巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠T細(xì)胞亞群及其 血液免疫相關(guān)因子的影響

崔東影，席恩澤，徐境含，盛 雪，李夢寒，劉 洋，吳禹昊，許曉曦

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

目前，由于我國母乳數(shù)據(jù)庫還不完善，嬰兒配方乳粉雖在營養(yǎng)成分上接近母乳，但免疫活性方面無法達(dá)到母乳水平[1]，因而最大程度地保持免疫蛋白在嬰兒配方食品中的生物活性功效成為乳品生產(chǎn)行業(yè)的關(guān)鍵技術(shù)[2]。強(qiáng)度高于巴氏殺菌的熱處理工藝技術(shù)會引起牛乳感官品質(zhì)下降和營養(yǎng)成分的損失[3-4]，不僅降低了乳品質(zhì)量，也可能會由于一些有害物質(zhì)的產(chǎn)生導(dǎo)致產(chǎn)品不安全[5-6]。已有的嬰兒配方乳粉為安全性考慮均采用高溫殺菌，造成了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變[7]，一定程度上誘導(dǎo)了美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物的形成，降低了嬰幼兒配方食品的消化吸收率[8]，由于蛋白質(zhì)參與礦物質(zhì)吸收，熱損傷的蛋白質(zhì)可能會影響金屬離子的生物利用度[9]。有資料顯示，嬰幼兒乳粉在沖調(diào)過程中容易產(chǎn)生微生物污染的風(fēng)險，尤其是阪崎腸桿菌對早產(chǎn)兒和低體質(zhì)量兒會造成極大的危害[10]。嬰兒配方乳作為一種乳基液態(tài)配方食品，和其他嬰兒配方食品相比，具有安全、營養(yǎng)、哺喂方便等特點[11]。與市面現(xiàn)有的經(jīng)超高溫滅菌的嬰兒配方產(chǎn)品相比，巴氏殺菌最大程度地保留了鮮牛乳及添加物質(zhì)的免疫活性和天然營養(yǎng)。目前嬰兒配方乳粉中添加的乳鐵蛋白具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗菌等生物活性[12-13]，但以往研究只停留在不同熱處理條件對其結(jié)構(gòu)影響變化階段，有學(xué)者曾將不同熱處理條件下的乳鐵蛋白及乳鐵蛋白素對脾細(xì)胞的免疫促進(jìn)作用[14]以及對癌細(xì)胞的促凋亡等功能性[15-16]進(jìn)行了探討。但至今針對乳鐵蛋白在動物及嬰兒體內(nèi)的生物活性，尤其是對免疫活性的探究仍為空白。本研究利用動物喂養(yǎng)實驗將實驗室自制巴氏殺菌嬰兒配方乳與市售常溫嬰兒配方乳產(chǎn)品進(jìn)行對比，用以探究兩類不同熱處理產(chǎn)品在大鼠生長及血液免疫指標(biāo)方面的差異性，以期為研制出適合中國嬰兒生長發(fā)育需要的嬰兒配方乳提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

S D 大鼠（雄性、4 周齡、S P F 級、體質(zhì)量90～110 g），購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2016-0006。

牛乳、脫鹽乳清粉、濃縮乳清蛋白粉 北京銀河乳業(yè)有限公司；乳糖、二十二碳六烯酸（docosahexeniic acid，DHA）、花生四烯酸（arachidonic acid，ARA） 羅蓋特生物營養(yǎng)品有限公司；低聚果糖、低聚半乳糖 保齡寶寶生物有限公司；?；撬帷⒑塑账?、左旋肉堿、肌醇、葉黃素、復(fù)配維生素、復(fù)配礦物質(zhì) 北京金康普食品科技有限公司；乳鐵蛋白、乳白蛋白 天津銀河偉業(yè)進(jìn)出口有限公司；大豆油、玉米油、葵花籽油 哈爾濱九三油脂有限公司；結(jié)構(gòu)脂肪 益海嘉里有限公司； 卡拉膠、單甘酯 連云港友進(jìn)食品添加劑技術(shù)開發(fā)有限 公司；以上材料均用于實驗室自制巴氏殺菌嬰兒配方乳。

