基于鈣離子轉(zhuǎn)運調(diào)控的甘草酸抗過敏作用

姜天依，孫 璐，普秋榕，張亞妮，車會蓮

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

目前，食物過敏性疾病發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)持續(xù)上升[1]。食物過敏是指機體針對攝入的食物產(chǎn)生的一種有害、具有復(fù)發(fā)性的特定免疫反應(yīng)，以免疫球蛋白E（immunoglobulins E，IgE）介導(dǎo)的食物過敏反應(yīng)為主，即速發(fā)型過敏反應(yīng)，也叫I型超敏反應(yīng)[2]。研究發(fā)現(xiàn)一些具有抗氧化性、抗炎作用的生物活性成分（如黃酮類的多酚物質(zhì)）具有抗過敏功效[3-5]。

甘草是一種被廣泛應(yīng)用的藥食同源植物，甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）是甘草中最重要的活性成分之一，又稱甘草甜素[6]。GA是一種五環(huán)三萜系列皂苷[7]， 對動物的免疫功能具有影響作用，可能與其抗炎、抗病毒性相關(guān)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，GA在炎癥相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子的核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路中具有關(guān)聯(lián)[9]。

從患有腫瘤的Wistar大鼠體內(nèi)分離克隆得到的大鼠嗜堿性粒細胞（rat basophilic leukemia cells，RBL）與黏膜肥大細胞相似，可以在細胞表面正常表達IgE高親和力受體，并可被抗原激發(fā)而發(fā)生脫顆粒釋放導(dǎo)致炎癥[10]。β-氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase，HEX）是脫顆粒的一種生物標志物，釋放后不會和組胺一樣很快被分解，其釋放水平通常用作判斷RBL或肥大細胞的脫顆粒程度[11]。

有研究顯示，激發(fā)過敏反應(yīng)的信號傳導(dǎo)過程與胞內(nèi)鈣離子水平密切相關(guān)，基質(zhì)交互分子1（stromal interaction molecule 1，STIM1）和瞬時受體I型電位通道（transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 1，TRPC1）蛋白對鈣離子釋放、傳導(dǎo)有調(diào) 控作用[12-13]。

目前對GA的抗過敏作用機理尚缺乏深入了解。本研究通過建立小鼠被動皮膚過敏（passive cutaneous anaphylaxis，PCA）和過敏性皮炎模型來確定GA的抗過敏功效，并在分析GA是否具有降低胞內(nèi)鈣離子水平作用的基礎(chǔ)上，探究鈣離子通道蛋白的表達水平在GA處理前后的差異，確定GA是否通過影響鈣離子通道蛋白的表達來影響鈣離子水平。以期為深入探究GA的抗過敏機理及治療過敏反應(yīng)開拓新的方法。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雌性BALB/c小鼠（生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001），4～5 周齡，體質(zhì)量18～22 g，SPF級，購于維通利華公司。

大鼠RBL白血病細胞系RBL-2H3購自中國科學(xué)院細胞庫，來源于美國菌類保藏中心，編號CRL-2256TM，在含有質(zhì)量分數(shù)15%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素/兩性霉素B的Eagle’s MEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

牛血清白蛋白、小鼠抗二硝基苯酚IgE單克隆抗體、二硝基苯基化人血清白蛋白（dinitrophenylated human serum albumin，DNP-HSA）、伊文思藍染液 美國Sigma公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor receptor-α，TNF-α）檢測試劑盒 美國eBioscience 公司；小鼠組胺酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 武漢華美生物工程有限公司；超純RNA提取試劑 日本TaKaRa 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge 5804 R型低溫高速離心機 德國Eppendorf公司；JB5374-91型電子天平 常熟市金羊砝碼儀器有限公司；Varloskan Flash多功能酶標儀 美國 Thermo Scientific公司；水浴鍋 德國Peter Huber K?ltemaschinenbau公司。

1.3 方法

1.3.1 雌性BALB/c小鼠PCA實驗

為明確GA的抗過敏功效，本研究建立了雌性BALB/c 小鼠PCA模型，經(jīng)抗原激發(fā)后，檢測血清中的組胺質(zhì)量濃度，并通過向小鼠耳部注射伊文思藍染液來檢測其血管通透性的改變。

