姜天依,孫 璐,普秋榕,張亞妮,車會(huì)蓮
(北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)
目前,食物過敏性疾病發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)持續(xù)上升[1]。食物過敏是指機(jī)體針對(duì)攝入的食物產(chǎn)生的一種有害、具有復(fù)發(fā)性的特定免疫反應(yīng),以免疫球蛋白E(immunoglobulins E,IgE)介導(dǎo)的食物過敏反應(yīng)為主,即速發(fā)型過敏反應(yīng),也叫I型超敏反應(yīng)[2]。研究發(fā)現(xiàn)一些具有抗氧化性、抗炎作用的生物活性成分(如黃酮類的多酚物質(zhì))具有抗過敏功效[3-5]。
甘草是一種被廣泛應(yīng)用的藥食同源植物,甘草酸(glycyrrhizic acid,GA)是甘草中最重要的活性成分之一,又稱甘草甜素[6]。GA是一種五環(huán)三萜系列皂苷[7], 對(duì)動(dòng)物的免疫功能具有影響作用,可能與其抗炎、抗病毒性相關(guān)[8]。有研究發(fā)現(xiàn),GA在炎癥相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子的核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路中具有關(guān)聯(lián)[9]。
從患有腫瘤的Wistar大鼠體內(nèi)分離克隆得到的大鼠嗜堿性粒細(xì)胞(rat basophilic leukemia cells,RBL)與黏膜肥大細(xì)胞相似,可以在細(xì)胞表面正常表達(dá)IgE高親和力受體,并可被抗原激發(fā)而發(fā)生脫顆粒釋放導(dǎo)致炎癥[10]。β-氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase,HEX)是脫顆粒的一種生物標(biāo)志物,釋放后不會(huì)和組胺一樣很快被分解,其釋放水平通常用作判斷RBL或肥大細(xì)胞的脫顆粒程度[11]。
有研究顯示,激發(fā)過敏反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)過程與胞內(nèi)鈣離子水平密切相關(guān),基質(zhì)交互分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)和瞬時(shí)受體I型電位通道(transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 1,TRPC1)蛋白對(duì)鈣離子釋放、傳導(dǎo)有調(diào) 控作用[12-13]。
目前對(duì)GA的抗過敏作用機(jī)理尚缺乏深入了解。本研究通過建立小鼠被動(dòng)皮膚過敏(passive cutaneous anaphylaxis,PCA)和過敏性皮炎模型來確定GA的抗過敏功效,并在分析GA是否具有降低胞內(nèi)鈣離子水平作用的基礎(chǔ)上,探究鈣離子通道蛋白的表達(dá)水平在GA處理前后的差異,確定GA是否通過影響鈣離子通道蛋白的表達(dá)來影響鈣離子水平。以期為深入探究GA的抗過敏機(jī)理及治療過敏反應(yīng)開拓新的方法。
雌性BALB/c小鼠(生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001),4~5 周齡,體質(zhì)量18~22 g,SPF級(jí),購于維通利華公司。
大鼠RBL白血病細(xì)胞系RBL-2H3購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫,來源于美國(guó)菌類保藏中心,編號(hào)CRL-2256TM,在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素/兩性霉素B的Eagle’s MEM培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。
牛血清白蛋白、小鼠抗二硝基苯酚IgE單克隆抗體、二硝基苯基化人血清白蛋白(dinitrophenylated human serum albumin,DNP-HSA)、伊文思藍(lán)染液 美國(guó)Sigma公司;腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor receptor-α,TNF-α)檢測(cè)試劑盒 美國(guó)eBioscience 公司;小鼠組胺酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒 武漢華美生物工程有限公司;超純RNA提取試劑 日本TaKaRa 公司。
Centrifuge 5804 R型低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;JB5374-91型電子天平 常熟市金羊砝碼儀器有限公司;Varloskan Flash多功能酶標(biāo)儀 美國(guó) Thermo Scientific公司;水浴鍋 德國(guó)Peter Huber K?ltemaschinenbau公司。