白細(xì)胞介素-2（interleukin 2，IL-2）、IL-4、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、溶菌酶試劑盒 南京建成生物工程研究所；CD3-FITC、CD4-PE、 CD8a-PerCP單克隆抗體 杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；肝素鈉 上海惠世生化試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 北京Biotopped 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州丹瑞實驗儀器設(shè)備有限公司；JJ高壓均質(zhì)機(jī) 廊坊市盛通機(jī)械有限公司； HZ實驗型超高溫殺菌機(jī) 上海輝展實驗設(shè)備有限公司；ACS30型電子秤 浙江風(fēng)華科技有限公司； HBS-1096A酶標(biāo)分析儀 南京德鐵實驗設(shè)備有限公司；755B紫外-可見分光光度計 上海精密儀器公司；3K15高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物的處理和分組

選擇雄性S D 大鼠6 0 只，在實驗環(huán)境（室溫（21f 2）℃、室內(nèi)相對濕度（32f 2）%、自然光照）下適應(yīng)3 d，適應(yīng)期間飼喂基礎(chǔ)飼料，自由進(jìn)水，第4天早晨停止進(jìn)食，3 h后稱體質(zhì)量，按體質(zhì)量分成4 組，每組15 只，單籠飼養(yǎng)，各組間的大鼠平均體質(zhì)量無顯著差異（P＞0.05）；其中，第1組為基礎(chǔ)日糧組（對照組），第2組為市售常溫嬰兒配方乳I組（簡稱市售組I），第3組為市售常溫嬰兒配方乳II組（簡稱市售組II），第4組為巴氏殺菌嬰兒配方乳組（簡稱實驗組）。連續(xù)喂養(yǎng)4 周，記錄實驗開始第0、7、14、21、28天大鼠的體質(zhì)量。參照GB 10765ü 2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰兒配方食品》及GB 10769ü 2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒谷類輔助食品》進(jìn)行飼料配制[17]。市售組和實驗組的基礎(chǔ)用料成分無明顯差別，各組飼料制作時的配料如表1所示。

表 1 大鼠飼料的組成Table 1 Rat diet compositions%

1.3.2 大鼠T細(xì)胞亞群的測定

于實驗第0、28天，每組隨機(jī)取3 只大鼠，乙醚麻醉后心臟采血，乙二胺四乙酸抗凝，吸取100 μL外周血于EP管中，分別加入1 μL的CD3-FITC、CD4-PE、 CD8a-PerCP單克隆抗體避光染色，反應(yīng)30 min，每個樣品加入體積比1∶10的紅細(xì)胞裂解液2 mL，混勻，室溫靜置10 min后，3 000 r/min離心5 min[18]。小心棄去上清液，加入pH 7.4的2 mL PBS，洗滌2 次，棄上清液，加入400 μL PBS混勻，1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測，計算CD3＋CD4＋T細(xì)胞與CD3＋CD8＋T細(xì)胞的比值。

1.3.3 大鼠免疫因子指標(biāo)的測定

實驗開始后，在0、7、14、28 d空腹稱體質(zhì)量，乙醚麻醉后心臟取血5 mL，4 ℃靜置12 h，析出血清后，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集血清分裝于EP管中，于－20 ℃保存，根據(jù)IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、溶菌酶試劑盒說明書步驟測定相應(yīng)指標(biāo)水平。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)均使用Statistix 8軟件進(jìn)行單因素方差分析 （P＜0.05表示差異顯著），并用Origin 8.5軟件作圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠體質(zhì)量的影響

表 2 嬰兒配方乳對大鼠體質(zhì)量變化的影響Table 2 Effect of infant formula on body mass change of rats

由表2可以看出，實驗開始前各組大鼠的體質(zhì)量差異不顯著。飼喂兩周后，3 組嬰兒配方乳組與基礎(chǔ)日糧組相比差異顯著（P＜0.05）；3 周后，4 組大鼠的體質(zhì)量均有不同程度的增長，實驗組與對照組和市售組相比差異顯著（P＜0.05），飼養(yǎng)4 周后，實驗組大鼠體質(zhì)量達(dá)到最高，為189.11 g，表明巴氏殺菌嬰兒配方乳在促進(jìn)幼年機(jī)體的生長發(fā)育方面明顯優(yōu)于市售常溫嬰兒配方乳。

