電子束輻照對(duì)葵花籽蛋白微觀結(jié)構(gòu)和 水解特性的影響

姜程耀，林松毅,2，李冬梅,2，楊睿雯，孫 娜,2,

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034；3.吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062）

葵花籽是一種重要的油料作物，我國(guó)葵花籽資源豐富，主要用于制油。葵花籽制油后產(chǎn)生的副產(chǎn)物——葵花籽粕富含30%的優(yōu)質(zhì)蛋白[1]，其必需氨基酸的含量（除賴(lài)氨酸外）均高于或接近聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織推薦值[2]，可作為天然植物蛋白的重要來(lái)源，也是生物活性肽的良好來(lái)源，如抗菌肽[3]、抗氧化肽[4]、降壓肽[5-6]。然而，目前葵花籽粕利用率不高，多用作飼料或直接拋棄。因此，有效利用葵花籽副產(chǎn)物對(duì)于葵花籽高值化利用是十分必要的。

輻照是一種常用于食品保鮮和改變食品特性的方法[7]，通過(guò)輻照使食品暴露于非電離和電離狀態(tài)以破壞食物中的微生物、病毒或細(xì)菌的結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到殺菌的效果，輻照還能改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而改變其特性[8]。輻照技術(shù)多應(yīng)用于食物殺菌，目前研究者也逐漸關(guān)注其在改變蛋白質(zhì)特性方面的應(yīng)用[9-12]。有研究通過(guò)γ射線照射大豆蛋白，原蛋白的結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白降解成多肽，多肽重新交聯(lián)、凝聚。這被應(yīng)用于大豆豆粕和濃縮蛋白，γ射線照射提高了豆粕和濃縮蛋白的性能[11]。電子束輻照是輻照技術(shù)的一種，與其他輻照技術(shù)相比，電子束輻照不產(chǎn)生輻射廢料且無(wú)危險(xiǎn)，能夠在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生高能量，并且利用率高、成本低。利用電子束輻照能夠改變蛋白的性能，使其可以被廣泛地應(yīng)用[12]。研究發(fā)現(xiàn)電子束輻照可以改善蛋清蛋白粉、核桃蛋白粉、玉米粉的特性，如熱穩(wěn)定性、水解性、抑制凝膠特性[13-15]。關(guān)于電子束輻照對(duì)葵花籽蛋白性能的影響，目前尚鮮有報(bào)道。

本研究采用脫脂后的葵花籽粕為原料，通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察電子束輻照對(duì)葵花籽蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響，利用低場(chǎng)核磁、激光粒度儀進(jìn)一步探究電子束輻照對(duì)葵花籽蛋白特性的影響和形成原因，為葵花籽粕的高值化利用和電子束輻照的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂葵花籽：壓榨法提油后剩余的部分，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為30.75%，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.3%。

Alcalase FG 2.4 L堿性蛋白酶（酶活力為170 000 U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；三氟乙酸（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純） 美國(guó)Spectrum化學(xué)試劑公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LCQ液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源及Xcalibur1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國(guó)Finnigan公司；1100高效液相色譜系統(tǒng)（配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和 Rev.A.06.03色譜工作站） 美國(guó)惠普公司；10 MeV/15 kW輻照電子直線加速器 長(zhǎng)春易孚輻照加速器有限公司； JSM-6700F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本電子日株式會(huì)社；E-1045型離子濺射儀 日本日立高新技術(shù)有限公司；Zetasizer nano ZS90激光粒度儀 英國(guó)Malvern儀器有限公司；NMI20-030H-1核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）成像分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；ESJ60-4電子天平 沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DK-8D恒溫水浴槽 上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；Starter-300便攜式pH計(jì) 上海奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葵花籽蛋白電子束輻照

參考林松毅等[16]的方法，用高速粉碎機(jī)將脫脂葵花籽打碎成粉，過(guò)100 目篩，稱(chēng)取100 g脫脂葵花籽粉放入塑料自封袋，壓平，放入電子束輻照室，輻照采用10 MeV/15 kW電子加速器，樣品在室溫下進(jìn)行輻照，劑量率為0.5 kGy/h，輻照時(shí)間分別為5、10、15、20 h，對(duì)應(yīng)的輻照劑量分別為2.5、5.0、7.5、10.0 kGy，經(jīng)過(guò)電子束輻照后將樣品放入－80 ℃冰箱保存。

1.3.2 掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)

參考Sun Na等[17]的方法對(duì)電子束輻照處理前后的葵花籽蛋白粉進(jìn)行電子顯微鏡掃描。將潔凈的鋁箔片粘附于樣品臺(tái)上，稱(chēng)取1 mg葵花籽粉樣品置于鋁箔片上，將樣品臺(tái)置于離子濺射儀的樣品艙中，在15 mA的電流下噴金90 s，將樣品臺(tái)裝入電子顯微鏡觀察室，焦距調(diào)至600、2 000 倍，選取清晰視野進(jìn)行觀察。

1.3.3 LF-NMR分析

參考Lin Songyi等[18]的方法對(duì)樣品進(jìn)行低場(chǎng)核磁（low field-NMR，LF-NMR）分析。稱(chēng)取經(jīng)不同輻照處理的樣品2.5 g溶于25 mL蒸餾水中，取3 mL溶液放入玻璃瓶中，將玻璃瓶至直徑為10 mm的核磁管中進(jìn)行檢測(cè)，利用CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈沖序列測(cè)定樣品的自旋-自旋弛豫時(shí)間（T2）。采樣參數(shù)：采用的射頻線圈直徑為60 mm，中心頻率為22 MHz，采樣點(diǎn)數(shù)為1 984 972，質(zhì)子共振頻率為22 Hz，CPMG序列測(cè)定T2弛豫時(shí)間，半回聲時(shí)間（90°脈沖到100°脈沖的時(shí)間）為0.6 ms。