參考Zhou Cui等[14]的方法，將50 只BALB/c小鼠正常飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)，按體質(zhì)量隨機分為5 組，每組10 只，分別為陰性對照組、色甘酸鈉組（50 mg/kgmb）、 G A 低 劑 量 組（1 m g/k gmb）、G A 中 劑 量 組 （10 mg/kgmb）、GA高劑量組（100 mg/kgmb）。

第0天給予小鼠右耳注射抗DNP-IgE致敏，之后連續(xù)3 d，各組動物分別灌胃給予生理鹽水、色甘酸鈉以及GA低、中、高3 個劑量處理，每天1 次。最后1 次灌胃后，尾靜脈注射200 μL抗原DNP-HSA與質(zhì)量分數(shù)1%伊文思藍染液的混合物（體積比1∶1），激發(fā)小鼠的被動過敏反應(yīng)。

抗原激發(fā)20 min后，各組小鼠分別進行內(nèi)眥靜脈叢采血，收集于預(yù)先裝有抗凝劑的離心管中。靜置1 h后，經(jīng)2 000hg離心20 min后，吸取上層血清，－80 ℃保存。組胺質(zhì)量濃度采用ELISA試劑盒進行測定，具體測定步驟參照試劑盒說明書，組胺質(zhì)量濃度越高，說明肥大細胞脫顆粒越嚴重，PCA反應(yīng)越劇烈?？乖碳ず?，觀察小鼠耳部顏色變化。采血后處死小鼠，取鼠耳組織勻漿后浸泡于甲酰胺溶液中，利用分光光度計分析浸提液630 nm波長處的吸光度。

1.3.2 雌性BALB/c小鼠過敏性皮炎實驗

為探究GA在治療接觸性過敏性皮炎中發(fā)揮的作用及機理，建立雌性BALB/c小鼠過敏性皮炎模型，并測定小鼠耳腫脹程度和血清中TNF-α質(zhì)量濃度。參考 Wang Jing等[15]的方法，將50 只BALB/c小鼠正常飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)，隨機分為5 組，每組10 只，分別為陰性對照組、模型組以及GA低劑量組（1 mg/kgmb）、 G A 中 劑 量 組（1 0 m g/k gmb）、G A 高 劑 量 組（100 mg/kgmb）。

小鼠于實驗前1 d腹部脫毛，范圍約3 cmh 3 cm，實驗第1天脫毛部位均勻涂以體積分數(shù)1%二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB）丙酮橄欖油（丙酮、橄欖油體積比4∶1）溶液50 μL進行致敏，實驗第2天重復(fù)強化致敏1 次。首次致敏后當(dāng)天開始灌胃GA溶液0.2 mL，陰性對照組和模型組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)5 d。實驗第5天灌胃后，小鼠雙耳各均勻涂1% DNFB丙酮橄欖油溶液10 μL進行激發(fā)。陰性對照組在相同部位僅涂以丙酮橄欖油溶液作對照。在激發(fā)前及激發(fā)后24 h，分別用游標卡尺測量小鼠雙側(cè)耳中部的厚度，計算激發(fā)前后的耳厚度差，厚度差越大，說明過敏性皮炎反應(yīng)越劇烈。

小鼠摘眼球取血，分離血清置于－20 ℃冰箱中待測。采用ELISA試劑盒測定血清中TNF-α質(zhì)量濃度，TNF-α質(zhì)量濃度越高，說明過敏性皮炎反應(yīng)越劇烈。

1.3.3 HEX釋放水平測定

參考陳晨等[16]的方法，將5h 105個/mL的RBL-2H3細胞以200 μL/孔接種到96 孔細胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24 h。用PBS洗滌后，加入1 μg/mL抗DNP-IgE（100 μL/孔，用不含胎牛血清的培養(yǎng)液稀釋，陰性對照孔不加），在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。細胞給予100 μL/孔不同質(zhì)量濃度（0、100、333、500、1 000 μg/mL）的GA處理20 min后，棄掉上清液，用Tyrode’s緩沖液洗滌2 次，各組依次加入100 ng/mL DNP-HSA（50 μL/孔，Tyrode’s緩沖液稀釋），在37 ℃反應(yīng)45 min，將96 孔板置于冰上冷卻15 min以終止反應(yīng)。轉(zhuǎn)移30 μL上清液至另一個96 孔板，加入50 μL含1.3 mg/mL 4-硝基苯基-N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖的檸檬酸溶液，37 ℃反應(yīng)1 h。加200 μL碳酸鈉緩沖液終止反應(yīng)，測定405 nm波長處的吸光度。全部釋放組用1% Trition X-100代替過敏原處理細胞，陰性對照組用PBS代替過敏原處理細胞。結(jié)果以HEX釋放率表示，如式（1）所示計算。