2.2 巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠血清細(xì)胞因子分泌水平的影響

2.2.1 巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠血清IL-2分泌水平的影響

圖 1 嬰兒配方乳對大鼠IL-2分泌水平的影響Fig. 1 Effect of infant formula on the secretion of IL-2 in rats

IL-2是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子之一，又稱為T細(xì)胞生長因子，對T細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、凋亡具有重要的意義[19]。由圖1可知，飼喂7 d時，3 組嬰兒配方乳組與基礎(chǔ)日糧組比差異顯著（P＜0.05）；實驗組和市售組II差異顯著（P＜0.05），與市售組I不顯著。隨著喂養(yǎng)時間的延長，實驗組大鼠血清中IL-2的分泌量逐漸增加，在28 d時達(dá)到最大，顯著高于其他3 組（P＜0.05）。表明實驗組與市售組相比，最大程度地保留了免疫物質(zhì)的生物活性，增加了大鼠血清中IL-2的分泌量，改善大鼠免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。

2.2.2 巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠IL-4分泌水平的影響

圖 2 嬰兒配方乳對大鼠IL-4分泌水平的影響Fig. 2 Effect of infant formula on the secretion of IL-4 in rats

IL-4主要由活化的T細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌，具有刺激B細(xì)胞生長增殖、促進(jìn)和調(diào)節(jié)免疫球蛋白E生成、促進(jìn)T細(xì)胞生長增殖、抑制Th1細(xì)胞功能等多種生物學(xué)功能，對很多炎癥反應(yīng)有促進(jìn)作用[20]。從圖2可以看出，飼養(yǎng)7 d時，實驗組和市售組I與基礎(chǔ)日糧組相比差異顯著 （P＜0.05），而這兩組之間差異不顯著。隨著飼養(yǎng)時間的延長，3 組大鼠血清IL-4質(zhì)量濃度呈降低趨勢，原因可能是IL-2分泌量的增加抑制了IL-4的分泌。飼喂14 d時4 組差異不顯著；28 d時，市售組I和實驗組與基礎(chǔ)日糧組相比差異顯著（P＜0.05），而這兩組之間差異不顯著，市售組II與實驗組差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，實驗組有降低大鼠血清中IL-4質(zhì)量濃度的趨勢，誘導(dǎo)了以Th1細(xì)胞為主導(dǎo)的免疫應(yīng)答。說明實驗組與市售組比能促進(jìn)免疫細(xì)胞對IL的合成和分泌，有效增強(qiáng)大鼠機(jī)體免疫力。

2.2.3 巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠IFN-γ分泌水平的影響

IFN-γ是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的多功能活性蛋白質(zhì)[21]，主要通過激活單核吞噬細(xì)胞來達(dá)到殺滅微生物及腫瘤細(xì)胞、激活中性粒細(xì)胞、強(qiáng)化自然殺傷細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性、促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能、抑制宿主向腫瘤細(xì)胞提供重要的營養(yǎng)因子或生長因子，從而造成腫瘤細(xì)胞的凋亡[22]。因此，本實驗通過測定大鼠血清中IFN-γ的分泌水平來對比評估巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠免疫功能的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖 3 嬰兒配方乳對大鼠IFN-γ分泌水平的影響Fig. 3 Effect of infant formula on the secretion of IFN-γ in rats