1.3.1 雌性BALB/c小鼠PCA實(shí)驗(yàn)
為明確GA的抗過敏功效,本研究建立了雌性BALB/c 小鼠PCA模型,經(jīng)抗原激發(fā)后,檢測(cè)血清中的組胺質(zhì)量濃度,并通過向小鼠耳部注射伊文思藍(lán)染液來檢測(cè)其血管通透性的改變。
參考Zhou Cui等[14]的方法,將50 只BALB/c小鼠正常飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)內(nèi),按體質(zhì)量隨機(jī)分為5 組,每組10 只,分別為陰性對(duì)照組、色甘酸鈉組(50 mg/kgmb)、 G A 低 劑 量 組(1 m g/k gmb)、G A 中 劑 量 組 (10 mg/kgmb)、GA高劑量組(100 mg/kgmb)。
第0天給予小鼠右耳注射抗DNP-IgE致敏,之后連續(xù)3 d,各組動(dòng)物分別灌胃給予生理鹽水、色甘酸鈉以及GA低、中、高3 個(gè)劑量處理,每天1 次。最后1 次灌胃后,尾靜脈注射200 μL抗原DNP-HSA與質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%伊文思藍(lán)染液的混合物(體積比1∶1),激發(fā)小鼠的被動(dòng)過敏反應(yīng)。
抗原激發(fā)20 min后,各組小鼠分別進(jìn)行內(nèi)眥靜脈叢采血,收集于預(yù)先裝有抗凝劑的離心管中。靜置1 h后,經(jīng)2 000hg離心20 min后,吸取上層血清,-80 ℃保存。組胺質(zhì)量濃度采用ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定,具體測(cè)定步驟參照試劑盒說明書,組胺質(zhì)量濃度越高,說明肥大細(xì)胞脫顆粒越嚴(yán)重,PCA反應(yīng)越劇烈。抗原刺激后,觀察小鼠耳部顏色變化。采血后處死小鼠,取鼠耳組織勻漿后浸泡于甲酰胺溶液中,利用分光光度計(jì)分析浸提液630 nm波長(zhǎng)處的吸光度。
1.3.2 雌性BALB/c小鼠過敏性皮炎實(shí)驗(yàn)
為探究GA在治療接觸性過敏性皮炎中發(fā)揮的作用及機(jī)理,建立雌性BALB/c小鼠過敏性皮炎模型,并測(cè)定小鼠耳腫脹程度和血清中TNF-α質(zhì)量濃度。參考 Wang Jing等[15]的方法,將50 只BALB/c小鼠正常飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)內(nèi),隨機(jī)分為5 組,每組10 只,分別為陰性對(duì)照組、模型組以及GA低劑量組(1 mg/kgmb)、 G A 中 劑 量 組(1 0 m g/k gmb)、G A 高 劑 量 組(100 mg/kgmb)。
小鼠于實(shí)驗(yàn)前1 d腹部脫毛,范圍約3 cmh 3 cm,實(shí)驗(yàn)第1天脫毛部位均勻涂以體積分?jǐn)?shù)1%二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB)丙酮橄欖油(丙酮、橄欖油體積比4∶1)溶液50 μL進(jìn)行致敏,實(shí)驗(yàn)第2天重復(fù)強(qiáng)化致敏1 次。首次致敏后當(dāng)天開始灌胃GA溶液0.2 mL,陰性對(duì)照組和模型組給予等體積的生理鹽水,連續(xù)5 d。實(shí)驗(yàn)第5天灌胃后,小鼠雙耳各均勻涂1% DNFB丙酮橄欖油溶液10 μL進(jìn)行激發(fā)。陰性對(duì)照組在相同部位僅涂以丙酮橄欖油溶液作對(duì)照。在激發(fā)前及激發(fā)后24 h,分別用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠雙側(cè)耳中部的厚度,計(jì)算激發(fā)前后的耳厚度差,厚度差越大,說明過敏性皮炎反應(yīng)越劇烈。
小鼠摘眼球取血,分離血清置于-20 ℃冰箱中待測(cè)。采用ELISA試劑盒測(cè)定血清中TNF-α質(zhì)量濃度,TNF-α質(zhì)量濃度越高,說明過敏性皮炎反應(yīng)越劇烈。
1.3.3 HEX釋放水平測(cè)定