1.3.4 胞內(nèi)鈣離子水平的測定

參考潘雪刁等的方法[17]，將細胞接種到6 cm的培養(yǎng)皿中，利用1 μg/mL抗DNP-IgE在37 ℃下致敏2 h后，使用D-hank’s緩沖液洗細胞兩次，之后將細胞轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，再沖洗兩次，以相同密度重懸于1 mL含有2 μmol/L Fluo-3 AM的細胞染色緩沖液中，37 ℃下避光孵育30 min，沖洗兩次，離心并重懸，將1h 105個/mL細胞接種到96 孔板中，刺激之前30 s檢測基礎(chǔ)Ca2＋水平，30 s時加入100 ng/mL DNP-HSA刺激，連續(xù)測定5 min，采用全波長掃描儀檢測激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm處的熒光強度。Ca2＋濃度（[Ca2＋]i）的計算如公式（2）所示。

式中：Kd為熒光劑與Ca2＋形成配合物的解離常數(shù)（400 nmol/L）；Fmin是熒光劑沒有結(jié)合Ca2＋時的熒光強度（采用含5 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸的D-hank’s緩沖液處理細胞）；Fmax是熒光劑被Ca2＋飽和時的熒光強度（采用0.1% Triton X-100處理細胞）；F為樣品的熒光強度。

1.3.5 GA對鈣離子通道蛋白表達的影響

根據(jù)申婷婷等[18]的方法，經(jīng)過細胞致敏、GA孵育、抗原刺激后，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白。用BCA試劑盒進行蛋白質(zhì)量濃度測定后，進行Western blot實驗，將蛋白以20 μg/孔點樣至質(zhì)量分數(shù)5%～15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。在80 V恒壓下電轉(zhuǎn)印2 h，將蛋白條帶印跡到硝酸纖維素膜上。采用TBST/質(zhì)量分數(shù)5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入1∶4 000兔源TRPC1單克隆抗體或1∶4 000兔源STIM1單克隆抗體孵育過夜后，用TBST洗滌6 次（5 min/次）。加入1∶8 000 HRP標記羊抗兔IgG抗體孵育1 h，用TBST洗滌8 次（5 min/次）。然后加入HRP-DAB增強顯色液進行顯色。蛋白表達量以相對灰度表示。

1.3.6 GA處理對STIM1、TRPCmRNA水平的影響

經(jīng)過細胞致敏、GA孵育、抗原刺激后，用超純RNA提取試劑提取組織樣本中總RNA。實驗操作按產(chǎn)品說明書進行。用RNase free H2O溶解沉淀，并將RNA溶液保存于－80 ℃冰箱中。取5 μL RNA用質(zhì)量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測RNA的完整性。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的gDNA Eraser對RNA中殘留的基因組DNA進行消化處理。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。對STIM1、TRPC這兩個基因使用熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀器進行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 18.0軟件對測定的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，采用GraphPad Prism 5.01軟件作圖，其中細胞實驗n＝3、小鼠實驗n＝10；P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 GA對PCA小鼠耳部毛細血管通透性的影響

色甘酸鈉具有抗過敏作用，已作為抗過敏藥品用于臨床治療。本研究通過耳部注射抗DNP-IgE建立了PCA小鼠模型，在給予PCA小鼠色甘酸鈉和GA處理之后，再由小鼠尾靜脈注射伊文思藍。用甲酰胺溶液提取各組小鼠耳部組織中的伊文思藍并進行吸光度分析，結(jié)果如圖1所示，色甘酸鈉組和不同劑量GA組的吸光度都極顯著低于陰性對照組（P＜0.01），而100 mg/kgmbGA組顯著低于色甘酸鈉和1 mg/kgmb和10 mg/kgmbGA組。結(jié)果說明GA能夠降低致敏模型小鼠耳部毛細血管通透性。

