不同級分綠豆肽免疫活性的分析

刁靜靜，遲治平，劉妍兵，曲柳青，張麗萍

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

綠豆（Vigna radiata(L.) Wilczek）是我國主要雜糧作物之一，含有豐富的蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素、礦物質(zhì)以及人體所需的必需氨基酸[1-2]，其中蛋白質(zhì)量分數(shù)達19.5%～33.1%[3]。目前，我國對綠豆的工業(yè)化加工多用于淀粉、粉絲等產(chǎn)品的制取，其副產(chǎn)物綠豆蛋白多是作為生產(chǎn)廢料或牲畜飼料，造成了蛋白資源的浪費和環(huán)境污染[4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)食源性蛋白肽因其具有抗氧化、降血壓、抗菌、抗腫瘤、預(yù)防癌癥、調(diào)節(jié)免疫等生物活性功能從而吸引了廣大學(xué)者的關(guān)注[5-10]。有研究表明，食源性蛋白肽具有免疫活性，可提高機體免疫力、增強巨噬細胞的增殖和吞噬能力，降低疾病的 發(fā)生[11]。有研究發(fā)現(xiàn)肽的生物活性與其分子質(zhì)量、氨基酸序列等有關(guān)，王鵬[12]從榛仁蛋白水解物中提取的肽段Pro-Glu-Asp-Glu-Phe-Arg在適當濃度下可提高淋巴細胞增殖率，提高機體免疫能力。武文佳[13]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)分級后的小麥胚芽蛋白水解物分子質(zhì)量越低，免疫效果越好。Yoshikawa等[14]分別從大豆水解物和大米清蛋白水解物中篩選出免疫肽段，并推測含有Pro、Arg氨基酸的肽段具有較好的免疫效果。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)綠豆肽具有免疫活性，為了得到具有較高活性的綠豆免疫肽，本實驗以綠豆肽為原料，采用葡聚糖凝膠G-15進行層析分離，將不同級分綠豆肽分別作用于RAW264.7細胞，分析不同細胞處理組的吞噬能力、核酸、糖原、細胞因子等免疫活性指標，篩選出具有較高活性的免疫肽級分，并對其進行結(jié)構(gòu)分析，以期為進一步闡明綠豆肽的免疫調(diào)節(jié)作用機制提供技術(shù)支撐，也為綠豆肽在食品保健及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆蛋白粉 山東招遠市溫記食品有限公司；堿性蛋白酶 丹麥諾維信公司；葡聚糖凝膠SephadexG-15 上海寶曼生物科技有限公司；胎牛血清、青鏈霉素混 合液 北京索萊寶生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基/改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基 上?；鄯f生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 北京夢怡美生物科技有限公司；胰蛋白酶、細胞培養(yǎng)皿 美國賽默飛世爾科技有限公司；無水乙醇（分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；吖啶橙熒光染色試 劑盒 北京吉美生物技術(shù)有限公司；過碘酸席夫染色液試劑盒 安徽雷根生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

細胞培養(yǎng)箱 上海璽恒實業(yè)有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州榮冠實驗分析儀器廠；超凈工作臺 鄭州 宏朗儀器設(shè)備有限公司；低速離心機 張家港市凱迪機械有限公司；高速冷凍離心機 北京時代北利離心機有限公司；電子顯微鏡 深圳市博視達光學(xué)儀器有限公司；HG-9707電腦紫外檢測儀、DLH-2電腦恒流泵、BSZ-160F電腦自動部分收集器 上海精科實業(yè)有限 公司；API 3000型三重四極桿質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司；熒光顯微鏡 上海天省儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 綠豆肽的制備

實驗室自行制備綠豆肽，將購買的綠豆蛋白粉配制成質(zhì)量分數(shù)為7%的樣品溶液，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值至8.5，加入質(zhì)量分數(shù)1%堿性蛋白酶后于55 ℃水浴攪拌，用1 mol/L的NaOH溶液使pH值保持恒定，當水解度達到25%時終止水解，調(diào)節(jié)pH值至7.0，并在攪拌中迅速升溫至95 ℃，保持10 min使酶失活，獲得綠豆肽溶液，冷凍干燥備用。

1.3.2 綠豆肽的分級

采用Sephadex G-15層析凝膠柱進行分離，凝膠柱規(guī)格為1 cmh 40 cm，樣品上樣量2 mL，樣品質(zhì)量濃度為0.1 g/mL，以蒸餾水為流動相，流速1 mL/min，洗脫5 h，220 nm波長處（HG-9707紫外檢測器）檢測出峰情況，收集不同洗脫時間的綠豆肽溶液，冷凍干燥備用。采用Collection Microsoft軟件進行數(shù)據(jù)分析，計算峰面積。

