用。脫脂米糠是米糠榨油后的殘留物，含有膳食纖維、礦物質等多種營養(yǎng)物質[13]。本課題組使用綠色木霉發(fā)酵法提取脫脂米糠中可溶性膳食纖維，發(fā)酵后米糠可溶性膳食纖維相較于發(fā)酵前，其微觀結構、持水力、持油力和對膽固醇的吸附能力均有明顯改善[14]。本實驗利用Caco-2細胞分別建立腸道葡萄糖吸收和轉運模型[15-16]，研究綠色木霉發(fā)酵法制備脫脂米糠可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber from defatted rice bran，DRB-SDF）對小腸葡萄糖吸收和轉運的影響，及其對吸收和轉運過程中主要載體和相關酶類mRNA表達的影響，從分子水平初步探究DRB-SDF降低餐后血糖的作用機制，為降糖功能食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂米糠購自江西省天玉油脂有限公司；Caco-2細胞購自中國科學院細胞庫。

DMEM高糖培養(yǎng)基（葡萄糖濃度25 mmol/L）、DMEM低糖培養(yǎng)基（葡萄糖濃度4 mmol/L）、L-谷氨酰胺、胰蛋白酶-EDTA消化液、阿卡波糖、D-(＋)-麥芽糖、α-葡萄糖苷酶活性檢測試劑盒、葡萄糖檢測試劑盒、非必需氨基酸 北京索萊寶公司；Transwell培養(yǎng)板（24 孔，孔徑3.0 μm） 美國康寧公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 以色列BI公司；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量預混試劑 天根生化科技有限公司；引物均由華大基因公司設計合成；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國Life Technologies公司；超凈工作臺 吳江市凈化設備總廠；二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；冷凍離心機 德國Sigma公司；倒置顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 綠色木霉發(fā)酵法提取DRB-SDF

參照Jia Mengyun等[14]的方法，對粉碎過篩后的脫脂米糠進行綠色木霉發(fā)酵處理（發(fā)酵條件為綠色木霉接種量100 mL/L、發(fā)酵時間41 h、發(fā)酵pH 5.8、發(fā)酵溫度28 ℃）后提取SDF，即獲得DRB-SDF。

1.3.2 Caco-2細胞培養(yǎng)

用含16%（體積分數(shù)，下同）胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)Caco-2細胞，將細胞接種于培養(yǎng)瓶中后，放置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2、相對濕度95%）。本研究所用細胞傳代數(shù)在30～40之間。每隔2 d更換細胞培養(yǎng)液。

1.3.3 細胞毒性檢測

取處于對數(shù)生長期Caco-2細胞，調節(jié)細胞密度為5h 105個/mL，以每孔100 μL接種于96 孔板，置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2、相對濕度95%）培養(yǎng)。細胞貼壁后，吸去舊培養(yǎng)基，每孔添加100 μL含有不同質量濃度（1、2、4、8、16 mg/mL）DRB-SDF的DMEM高糖培養(yǎng)基，陽性組加入含25 μg/mL阿卡波糖的DMEM高糖培養(yǎng)基，正常組僅使用100 μL DMEM高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)2 h后，用10 μL CCK-8溶液處理細胞，然后使用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度。正常組細胞活力記為100%。

1.3.4 葡萄糖吸收模型的建立

調節(jié)Caco-2細胞密度為1.5h 105個/mL，接種于6 孔板，置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2、相對濕度95%）中培養(yǎng)7 d。每隔2 d更換培養(yǎng)液。第7天吸去舊培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗兩遍。實驗以28 mmol/L麥芽糖作為底物，正常組每孔加入800 μL底物和200 μL DMEM低糖培養(yǎng)基；陽性對照組25 μg/mL阿卡波糖溶液，使其終質量濃度為25 μg/mL；實驗組每孔加入800 μL底物和200 μL DRB-SDF溶液，使DRB-SDF溶液終質量濃度分別為2、4、8 mg/mL（低、中、高劑量組）。放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于加藥后30、60、120 min裂解細胞，離心后取上清液，采用氧化酶-偶聯(lián)比色法檢測葡萄糖的含量。