圖 1 GA對PCA小鼠耳部血管通透性的影響Fig. 1 Effect of GA on ear vascular permeability of PCA mice

2.2 GA對PCA小鼠血清組胺質(zhì)量濃度的影響

圖 2 GA對PCA小鼠血清組胺質(zhì)量濃度的影響Fig. 2 Effect of GA on histamine level in serum of PCA mice

鼠尾靜脈注射抗原后，采血測定各組PCA小鼠的組胺質(zhì)量濃度。如圖2所示，色甘酸鈉和GA各劑量組PCA小鼠的組胺水平都極顯著低于陰性對照組 （P＜0.01），且對組胺質(zhì)量濃度的降低效果與GA劑量有正相關(guān)性。在1～100 mg/kgmb范圍內(nèi)，GA劑量與抑制肥大細胞脫顆粒的作用呈現(xiàn)正相關(guān)性。

2.3 GA對DIAD小鼠耳腫脹度的影響

為評價GA對過敏性腫脹是否有治療、緩解作用，建立了DNFB誘導(dǎo)皮炎（DNFB-induced atopic dermatitis，DIAD）小鼠模型，小鼠耳腫脹度是DIAD小鼠的標志癥狀之一。檢測結(jié)果顯示高劑量GA處理的DIAD小鼠耳厚度顯著低于DNFB組小鼠（P＜0.05）（表1）。

表 1 GA對DIAD小鼠耳腫脹度的影響Table 1 Effect of GA on ear swelling of DIAD mice

圖 3 GA對DIAD小鼠血清TNF-α質(zhì)量濃度的影響Fig. 3 Effects of GA on TNF-α level in serum of DIAD mice

過敏原激活肥大細胞后會產(chǎn)生許多細胞因子，比如TNF-α，在過敏模型中，TNF-α水平越高表明過敏反應(yīng)越劇烈。對小鼠血清中TNF-α質(zhì)量濃度的檢測結(jié)果顯示，GA處理能夠降低DIAD小鼠血清中TNF-α質(zhì)量濃度。 如圖3所示，10 mg/kg或更高劑量GA處理組的TNF-α質(zhì)量濃度極顯著低于DNFB組（P＜0.01）。表明GA能夠降低過敏性皮炎小鼠血清的TNF-α質(zhì)量濃度。

2.4 GA對肥大細胞脫顆粒的抑制作用

圖 4 GA 對RBL-2H3細胞釋放HEX的抑制作用Fig. 4 Inhibitory effect of GA on the release of HEX in RBL-2H3 cells

肥大細胞脫顆粒能引發(fā)機體產(chǎn)生過敏癥狀，HEX釋放率是反映細胞脫顆粒水平的生物指標。實驗結(jié)果顯示，GA處理能顯著抑制RBL-2H3細胞的HEX釋放。如 圖4所示，500、1 000 μg/mL的GA處理使HEX的釋放率分別下降37.9%和54.8%，說明GA能抑制肥大細胞脫顆粒。

2.5 GA處理對胞內(nèi)鈣離子水平的影響

GA處理抑制了肥大細胞脫顆粒，為了探究其作用機制，本研究測定了其對胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。用鈣離子熒光探針Fluo-3 AM分析IgE致敏的RBL-2H3細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。結(jié)果顯示，GA能夠抑制抗原誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2＋濃度上升。如圖5所示，500 μg/mL和 1 000 μg/mLGA處理顯著降低了細胞內(nèi)Ca2＋濃度。說明GA可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2＋濃度影響細胞的脫顆 粒反應(yīng)。

圖 5 GA處 理對RBL-2H3細胞內(nèi)Ca2濃度的影響 Fig. 5 Effect of GA on intracellular Ca2＋ level of RBL-2H3 cells