1.3.3 不同級分綠豆肽對RAW264.7細胞增殖率的影響

RAW264.7巨噬細胞以1h 105個/mL的濃度接種到96 孔板，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)條件下預(yù)培養(yǎng)2 h后，分別加入質(zhì)量濃度為200 mg/mL分級后的綠豆肽溶液，以等體積的PBS作為空白對照，培養(yǎng)4 h后直接加入20 μL中性紅染色液，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，除去含有中性紅染色液的培養(yǎng)液，加入200 μL中性紅檢測裂解液，室溫搖床裂解10 min后于690 nm波長處測定吸光度。

1.3.4 不同級分綠豆肽對巨噬細胞糖原的影響

取細胞板，將固定好的各組分巨噬細胞固定液甩凈，滴加蒸餾水至覆蓋細胞爬片，清洗3～4 次，每次5 min。去除蒸餾水，滴加高錳酸鉀溶液氧化10 min。去除殘液，滴加蒸餾水浸泡5 min。去除殘液，滴加席夫染液染色15 min后，蒸餾水清洗3～4 次，每次5 min，去除殘液，以蘇木精復(fù)染1 min，自來水反藍5 min。染色完成后，依次以體積分數(shù)75%、85%、95%乙醇溶液和無水乙醇（分析純）、無水乙醇（色譜純）浸泡，每次浸泡1 min，取出，于干凈的載玻片上滴加一滴甘油乙醇，將細胞爬片倒扣于載玻片上，顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.3.5 不同級分綠豆肽對RAW264.7巨噬細胞核酸的影響

分別取不同組分的巨噬細胞于干凈的載玻片上，加入適量95%乙醇溶液固定細胞5 min，滴加2 滴質(zhì)量分數(shù)0.01%吖啶橙染液，染色5 min后蓋上蓋玻片，吸去蓋玻片周圍多余液體，在熒光顯微鏡下選擇藍色激發(fā)光濾片觀察染色情況。

1.3.6 不同級分綠豆肽對巨噬細胞的細胞因子的影響

取對數(shù)生長期巨噬細胞按照1h 105個/孔的數(shù)目接種至6 孔板中，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)條件下預(yù)培養(yǎng)24 h，設(shè)置空白組、LPS刺激組、不同級分綠豆肽組，不同級分綠豆肽組每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為200 mg/mL的不同級分綠豆肽，LPS刺激組加入20 μL質(zhì)量濃度為200 μg/mL的LPS溶液，空白組加入等體積PBS，相同條件下培養(yǎng)24 h后收集上清液，按照白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒說明書操作，測定各細胞因子水平。

1.3.7 不同級分綠豆肽對LPS刺激巨噬細胞的細胞因子分泌量的影響

取對數(shù)生長期巨噬細胞按照1h 105個/孔的數(shù)目接種至6 孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)條件下預(yù)培養(yǎng)24 h，設(shè)置空白組、LPS刺激組、不同級分綠豆肽抑制組，不同級分綠豆抑制肽組每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為200 mg/mL的不同級分綠豆肽，然后加入20 μL質(zhì)量濃度為200 μg/mL的LPS溶液，LPS刺激組加入20 μL質(zhì)量濃度為200 μg/mL的LPS溶液后再加入20 μL PBS，空白組加入40 μL PBS，相同條件下培養(yǎng)24 h后收集上清液，按照IL-6、IL-1β、TNF-α的ELISA試劑盒說明書操作，測定各細胞因子水平。

1.3.8 綠豆肽的結(jié)構(gòu)鑒定

參照吳芳玲等[15]的方法測定綠豆肽的結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所得數(shù)據(jù)均為重復(fù)實驗平均值，采用Statistix 8軟件對數(shù)據(jù)進行分析，平均值之間顯著性差異（P＜0.05）通過Tukey HSD進行多重比較分析。采用SigmaPlot 13.0和Excel 6.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SephadexG-15層析分離綠豆肽

圖 1 綠豆肽分級層析譜圖Fig. 1 Chromatographic separation of mung bean peptides

由圖1可知，綠豆肽被分成4 個級分MBPH-1、MBPH-2、MBPH-3和MBPH-4，根據(jù)葡聚糖凝膠分離性質(zhì)可知不同級分綠豆肽的分子質(zhì)量由大到小為MBPH-1＞MBPH-2＞MBPH-3＞MBPH-4。采用Collection Microsoft軟件對峰面積進行計算，結(jié)果如下：MBPH-1（2 400.58）、MBPH-2（2 294.41）、MBPH-3（1 165.28）、MBPH-4（420.00），其中MBPH-4級分綠豆肽量較少，不足以進行后續(xù)分析，遂與MBPH-3級分綠豆肽合并，統(tǒng)一歸為MBPH-3級分。