由圖3可知，在飼喂7 d和14 d時，實驗組和市售組I與基礎(chǔ)日糧組相比差異顯著（P＜0.05），市售組II與基礎(chǔ)日糧組相比差異不顯著；飼喂28 d時，實驗組大鼠IFN-γ質(zhì)量濃度達(dá)到最大，顯著高于其他3 組 （P＜0.05）。隨著飼喂時間的延長，IFN-γ質(zhì)量濃度逐漸增加，原因可能是由于IL-2分泌量的增加促進(jìn)了IFN-γ的分泌。同時也有研究證明，IFN-γ是細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的一個主要標(biāo)志，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用。IFN-γ通過促進(jìn)抗原特異性使T細(xì)胞分化成Th1細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)Th1細(xì)胞的增殖來增強(qiáng)細(xì)胞免疫活性；通過降低Th2細(xì)胞活性來發(fā)揮抑制體液免疫應(yīng)答的作用[23-24]。在本研究中，實驗組有增加大鼠血清中IFN-γ質(zhì)量濃度的趨勢（P＜0.05），說明與市售組相比，實驗組極大地保留了免疫物質(zhì)的活性，提高了大鼠的免疫防御功能。且隨著飼喂時間的延長調(diào)節(jié)作用更加明顯。

2.2.4 巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠TNF-α分泌水平的影響

TNF-α主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，某些T細(xì)胞也可分泌，其主要生物活性為直接殺傷腫瘤細(xì)胞，亦可促進(jìn)B細(xì)胞的增殖，在許多重要的活性代謝組織如脂肪組織、肝臟和骨骼肌細(xì)胞上均有TNF-α的特異性受體[25]。

圖 4 嬰兒配方乳對大鼠TNF-α分泌水平的影響Fig. 4 Effect of infant formula on the secretion of TNF-α in rats

由圖4可知，實驗初期4 組TNF-α的分泌水平?jīng)]有顯著性差異；飼喂14 d和28 d時，3 組嬰兒配方乳組與基礎(chǔ)日糧組相比差異顯著（P＜0.05）。實驗結(jié)果說明巴氏殺菌嬰兒配方乳與市售常溫嬰兒配方乳相比能顯著提高血清中TNF-α的分泌水平，顯著改善大鼠的免疫功能。

綜上所述，細(xì)胞因子之間具有相互誘生、相互抑制、相互協(xié)同和相互拮抗作用。研究證明IL-2可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞增殖，IL-4則可誘導(dǎo)Th2細(xì)胞增殖，兩者之間存在一定的相互抑制作用，Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ可降低IL-4分泌水平[26]，IL-2又能夠激活T細(xì)胞亞群分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，增強(qiáng)Tc細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等的殺傷活性，這與本研究結(jié)果一致。巴氏殺菌嬰兒配方乳可以使免疫向以Th1細(xì)胞為主導(dǎo)的免疫應(yīng)答偏移[27]。說明巴氏殺菌嬰兒配方乳與市售常溫嬰兒配方乳相比更大地保留了免疫物質(zhì)的活性，提高了大鼠的免疫防御功能。且隨著飼喂時間的延長調(diào)節(jié)作用更加明顯。

2.3 巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠血清溶菌酶分泌水平的影響

血清中的溶菌酶由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌形成，存在于動物體液及組織中。溶菌酶在機(jī)體的修復(fù)再生、炎癥過程等調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，可以從不同角度反映細(xì)胞免疫功能和機(jī)體抗感染能力[28]。

表 3 嬰兒配方乳對大鼠血清溶菌酶分泌水平的影響Table 3 Effect of infant formula on serum lysozyme secretion in rats

由表3可知，實驗初期，4 組大鼠血清溶菌酶分泌量沒有顯著差異；隨著實驗時間延長，飼喂14 d時，與基礎(chǔ)日糧組相比，3 組嬰兒配方乳組均可以顯著提高大鼠血清中溶菌酶質(zhì)量濃度；飼喂28 d時，實驗組大鼠血清溶菌酶質(zhì)量濃度達(dá)到最高，且與市售組差異顯著（P＜0.05），說明巴氏殺菌嬰兒配方乳與市售常溫嬰兒配方乳相比，可以顯著提高大鼠血清中溶菌酶質(zhì)量濃度，提高機(jī)體抗感染的能力，增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫能力，并且隨著時間延長效果增強(qiáng)。