2.6 GA處理對鈣離子通道蛋白表達水平的影響

已有研究表明STIM1和TRPC1蛋白對鈣離子的釋放和傳導(dǎo)有調(diào)控作用。RBL-2H3細胞經(jīng)過抗DNP-IgE致敏后再進行GA處理，并給予DNP-HSA刺激。對提取的細胞mRNA進行實時熒光PCR分析，結(jié)果表明，GA對STIM1和TRPC1的mRNA轉(zhuǎn)錄有一定的抑制作用（表2）。

表 2 GA對STIM1和TRPC1 mRNA表達水平的影響Table 2 Effect of GA on mRNA levels of STIM1 and TRPC1

圖 6 GA對STIM1（A）、TRPC1（B）蛋白表達水平的影響Fig. 6 Effect of GA on the expression levels of STIM1 (A）and TRPC1 (B) proteins

免疫印跡結(jié)果如圖6所示，500 μg/mL和1 000 μg/mL的GA處理顯著降低了細胞內(nèi)STIM1和TRPC1蛋白的表達水平（P＜0.05）。這證明GA可能通過調(diào)控鈣離子通道蛋白的表達來影響胞內(nèi)鈣離子濃度，從而抑制細胞的脫顆粒及介質(zhì)的釋放。在1 000 μg/mLGA處理的細胞中，TRPC1表達水平甚至低于未給予抗原刺激的陰性對照組，這進一步表明GA對TRPC1表達有顯著的抑制作用。

3 討 論

組胺在變應(yīng)性鼻炎、支氣管哮喘等過敏引起的呼吸道慢性炎癥性疾病的發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用，具有強烈的疏通血管作用，并能增加毛細血管和微靜脈的管壁通透性，使血漿漏入組織，導(dǎo)致局部組織水腫[20-21]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，色甘酸鈉的主要作用是穩(wěn)定肥大細胞膜、抑制鈣離子內(nèi)流、進而抑制抗原激發(fā)后的組胺釋放[22]。

在本研究中，GA處理能夠降低PCA模型小鼠血清中的組胺水平，且10 mg/kgmbGA與50 mg/kgmb色甘酸鈉具有同等的降組胺功效。本研究還顯示10 mg/kg或更高劑量的GA能顯著降低PCA模型小鼠血管通透性和DIAD模型小鼠血清中TNF-α水平。此外，RBL-2H3細胞研究結(jié)果證明GA可以在安全無毒的劑量下抑制RBL-2H3細胞釋放HEX，說明GA能夠抑制肥大細胞脫顆粒引發(fā)的過敏反應(yīng)。這些結(jié)果進一步證實了GA的抗過敏作用。

關(guān)于更進一步的作用機理，已有一些研究結(jié)果顯示某些信號通路相關(guān)因子（如NF-κB、MAPK、TLRs、PI3K、Akt、TOR等）與GA的抗過敏作用存在關(guān)聯(lián)性[9,23]。但目前對GA抗過敏作用的機制仍然缺乏全面、深入的了解。

相關(guān)研究表明，脫顆粒過程通常依賴于鈣離子的調(diào)控作用，參與調(diào)控的鈣包括來源于胞內(nèi)庫中釋放的鈣離子，也包括由膜通道進入胞內(nèi)的胞外鈣[24]。

TRPC1蛋白是調(diào)控胞內(nèi)庫中鈣離子釋放的關(guān)鍵因子，STIM1蛋白是參與調(diào)控胞外鈣離子進入胞內(nèi)的通道蛋白[13,25]。 本研究發(fā)現(xiàn)在mRNA水平和蛋白水平上，GA處理對TRPC1蛋白和STIM1蛋白的表達均有抑制作用。由此可以推測，GA可能通過調(diào)控鈣離子釋放和轉(zhuǎn)運蛋白因子的表達水平，降低抗原激發(fā)后的胞內(nèi)鈣離子濃度，進而呈現(xiàn)抑制脫顆粒的抗過敏作用，其機制如圖7所示，其中Orai1是參與鈣調(diào)控的一種膜蛋白。

圖 7 GA調(diào)控鈣離子轉(zhuǎn)運機理Fig. 7 Mechanism of action of GA in regulating calcium ion transport

此外，GA對鈣離子的調(diào)控作用也可能直接或間接地抑制小鼠血清中組胺水平升高、血管通透性增大和血清中TNF-α水平增加等過敏反應(yīng)，這還需要展開更加深入的研究。