2.2 不同級分綠豆肽對RAW264.7細胞增殖率的影響

表 1 不同級分綠豆肽以及未分級綠豆肽對巨噬細胞增殖率的影響Table 1 Effect of mung bean protein hydrolysate and separated peptides on the proliferation rate of macrophages

表1反映不同級分綠豆肽對巨噬細胞增殖率的影響，由實驗結(jié)果可知，不同處理組綠豆肽均對巨噬細胞增殖有促進效果，且呈梯度增加，巨噬細胞增殖率由低到高依次是未分級綠豆肽＜MBPH-1＜MBPH-2＜MBPH-3，其中MBPH-3級分促進效果最佳，MBPH-3組的增殖率為9.050%，相比MBPH-2、MBPH-1、未分級綠豆肽組分別增高6.77%、7.75%、8.42%，已有研究表明，巨噬細胞增殖能力可以作為評估巨噬細胞是否活化的重要指標[16]。當巨噬細胞受到刺激因子、表皮生長因子、腫瘤促進因子等生長因子誘導(dǎo)的情況下會促使巨噬細胞增殖[17]。綜上所述，不同級分綠豆肽以及未分級的綠豆肽均對巨噬細胞無毒害作用，能夠促進巨噬細胞活化，提高免疫力，且MBPH-3綠豆肽促進效果最優(yōu)。

2.3 不同級分綠豆肽對RAW264.7巨噬細胞糖原的影響

巨噬細胞中的糖類物質(zhì)經(jīng)過碘酸氧化形成雙醛基，醛基又與席夫試劑中的無色品紅結(jié)合，形成紫紅色物質(zhì)，附著于含有多糖類的包漿中，染色的深淺可直接反映糖類物質(zhì)的含量。由圖2可知，LPS刺激組和不同級分綠豆肽組細胞內(nèi)紫紅色結(jié)塊偏多，染色程度加深，此時細胞內(nèi)糖原含量升高，空白組細胞內(nèi)顆粒分散稀疏。不同級分綠豆肽組糖原含量相比空白組差異顯著 （P＜0.05），其中MBPH-3級分促進效果最佳。巨噬細胞是一種非特異性免疫細胞，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[18]，也有研究表明免疫細胞在受到外界刺激時會迅速改變糖代謝方式以便產(chǎn)生炎癥因子抵抗外界抗原刺激[19]。綜上所述，不同級分綠豆肽可促進巨噬細胞改變代謝方式，使糖原含量升高，從而促進炎癥因子的釋放，調(diào)節(jié)細胞免疫活性。

圖 2 不同級分綠豆肽對巨噬細胞糖原的影響（×200）Fig. 2 Effects of mung bean peptides on glycogen in macrophages (× 200)

2.4 不同級分綠豆肽對RAW264.7巨噬細胞核酸的影響

圖 3 不同級分綠豆肽對巨噬細胞核酸的影響（×400）Fig. 3 Effects of mung bean peptides on nucleic acids in macrophages (× 400)

體積分數(shù)95%乙醇溶液可改變巨噬細胞膜通透性，吖啶橙可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，從而與DNA結(jié)合，于530 nm波長處熒光發(fā)射峰下呈現(xiàn)黃綠色熒光；帶正電荷的吖啶橙與帶負電荷的單鏈核酸的磷酸根產(chǎn)生靜電吸引結(jié)合，在640 nm波長處熒光發(fā)射峰下呈現(xiàn)紅綠色熒光。如圖3所示，LPS刺激組與不同級分綠豆肽組細胞體積變大、突觸長而粗，核內(nèi)的DNA呈黃綠色，基質(zhì)內(nèi)的RNA呈紅綠色，相比空白組熒光強度明顯增強，其中MBPH-3級分綠豆肽促進效果最佳。有研究表明核酸代謝活性的增強有利于激活巨噬細胞各種生命活動。綜上所述，不同級分綠豆肽可促進核酸的代謝，提高巨噬細胞的活性，從而調(diào)節(jié)免疫功能，結(jié)果顯示MBPH-3級分促進效果更為明顯。