參考陳晨等[16]的方法,將5h 105個(gè)/mL的RBL-2H3細(xì)胞以200 μL/孔接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,培養(yǎng)24 h。用PBS洗滌后,加入1 μg/mL抗DNP-IgE(100 μL/孔,用不含胎牛血清的培養(yǎng)液稀釋,陰性對(duì)照孔不加),在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。細(xì)胞給予100 μL/孔不同質(zhì)量濃度(0、100、333、500、1 000 μg/mL)的GA處理20 min后,棄掉上清液,用Tyrode’s緩沖液洗滌2 次,各組依次加入100 ng/mL DNP-HSA(50 μL/孔,Tyrode’s緩沖液稀釋),在37 ℃反應(yīng)45 min,將96 孔板置于冰上冷卻15 min以終止反應(yīng)。轉(zhuǎn)移30 μL上清液至另一個(gè)96 孔板,加入50 μL含1.3 mg/mL 4-硝基苯基-N-乙?;?β-D-氨基葡萄糖的檸檬酸溶液,37 ℃反應(yīng)1 h。加200 μL碳酸鈉緩沖液終止反應(yīng),測(cè)定405 nm波長(zhǎng)處的吸光度。全部釋放組用1% Trition X-100代替過敏原處理細(xì)胞,陰性對(duì)照組用PBS代替過敏原處理細(xì)胞。結(jié)果以HEX釋放率表示,如式(1)所示計(jì)算。
1.3.4 胞內(nèi)鈣離子水平的測(cè)定
參考潘雪刁等的方法[17],將細(xì)胞接種到6 cm的培養(yǎng)皿中,利用1 μg/mL抗DNP-IgE在37 ℃下致敏2 h后,使用D-hank’s緩沖液洗細(xì)胞兩次,之后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中,再?zèng)_洗兩次,以相同密度重懸于1 mL含有2 μmol/L Fluo-3 AM的細(xì)胞染色緩沖液中,37 ℃下避光孵育30 min,沖洗兩次,離心并重懸,將1h 105個(gè)/mL細(xì)胞接種到96 孔板中,刺激之前30 s檢測(cè)基礎(chǔ)Ca2+水平,30 s時(shí)加入100 ng/mL DNP-HSA刺激,連續(xù)測(cè)定5 min,采用全波長(zhǎng)掃描儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處的熒光強(qiáng)度。Ca2+濃度([Ca2+]i)的計(jì)算如公式(2)所示。
式中:Kd為熒光劑與Ca2+形成配合物的解離常數(shù)(400 nmol/L);Fmin是熒光劑沒有結(jié)合Ca2+時(shí)的熒光強(qiáng)度(采用含5 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸的D-hank’s緩沖液處理細(xì)胞);Fmax是熒光劑被Ca2+飽和時(shí)的熒光強(qiáng)度(采用0.1% Triton X-100處理細(xì)胞);F為樣品的熒光強(qiáng)度。
1.3.5 GA對(duì)鈣離子通道蛋白表達(dá)的影響
根據(jù)申婷婷等[18]的方法,經(jīng)過細(xì)胞致敏、GA孵育、抗原刺激后,用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定后,進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),將蛋白以20 μg/孔點(diǎn)樣至質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%~15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。在80 V恒壓下電轉(zhuǎn)印2 h,將蛋白條帶印跡到硝酸纖維素膜上。采用TBST/質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白封閉1 h,加入1∶4 000兔源TRPC1單克隆抗體或1∶4 000兔源STIM1單克隆抗體孵育過夜后,用TBST洗滌6 次(5 min/次)。加入1∶8 000 HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體孵育1 h,用TBST洗滌8 次(5 min/次)。然后加入HRP-DAB增強(qiáng)顯色液進(jìn)行顯色。蛋白表達(dá)量以相對(duì)灰度表示。
1.3.6 GA處理對(duì)STIM1、TRPCmRNA水平的影響
經(jīng)過細(xì)胞致敏、GA孵育、抗原刺激后,用超純RNA提取試劑提取組織樣本中總RNA。實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。用RNase free H2O溶解沉淀,并將RNA溶液保存于-80 ℃冰箱中。取5 μL RNA用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,檢測(cè)RNA的完整性。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的gDNA Eraser對(duì)RNA中殘留的基因組DNA進(jìn)行消化處理。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。對(duì)STIM1、TRPC這兩個(gè)基因使用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀器進(jìn)行檢測(cè)。