2.4 巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠外周血T細(xì)胞亞群的影響

T細(xì)胞具有不同的功能亞群。CD3是T細(xì)胞表面的主要特征性標(biāo)志物，根據(jù)功能和主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）分子限制性的不同，可將成熟的T細(xì)胞分為CD3＋CD4＋和CD3＋CD8＋兩個細(xì)胞亞群[29-30]。CD4是Th細(xì)胞和Ti細(xì)胞的重要表面標(biāo)志，為MHC-II類分子的受體，可加強(qiáng)CD4＋T細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞間的黏附力，使T細(xì)胞抗原受體與抗原的結(jié)合更加穩(wěn)定。CD8分子主要分布于Tc細(xì)胞和Ts細(xì)胞，它是MHC-I類分子的受體，能夠加強(qiáng)T細(xì)胞抗原受體與提呈細(xì)胞抗原的結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞磷酸化。通過流式細(xì)胞儀檢測，大鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群的測定結(jié)果見表4。

表 4 嬰兒配方乳外周血T細(xì)胞亞群的影響Table 4 Effect of infant formula on T cell subsets in peripheral blood

通過對4 組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示，飼喂28 d時實驗組SD大鼠的CD3＋T淋巴細(xì)胞相對含量與對照組和市售組相比差異顯著（P＜0.05），表明巴氏殺菌嬰兒配方乳可提高SD大鼠的CD3＋T淋巴細(xì)胞相對含量，可能會使SD大鼠的Ti細(xì)胞增多，并對抗原識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及機(jī)體快速抗感染免疫起到輔助作用。實驗組SD大鼠的CD4＋T淋巴細(xì)胞相對含量與基礎(chǔ)日糧組比差異顯著 （P＜0.05），表明巴氏殺菌嬰兒配方乳可提高SD大鼠的CD4＋T淋巴細(xì)胞相對含量，對機(jī)體免疫調(diào)節(jié)起一定的輔助作用；而CD8＋T淋巴細(xì)胞的相對含量不斷增加，表明巴氏殺菌嬰兒配方乳可能有助于免疫網(wǎng)絡(luò)的快速形成，并增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫作用。T細(xì)胞作為細(xì)胞免疫重要的調(diào)節(jié)成分，具有上調(diào)和下調(diào)免疫應(yīng)答的功能，其免疫應(yīng)答功能的實現(xiàn)是依靠CD4＋、CD8＋T淋巴細(xì)胞間的相互作用使機(jī)體處于免疫平衡狀態(tài)，所以CD4＋/CD8＋可作為初步評估機(jī)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)。根據(jù)資料顯示，正常人外周血中CD4＋/CD8＋介于0.60～3.45之間[31]，4 組SD大鼠血液中CD4＋/CD8＋均在正常范圍內(nèi)，飼喂28 d時，與對照組和市售組相比，實驗組SD大鼠CD4＋/CD8＋差異顯著 （P＜0.05），表明其免疫應(yīng)答的正調(diào)節(jié)占優(yōu)勢[32]。

3 結(jié) 論

巴氏殺菌嬰兒配方乳作為一種新型嬰幼配方食品填補(bǔ)了國內(nèi)市場的空白，本實驗通過動物喂養(yǎng)實驗，以2 款市售常溫嬰兒配方乳為對照，對比評估了巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠血液免疫因子水平及T細(xì)胞亞群的影響。巴氏殺菌嬰兒配方乳與市售常溫嬰兒配方乳比較能夠顯著提高SD大鼠的體質(zhì)量，促進(jìn)大鼠生長發(fā)育。巴氏殺菌嬰兒配方乳能提高大鼠血清中細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α及溶菌酶質(zhì)量濃度，且顯著高于市售組及基礎(chǔ)日糧組；隨著飼喂時間的延長調(diào)節(jié)作用更加顯著。巴氏殺菌嬰兒配方乳上調(diào)了SD大鼠外周血中CD3＋、CD4＋、CD8＋T淋巴細(xì)胞的相對含量以及CD4＋/CD8＋，且CD4＋/CD8＋處于正常范圍。巴氏殺菌嬰兒配方乳與市售常溫嬰兒配方乳比較，能夠促進(jìn)SD大鼠生長及淋巴細(xì)胞的增殖分化，增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫功能，并輔助機(jī)體免疫調(diào)節(jié)。