2.5 不同級分綠豆肽對小鼠巨噬細胞細胞因子的影響

圖 4 不同級分綠豆肽對巨噬細胞細胞因子的影響Fig. 4 Effects of mung bean peptides on macrophage cytokine secretion

細胞因子是由免疫細胞和某些非免疫細胞經(jīng)刺激而合成分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白，具有調(diào)節(jié)天然免疫、獲得性免疫、細胞生長和損傷組織修復(fù)等多種功能[20]。圖4反映了不同級分綠豆肽對巨噬細胞細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α分泌量的影響。IL-6是在感染和損傷刺激下產(chǎn)生的一種多效性細胞因子，能調(diào)節(jié)多種細胞功能，包括細胞增殖、細胞分化、免疫防御機制等，主要由淋巴細胞、巨噬細胞等細胞分泌[21]。由圖4 可知，LPS刺激組的IL-6分泌量明顯高于空白組以及不同級分綠豆肽組，這是由于LPS刺激巨噬細胞，導(dǎo)致巨噬細胞活化，從而上調(diào)了細胞因子IL-6的表達。不同級分綠豆肽組間對比發(fā)現(xiàn)，MBPH-1、MBPH-2、MBPH-3綠豆肽都具有提高IL-6分泌的能力，且MBPH-3組細胞因子分泌量高于其他組分，分泌量為1 566.47 pg/mL。IL-1β是內(nèi)皮細胞活化因子，是一種起免疫調(diào)節(jié)作用的激素樣肽類物質(zhì)，即為炎癥前期細胞因子，主要由活化的吞噬細胞產(chǎn)生，在免疫應(yīng)答中起著重要作用[22]。由圖4可以看出，不同級分綠豆肽組可促進巨噬細胞分泌IL-1β，其中MBPH-3組促進效果最佳，但分泌量顯著低于LPS刺激組，是因為LPS作為內(nèi)毒素其刺激性強于不同級分綠豆肽組，所以分泌量高于其他級分綠豆肽組。TNF-α由多核巨噬細胞產(chǎn)生，是一種具有廣泛生物活性能直接殺傷腫瘤細胞且對正常細胞無明顯毒性的細胞因子，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強的生物活性因子之一[23]。由圖4可知，不同級分綠豆肽刺激組TNF-α的分泌量趨勢與IL-6、IL-1β相似，且MBPH-3組的細胞因子分泌量高于其他級分綠豆肽組，但低于LPS刺激組細胞因子分泌量，MBPH-1、MBPH-2、MBPH-3組TNF-α分泌量分別為565.16、537.63、828.13 pg/mL，均高于空白組 （436.18 pg/mL），顯著低于LPS刺激組。綜上分析，不同級分綠豆肽可以通過促進促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌，從而在促炎途徑中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

2.6 不同級分綠豆肽對LPS刺激巨噬細胞細胞因子的影響

圖 5 不同級分綠豆肽對LPS刺激巨噬細胞細胞因子的影響Fig. 5 Effects of mung bean peptides on cytokine secretion in macrophage stimulated by LPS

圖5反映的是不同級分綠豆肽對LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞細胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）分泌量的影響。LPS刺激組的IL-6、IL-1β、TNF-α分泌量顯著高于不同級分綠豆肽處理組以及空白組，而不同級分綠豆肽對LPS刺激的巨噬細胞細胞因子分泌水平有一定的抑制效果，且MBPH-3處理組抑制能力最佳，其TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量分別為2 152.94、1 058.81、859.96 pg/mL，相比LPS刺激組（2 923.19、3 707.09、2 880.74 pg/mL）有一定抑制作用。這表明不同級分綠豆肽可抑制LPS刺激巨噬細胞分泌炎癥因子，可推斷在機體受到外界刺激時，不同級分綠豆肽可通過拮抗炎癥的作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。劉效森等[24]研究表明補充生物活性肽QRPR可以抵御LPS刺激RAW264.7細胞引起的炎癥反應(yīng)作用。這與本研究結(jié)果一致。

2.7 高免疫活性綠豆肽結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

圖 6 MBPH-3的一級質(zhì)譜圖Fig. 6 Mass spectrum of MBPH-3

圖 7 MBPH-3的二級質(zhì)譜圖Fig. 7 Tandem mass spectrum of MBPH-3

質(zhì)譜法是多肽結(jié)構(gòu)確證的重要手段，用質(zhì)譜法測定肽類的相對分子質(zhì)量及進行序列分析具有分析速度快、步驟簡單、用量、結(jié)果準確等優(yōu)點[25-27]。圖6、7為MBPH-3綠豆肽質(zhì)譜圖，根據(jù)b離子片段和y離子片段可推算出C端、N端氨基酸分子質(zhì)量分別為132、132、181、75 Da和115、119、149 Da，通過氨基酸分子質(zhì)量推測氨基酸序列為Asn-Asn-Tyr-Gly-Pro-Thr-Met，其分子質(zhì)量為903 Da。