1.3.5 葡萄糖轉運模型的建立

調整Caco-2細胞懸液濃度至1.5h 105個/mL。按照每孔200 μL接種于Transwell 24 孔培養(yǎng)板上室，下室加900 μL培養(yǎng)基。前8 d，每2 d更換一次培養(yǎng)基，之后每天更換培養(yǎng)基，并不定時進行觀察。待細胞生長至18～21 d使用細胞電阻儀測量跨膜電阻值，大于300 Ωg cm2即為合格。

評估合格的Caco-2細胞單層模型，吸盡培養(yǎng)基后，用PBS清洗2 遍。上室分別加入含0、2、4、8 mg/mL DRB-SDF和25 μg/mL阿卡波糖的DMEM高糖培養(yǎng)基溶液，下室加入900 μL PBS作為接收液。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別于給藥30、60、120 min后吸取下室液體適量，采用氧化酶-偶聯(lián)比色法檢測葡萄糖的含量。

1.3.6α-葡萄糖苷酶活力測定

依據(jù)1.3.4節(jié)所述建立葡萄糖吸收模型，放置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2、相對濕度95%）中培養(yǎng)，孵育120 min后根據(jù)α-葡萄糖苷酶活性檢測試劑盒說明書提供的方法檢測Caco-2細胞α-葡萄糖苷酶活力。

1.3.7 逆轉錄qPCR分析

調節(jié)Caco-2細胞密度為1.5h 105個/mL，接種于6 孔板，置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2、相對濕度95%）中培養(yǎng)。待細胞匯合度達80%左右，吸去舊培養(yǎng)基，PBS清洗2 遍后，分別加入含0、2、4、8 mg/mL DRB-SDF和25 μg/mL阿卡波糖的DMEM高糖培養(yǎng)基。參照TRIzol提取法的詳細說明提取總RNA并定量，瓊脂糖凝膠電泳對總RNA質量進行檢測后，用cDNA逆轉錄試劑盒逆轉錄反合成cDNA，隨后進行PCR分析，反應體系為20 μL。反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，59.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40 次。表1為引物序列，根據(jù)熔解曲線判斷引物特異性。以GADPH基因作為內參，用2－ΔΔCt法計算各組基因的相對表達，△△Ct按下式計算。

表 1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結果與分析

2.1 細胞活力測定結果

圖 1 DRB-SDF對Caco-2細胞活力的影響（n＝3）Fig. 1 Effect of DRB-SDF on Caco-2 cell viability (n = 3)

如圖1所示，DRB-SDF在質量濃度為1～16 mg/mL 時，對Caco-2細胞并未產生毒性作用。相反，隨著DRB-SDF質量濃度的增加，細胞活力略微上升，當質量濃度為16 mg/mL時，相比于正常組細胞活力有顯著 上升（P＜0.05）。故選用質量濃度為2、4、8 mg/mL的DRB-SDF進行進一步研究。

2.2 DRB-SDF對Caco-2細胞葡萄糖吸收的影響

圖 2 DRB-SDF對Caco-2細胞葡萄糖吸收的影響（n＝3）Fig. 2 Effect of DRB-SDF on glucose uptake in Caco-2 cells (n = 3)

從圖2可以看出，Caco-2細胞內葡萄糖濃度隨著時間延長而增加，而DRB-SDF能在一定程度上抑制Caco-2細胞對葡萄糖的吸收。在加入DRB-SDF 30、60、120 min后，相比于正常組，Caco-2細胞內葡萄糖濃度均降低且具有濃度依賴性。DRB-SDF作用30 min后，高劑量組（8 mg/mL）與正常組相比葡萄糖吸收有顯著下降 （P＜0.05）；DRB-SDF作用60 min后，低劑量組 （2 mg/mL）葡萄糖吸收量略有降低，中、高（4、 8 mg/mL）劑量組分別顯著（P＜0.05）和極顯著 （P＜0.01）下降，并且作用效果比陽性組更明顯；DRB-SDF 作用120 min后，與正常組相比，低劑量組Caco-2細胞內部葡萄糖濃度顯著降低（P＜0.05），當DRB-SDF質量濃度為4 mg/mL和8 mg/mL時有極顯著下降（P＜0.01）。