采用SPSS 18.0軟件對(duì)測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,采用GraphPad Prism 5.01軟件作圖,其中細(xì)胞實(shí)驗(yàn)n=3、小鼠實(shí)驗(yàn)n=10;P<0.05表示差異顯著。
色甘酸鈉具有抗過敏作用,已作為抗過敏藥品用于臨床治療。本研究通過耳部注射抗DNP-IgE建立了PCA小鼠模型,在給予PCA小鼠色甘酸鈉和GA處理之后,再由小鼠尾靜脈注射伊文思藍(lán)。用甲酰胺溶液提取各組小鼠耳部組織中的伊文思藍(lán)并進(jìn)行吸光度分析,結(jié)果如圖1所示,色甘酸鈉組和不同劑量GA組的吸光度都極顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.01),而100 mg/kgmbGA組顯著低于色甘酸鈉和1 mg/kgmb和10 mg/kgmbGA組。結(jié)果說明GA能夠降低致敏模型小鼠耳部毛細(xì)血管通透性。
圖 1 GA對(duì)PCA小鼠耳部血管通透性的影響Fig. 1 Effect of GA on ear vascular permeability of PCA mice
圖 2 GA對(duì)PCA小鼠血清組胺質(zhì)量濃度的影響Fig. 2 Effect of GA on histamine level in serum of PCA mice
鼠尾靜脈注射抗原后,采血測(cè)定各組PCA小鼠的組胺質(zhì)量濃度。如圖2所示,色甘酸鈉和GA各劑量組PCA小鼠的組胺水平都極顯著低于陰性對(duì)照組 (P<0.01),且對(duì)組胺質(zhì)量濃度的降低效果與GA劑量有正相關(guān)性。在1~100 mg/kgmb范圍內(nèi),GA劑量與抑制肥大細(xì)胞脫顆粒的作用呈現(xiàn)正相關(guān)性。
為評(píng)價(jià)GA對(duì)過敏性腫脹是否有治療、緩解作用,建立了DNFB誘導(dǎo)皮炎(DNFB-induced atopic dermatitis,DIAD)小鼠模型,小鼠耳腫脹度是DIAD小鼠的標(biāo)志癥狀之一。檢測(cè)結(jié)果顯示高劑量GA處理的DIAD小鼠耳厚度顯著低于DNFB組小鼠(P<0.05)(表1)。
表 1 GA對(duì)DIAD小鼠耳腫脹度的影響Table 1 Effect of GA on ear swelling of DIAD mice
圖 3 GA對(duì)DIAD小鼠血清TNF-α質(zhì)量濃度的影響Fig. 3 Effects of GA on TNF-α level in serum of DIAD mice
過敏原激活肥大細(xì)胞后會(huì)產(chǎn)生許多細(xì)胞因子,比如TNF-α,在過敏模型中,TNF-α水平越高表明過敏反應(yīng)越劇烈。對(duì)小鼠血清中TNF-α質(zhì)量濃度的檢測(cè)結(jié)果顯示,GA處理能夠降低DIAD小鼠血清中TNF-α質(zhì)量濃度。 如圖3所示,10 mg/kg或更高劑量GA處理組的TNF-α質(zhì)量濃度極顯著低于DNFB組(P<0.01)。表明GA能夠降低過敏性皮炎小鼠血清的TNF-α質(zhì)量濃度。
圖 4 GA 對(duì)RBL-2H3細(xì)胞釋放HEX的抑制作用Fig. 4 Inhibitory effect of GA on the release of HEX in RBL-2H3 cells
肥大細(xì)胞脫顆粒能引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生過敏癥狀,HEX釋放率是反映細(xì)胞脫顆粒水平的生物指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GA處理能顯著抑制RBL-2H3細(xì)胞的HEX釋放。如 圖4所示,500、1 000 μg/mL的GA處理使HEX的釋放率分別下降37.9%和54.8%,說明GA能抑制肥大細(xì)胞脫顆粒。
GA處理抑制了肥大細(xì)胞脫顆粒,為了探究其作用機(jī)制,本研究測(cè)定了其對(duì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。用鈣離子熒光探針Fluo-3 AM分析IgE致敏的RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。結(jié)果顯示,GA能夠抑制抗原誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+濃度上升。如圖5所示,500 μg/mL和 1 000 μg/mLGA處理顯著降低了細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。說明GA可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響細(xì)胞的脫顆 粒反應(yīng)。
圖 5 GA處 理對(duì)RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)Ca2濃度的影響 Fig. 5 Effect of GA on intracellular Ca2+ level of RBL-2H3 cells