3 討 論

食源性蛋白肽的分子質(zhì)量與其生物活性有關(guān)，王璐等[28]的研究也證實蛋白水解物分子質(zhì)量與其免疫活性存在一定的關(guān)系，其中分子質(zhì)量小于1 000 Da的水解物其免疫活性較強。且研究還發(fā)現(xiàn)含有疏水性氨基酸的肽段免疫效果極佳[29]。本實驗結(jié)果得出綠豆肽的分子質(zhì)量與其活性呈負相關(guān)，且具有較高活性的綠豆肽級分中含有酪氨酸、甘氨酸和脯氨酸等疏水性氨基酸。這與王璐[28]和阮曉慧[29]等的研究結(jié)果一致。

有研究發(fā)現(xiàn)食源性蛋白肽對機體的先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)均有不同程度的免疫調(diào)節(jié)作用，其可誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)細胞因子和抗體的產(chǎn)生，增強巨噬細胞活力，刺激淋巴細胞增殖等，抑制宿主細胞對LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而提高機體的免疫能力。本實驗得出不同級分綠豆肽可提高機體的非特異性免疫反應(yīng)，可刺激巨噬細胞增殖，而且綠豆肽分子質(zhì)量越小，其增殖率越高；而且小分子質(zhì)量綠豆肽處理組的巨噬細胞糖原含量，核酸代謝水平均優(yōu)于空白組和LPS刺激組，這些研究結(jié)果均表明綠豆肽可顯著活化巨噬細胞，刺激其增殖，并提高細胞的核酸代謝水平，且小分子質(zhì)量綠豆肽的效果尤為明顯，這就表明綠豆肽的免疫活性與其分子質(zhì)量緊密相關(guān)。而且細胞因子研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)綠豆肽可以增強巨噬細胞的IL-6、IL-1β和TNF-α等細胞因子的表達量，但其表達量均顯著低于LPS刺激組；與其他處理組相比，MBPH-3級分的細胞因子表達量較高。綠豆肽可激活巨噬細胞，發(fā)揮免疫活性，但其不會引起機體的炎癥反應(yīng)，并且這與綠豆肽的分子質(zhì)量具有一定的相關(guān)性；通過綠豆肽對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞的細胞因子表達研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綠豆肽可顯著抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細胞促炎細胞因子的表達，且MBPH-3級分的抑制效果最佳。以上研究均說明綠豆肽可增強正常巨噬細胞的活力，提高其抗感染性；同時，綠豆肽對于炎性細胞又可發(fā)揮拮抗炎癥的作用，且綠豆肽的免疫活性與其分子質(zhì)量具有相關(guān)性。

有研究表明具有較高免疫活性的食源性蛋白肽大都包含2～10 個氨基酸序列，且具有一定的疏水性。MBPH-3級分的鑒定結(jié)果得出其分子質(zhì)量為903 Da，氨基酸序列為Asn-Asn-Tyr-Gly-Pro-Thr-Met的七肽。有研究發(fā)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)肽的常見殘基是疏水氨基酸，如甘氨酸（Gly）、脯氨酸等（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、谷氨酸（Glu）、酪氨酸（Tyr）等，而且疏水氨基酸和谷氨酰胺、酪氨酸（Tyr）、半胱氨酸（Cys）、天冬酰胺（Asn）的一個或多個殘基促進了食源性蛋白肽的免疫活性[30-31]。本實驗結(jié)果進一步證實蛋白肽的氨基酸序列在2～10 個之間具有較高的免疫活性，且含有較高疏水性氨基酸殘基的肽級分其免疫活性也強。

綜上所述，綠豆肽具有免疫調(diào)節(jié)能力，免疫活性與其肽級分呈一定的相關(guān)性，分子質(zhì)量為903 Da的肽鏈免疫活性較高，該級分能增強巨噬細胞增殖能力、促進核酸合成以及糖酵解的進行，可激活正常巨噬細胞的細胞因子IL-6、L-1β和TNF-α的表達，又能抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6、L-1β和TNF-α等細胞因子。其中，具有較高免疫活性的MBPH-3級分中主要氨基酸序列為Asn-Asn-Tyr-Gly-Pro-Thr-Met。