2.3 DRB-SDF對Caco-2細胞葡萄糖轉運的影響

圖 3 DRB-SDF對Caco-2細胞葡萄糖跨膜轉運的影響（n＝3）Fig. 3 Effect of DRB-SDF on glucose transport in Caco-2 cells (n = 3)

從圖3可以看出，DRB-SDF對葡萄糖在Caco-2細胞的跨膜轉運有一定的抑制作用。DRB-SDF作用30 min后，相比于正常組，實驗組的葡萄糖跨膜轉運均被抑制，且呈濃度依賴性，中、高劑量組分別有顯著性（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）差異；DRB-SDF作用60 min后，與正常組相比，實驗組葡萄糖跨膜轉運均有極顯著下降（P＜0.01）；DRB-SDF作用120 min后，DRB-SDF對葡萄糖跨膜轉運略有抑制，當DRB-SDF質量濃度為 8 m g/m L 時，葡萄糖跨膜轉運相比于正常組顯著 降低（P＜0.05）。

2.4 DRB-SDF對Caco-2細胞α-葡萄糖苷酶活性的影響

圖 4 DRB-SDF對Caco-2細胞α-葡萄糖苷酶活力（a）及其 mRNA表達（b）的影響（n＝ 3）Fig. 4 Effect of DRB-SDF on α-glucosidase activity (a) and the mRNA expression of α-glucosidase (b) in Caco-2 cells (n = 3)

機體攝入的碳水化合物必須經過人體腸道中的淀粉酶和α-葡萄糖苷酶催化水解成單糖，才能被小腸上皮細胞吸收從而進入血液[17]。因此α-葡萄糖苷酶是通過控制小腸吸收葡萄糖調節(jié)餐后血糖的關鍵。如圖4a所示，DRB-SDF可以濃度依賴性地抑制Caco-2細胞內α-葡萄糖苷酶活力，中、高劑量組酶活力相較于正常組分別被顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）抑制。Caco-2細胞內α-葡萄糖苷酶mRNA情況如圖4b所示，相比于正常組，DRB-SDF可下調Caco-2細胞α-葡萄糖苷酶mRNA的相對表達量，且這種抑制作用呈濃度依賴性，中、高劑量組均有顯著性下降（P＜0.05）。當DRB-SDF質量濃度為8 mg/mL時，其對于Caco-2細胞內α-葡萄糖苷酶活力及其mRNA相對表達量的抑制作用甚至優(yōu)于阿卡波糖組。

2.5 DRB-SDF對Caco-2細胞轉運酶系SGLT-1、GLUT-2 mRNA表達的影響

圖 5 DRB-SDF對Caco-2細胞對SGLT-1（a）、GLUT-2（b） mRNA的表達影響（n＝3）Fig. 5 Effect of DRB-SDF on the mRNA expression of SGLT-1 (a) and GLUT-2 (b) in Caco-2 cells (n = 3)

葡萄糖轉運載體是小腸上皮細胞轉運葡萄糖的關鍵蛋白，其中位于刷狀緣的SGLT-1和位于基底膜的GLUT-2在葡萄糖跨膜轉運中發(fā)揮中重要作用。如圖5所示，不同質量濃度DRB-SDF作用后，Caco-2細胞內SGLT-1、GLUT-2mRNA相對表達水平被明顯下調。隨著DRB-SDF 質量濃度的增加，SGLT-1、GLUT-2mRNA相對表達量也逐漸降低。相較于正常組，低劑量組SGLT-1、GLUT-2mRNA相對表達量略有降低，但不顯著，中、高劑量組均表現(xiàn)出統(tǒng)計學顯著性（P＜0.05）或極顯著性（P＜0.01）差異。