已有研究表明STIM1和TRPC1蛋白對(duì)鈣離子的釋放和傳導(dǎo)有調(diào)控作用。RBL-2H3細(xì)胞經(jīng)過抗DNP-IgE致敏后再進(jìn)行GA處理,并給予DNP-HSA刺激。對(duì)提取的細(xì)胞mRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR分析,結(jié)果表明,GA對(duì)STIM1和TRPC1的mRNA轉(zhuǎn)錄有一定的抑制作用(表2)。
表 2 GA對(duì)STIM1和TRPC1 mRNA表達(dá)水平的影響Table 2 Effect of GA on mRNA levels of STIM1 and TRPC1
圖 6 GA對(duì)STIM1(A)、TRPC1(B)蛋白表達(dá)水平的影響Fig. 6 Effect of GA on the expression levels of STIM1 (A)and TRPC1 (B) proteins
免疫印跡結(jié)果如圖6所示,500 μg/mL和1 000 μg/mL的GA處理顯著降低了細(xì)胞內(nèi)STIM1和TRPC1蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)。這證明GA可能通過調(diào)控鈣離子通道蛋白的表達(dá)來影響胞內(nèi)鈣離子濃度,從而抑制細(xì)胞的脫顆粒及介質(zhì)的釋放。在1 000 μg/mLGA處理的細(xì)胞中,TRPC1表達(dá)水平甚至低于未給予抗原刺激的陰性對(duì)照組,這進(jìn)一步表明GA對(duì)TRPC1表達(dá)有顯著的抑制作用。
組胺在變應(yīng)性鼻炎、支氣管哮喘等過敏引起的呼吸道慢性炎癥性疾病的發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用,具有強(qiáng)烈的疏通血管作用,并能增加毛細(xì)血管和微靜脈的管壁通透性,使血漿漏入組織,導(dǎo)致局部組織水腫[20-21]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),色甘酸鈉的主要作用是穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜、抑制鈣離子內(nèi)流、進(jìn)而抑制抗原激發(fā)后的組胺釋放[22]。
在本研究中,GA處理能夠降低PCA模型小鼠血清中的組胺水平,且10 mg/kgmbGA與50 mg/kgmb色甘酸鈉具有同等的降組胺功效。本研究還顯示10 mg/kg或更高劑量的GA能顯著降低PCA模型小鼠血管通透性和DIAD模型小鼠血清中TNF-α水平。此外,RBL-2H3細(xì)胞研究結(jié)果證明GA可以在安全無毒的劑量下抑制RBL-2H3細(xì)胞釋放HEX,說明GA能夠抑制肥大細(xì)胞脫顆粒引發(fā)的過敏反應(yīng)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了GA的抗過敏作用。
關(guān)于更進(jìn)一步的作用機(jī)理,已有一些研究結(jié)果顯示某些信號(hào)通路相關(guān)因子(如NF-κB、MAPK、TLRs、PI3K、Akt、TOR等)與GA的抗過敏作用存在關(guān)聯(lián)性[9,23]。但目前對(duì)GA抗過敏作用的機(jī)制仍然缺乏全面、深入的了解。
相關(guān)研究表明,脫顆粒過程通常依賴于鈣離子的調(diào)控作用,參與調(diào)控的鈣包括來源于胞內(nèi)庫中釋放的鈣離子,也包括由膜通道進(jìn)入胞內(nèi)的胞外鈣[24]。
TRPC1蛋白是調(diào)控胞內(nèi)庫中鈣離子釋放的關(guān)鍵因子,STIM1蛋白是參與調(diào)控胞外鈣離子進(jìn)入胞內(nèi)的通道蛋白[13,25]。 本研究發(fā)現(xiàn)在mRNA水平和蛋白水平上,GA處理對(duì)TRPC1蛋白和STIM1蛋白的表達(dá)均有抑制作用。由此可以推測(cè),GA可能通過調(diào)控鈣離子釋放和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白因子的表達(dá)水平,降低抗原激發(fā)后的胞內(nèi)鈣離子濃度,進(jìn)而呈現(xiàn)抑制脫顆粒的抗過敏作用,其機(jī)制如圖7所示,其中Orai1是參與鈣調(diào)控的一種膜蛋白。
圖 7 GA調(diào)控鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理Fig. 7 Mechanism of action of GA in regulating calcium ion transport
此外,GA對(duì)鈣離子的調(diào)控作用也可能直接或間接地抑制小鼠血清中組胺水平升高、血管通透性增大和血清中TNF-α水平增加等過敏反應(yīng),這還需要展開更加深入的研究。