2.6 DRB-SDF對Caco-2細胞Na＋-K＋-ATP酶mRNA表達的影響

圖 6 DRB-SDF對Caco-2細胞對Na-K-ATP酶mRNA表達的影響（n＝3）Fig. 6 Effect of DRB-SDF on the mRNA expression of Na+-K+-ATPase in Caco-2 cells (n = 3)

葡萄糖在葡萄糖轉運載體蛋白SGLT-1的協(xié)助下進入小腸上皮細胞的過程屬于主動運輸，需要Na＋-K＋-ATP酶提供能量。由圖6可知，DRB-SDF可以顯著抑制Caco-2細胞內Na＋-K＋-ATP酶mRNA相對表達水平（P＜0.05），并具有濃度依賴性。當DRB-SDF質量濃度為4、8 mg/mL時，Caco-2細胞內Na＋-K＋-ATP酶mRNA相對表達量比阿卡波糖組更低。

3 討 論

流行病學研究顯示，膳食纖維的攝入可以有效降低T2DM的發(fā)生風險，幫助糖尿病人調控餐后血糖水平[5]。歐洲食品安全局表明，谷物來源的膳食纖維相比其他來源能更有效地控制血糖[18]。本實驗通過體外培養(yǎng)Caco-2細胞，分別建立葡萄糖吸收和轉運模型，并預設麥芽糖濃度28 mmol/L或葡萄糖濃度為25 mmol/L模擬餐后高血糖濃度。實驗結果表明，在一定質量濃度DRB-SDF的干預下，葡萄糖在Caco-2細胞中的吸收及轉運均被抑制。在葡萄糖吸收模型中，DRB-SDF質量濃度越高，葡萄糖吸收抑制效果越好，當DRB-SDF質量濃度增至 8 mg/mL時，抑制作用非常顯著，且接近甚至優(yōu)于阿卡波糖。分析抑制作用呈濃度依賴性可能的原因是，DRB-SDF 作為一種多糖，本質上具有與單糖相似的結構，能競爭Caco-2細胞上葡萄糖吸收位點[19]，從而延緩葡萄糖吸收。在葡萄糖轉運模型中，DRB-SDF作用的前中期，其對葡萄糖跨膜轉運的抑制作用非常顯著，但當作用時間達到120 min后，高濃度組抑制效果并不顯著，其可能原因是作用時間越長，高濃度DRB-SDF導致Caco-2細胞的增殖，參與轉運的細胞數(shù)量也隨之增多。根據(jù)以上結果可知，DRB-SDF可以抑制小腸對于葡萄糖的吸收和跨膜轉運，并可能進一步控制餐后高血糖水平。

α-葡萄糖苷酶廣泛分布于小腸絨毛黏膜細胞的刷狀緣中，其中包括麥芽糖酶、乳糖酶、蔗糖酶等多種與腸道糖代謝相關酶類，可以將機體攝入的碳水化合物消化水解形成單糖[20]。其參與機體糖代謝的具體過程為：食物中的碳水化合物經口腔或胃腸道中一系列淀粉酶等消化水解，形成低聚糖，隨后α-葡萄糖苷酶作用于非還原末端α-1,4-糖苷鍵使其斷裂，將低聚糖水解成葡萄糖等能被小腸上皮細胞直接吸收的單糖。近年來，很多研究表明，降低腸道中α-葡萄糖苷酶的活性可有效控制小腸上皮細胞對葡萄糖的吸收，從而降低餐后血糖緩解糖尿病。目前，臨床上使用最廣泛的3 種α-葡萄糖苷酶抑制劑（阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇）均是從微生物代謝產物中提取的，但由于微生物的不穩(wěn)定性，從天然產物中提取或通過化學合成的方式獲得穩(wěn)定、高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑成為一種趨勢。聶昌平等[21]發(fā)現(xiàn)獼猴桃根石油醚提取物可有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，并且在最大考察濃度下效果優(yōu)于同濃度阿卡波糖。吳慧平等[22]研究表明，夏枯草提取物可以通過抑制α-葡萄糖苷酶活性降低四氧嘧啶糖尿病模型大鼠的餐后血糖水平，并且在長期給藥情況下，可能抑制α-葡萄糖苷酶等葡萄糖吸收相關基因的表達。本實驗結果證明，DRB-SDF可在一定程度上下調Caco-2細胞α-葡萄糖苷酶mRNA相對表達水平，抑制腸道內α-葡萄糖苷酶活性，延緩碳水化合物在腸道內的降解。

葡萄糖作為極性分子無法自由進出細胞，因此葡萄糖透過腸壁進入血液必須依靠小腸上皮細胞上的葡萄糖轉運載體發(fā)揮作用。該轉運過程由兩個家族的跨膜轉運載體蛋白：Na＋-葡萄糖共轉運載體系統(tǒng)（sodium/glucose cotransporters，SGLTs）和葡萄糖協(xié)助擴散轉運載體系統(tǒng)（facilitative glucose transporters，GLUTs）來完成[23-24]。 其中位于刷狀緣SGLT-1在細胞膜Na＋-K＋-ATP酶的作用下逆濃度梯度偶聯(lián)Na＋主動轉運葡萄糖，同時消耗 能量[25]；位于基底膜的GLUT-2順葡萄糖濃度梯度，把腸黏膜細胞內聚集葡萄糖協(xié)助轉運到組織間隙液，進而葡萄糖進入血液，其轉運過程不消耗能量[26]。所以，碳水化合物經腸道消化水解后，單糖吸收和轉運過程與SGLT-1、 GLUT-2和Na＋-K＋-ATP酶3 種蛋白密切相關。本研究利用不同質量濃度DRB-SDF干預Caco-2細胞，運用逆轉錄qPCR分別檢測SGLT-1、GLUT-2和Na＋-K＋-ATP酶mRNA的表達。實驗結果表明，DRB-SDF可明顯降低SGLT-1、GLUT-2和Na＋-K＋-ATP酶mRNA表達水平，并具有濃度依賴性，這一結果與DRB-SDF對小腸中葡萄糖吸收和轉運抑制作用一致。由此可知，DRB-SDF可能通過下調小腸上皮細胞轉運載體蛋白的表達，延緩葡萄糖從小腸進入血液的過程，從而降低餐后高血糖水平。同時Syafril[27]、álvarez-Cilleros[28]及Ong[29]等研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖協(xié)助擴散轉運酶與PI3K信號通路有關，而該通路與胰島素分泌相關，所以DRB-SDF是否能通過PI3K信號通路調控胰島素分泌降低餐后血糖水平有待進一步研究。

阿卡波糖屬α-葡萄糖苷酶抑制劑，但近年來也有少數(shù)文獻報道過其對SGLT-1、GLUT-2和Na＋-K＋-ATP酶基因的影響。吳慧平等[22]研究指出，阿卡波糖對于SGLT-1、 GLUT-2和Na＋-K＋-ATP酶mRNA表達有明顯的抑制效果。同時馬麗娜等[30]發(fā)現(xiàn)阿卡波糖對2型糖尿病大鼠腸道SGLT1受體的表達有一定的影響。本實驗中阿卡波糖對于SGLT-1、GLUT-2和Na＋-K＋-ATP酶mRNA表達的抑制作用也為阿卡波糖降糖作用的研究提供了新的思路，但有待于進一步的實驗驗證。

綜上所述，綠色木霉發(fā)酵法制備的脫脂米糠可溶性膳食纖維可能通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性，延緩碳水化合物降解成葡萄糖；同時DRB-SDF可抑制小腸上皮細胞葡萄糖轉運蛋白SGLT-1、GLUT-2和Na＋-K＋-ATP酶的活性、占據(jù)葡萄糖的吸收位點，延緩腸道葡萄糖的吸收和跨膜轉運，最終達到降低餐后血糖水平的目的。本實驗結果可為進一步研究膳食纖維降血糖機制及降糖功能食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。