1.3.4 葵花籽肽粉的制備與分析

參考Lin Songyi等[19]的方法，將輻照后的葵花籽粉溶于蒸餾水中，得到質(zhì)量濃度為5 g/100 mL的溶液，在90 ℃保溫10 min，冷卻至45 ℃，加入1 mmol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8，并保持pH值穩(wěn)定，加入3 000 U/g堿性蛋白酶水解3 h（保持pH值恒定），將pH值調(diào)至中性，在90 ℃水浴下滅酶10 min。冷卻至室溫，10 000 r/min離心15 min，取上清液，將所得的上清液冷凍干燥后所得物質(zhì)即為葵花籽蛋白肽粉。

水解度參考文獻(xiàn)[20]采用pH-stat法測(cè)定，以滴定葵花籽蛋白肽所消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液體積，按照公式（1）計(jì)算水解度[20]。

式中：V表示維持pH值恒定為8所消耗的NaOH的體積/mL；c表示NaOH的濃度/（mmol/L）；m表示被水解的蛋白質(zhì)量/g；hmt表示蛋白質(zhì)中肽鍵的總數(shù)/（mmol/g）；α表示水解過(guò)程中葵花籽蛋白中的α-氨基的解離度，具體按公式（2）計(jì)算。

式中：pH表示當(dāng)前溶液的pH值；pK表示水解過(guò)程中釋放的α-氨基的平均解離度，取決于溫度、肽鏈長(zhǎng)度和末端氨基酸的性質(zhì)。

參考Lin Songyi等[21]的方法，采用激光粒度儀測(cè)定樣品肽的粒度，每份樣品測(cè)定3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用獨(dú)立樣品的t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量輻照的葵花籽蛋白粉微觀結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

由圖1所示，未經(jīng)過(guò)輻照的葵花籽蛋白粉形狀完整，表面圓潤(rùn)光滑，邊界明顯；經(jīng)2.5 kGy輻照后，表面開(kāi)始出現(xiàn)凹凸不平，但仍然保持完整的顆粒結(jié)構(gòu)；當(dāng)輻照量增至5.0 kGy后，樣品表面破碎、凹凸不平。當(dāng)輻照強(qiáng)度達(dá)到7.5 kGy時(shí)，樣品表面完整性遭到破壞，邊界不明顯，呈破碎狀。研究結(jié)果與Jin Yan[14]、Xue Peiyu[15]等的報(bào)道結(jié)果一致，說(shuō)明輻照會(huì)改變蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)，破壞其表面結(jié)構(gòu)完整性，而且輻照劑量越大，破壞程度越高。Lee等[22]發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象與蛋白分子和氧自由基的相互作用有關(guān)，輻照會(huì)使水產(chǎn)生氧自由基，氧自由基可以促進(jìn)蛋白表面發(fā)生斷裂，從而使蛋白更易破碎。

圖 1 不同劑量輻照后的葵花籽蛋白粉的掃描電子顯微鏡圖Fig. 1 Scanning electron microphotographs of sunflower seed protein powder irradiated by different doses of EBI

2.2 不同劑量輻照后的葵花籽蛋白粉的LF-NMR結(jié)果

圖 2 經(jīng)不同輻照劑量處理的葵花籽蛋白粉的LF-NMR圖譜Fig. 2 LF-NMR curves of sunflower seed protein powder irradiated by different doses of EBI

LF-NMR是一種新型的無(wú)損檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)T2弛豫時(shí)間的變化能夠推測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)的變化。由圖2可以看出，根據(jù)弛豫時(shí)間的不同可分為3 種氫質(zhì)子組分，包括結(jié)合水、吸附水、自由水[23]。結(jié)合水是指與蛋白分子緊密結(jié)合的水，在圖中對(duì)應(yīng)弛豫時(shí)間為1～5 ms，用T21表示；吸附水是指與蛋白分子表面結(jié)合的水，在圖中對(duì)應(yīng)弛豫時(shí)間為10～90 ms，用T22表示；自由水是指蛋白質(zhì)分子周?chē)挠坞x水，在圖中對(duì)應(yīng)弛豫時(shí)間為100～1 000 ms，用T23表示，相應(yīng)峰面積可以表征對(duì)應(yīng)水分含量。弛豫時(shí)間和振幅隨著輻照劑量的變化而變化。

圖 3 經(jīng)不同輻照劑量處理的葵花籽蛋白粉的結(jié)合水、吸附水、 自由水峰面積Fig. 3 Peak area of bound water, adsorbed water and free water of sunflower seed protein powder irradiated by different doses of EBI

圖 4 經(jīng)不同輻照劑量處理的葵花籽蛋白粉總水峰面積Fig. 4 Peak area of total water of sunflower seed protein powder irradiated by different doses of EBI

從圖3可以看出，葵花籽蛋白粉中主要成分為自由水，其次是結(jié)合水和吸附水，與未經(jīng)輻照處理的葵花籽蛋白粉相比，經(jīng)輻照處理的葵花籽蛋白粉的自由水含量有降低的趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；總水分含量發(fā)生顯著降低（P＜0.05），且不同輻照劑量處理的葵花籽蛋白粉之間總水分含量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（圖4）。結(jié)果表明，輻照處理可以降低葵花籽蛋白粉的水分含量。Schmid等[24]研究表明輻照可以使蛋白聚集和交聯(lián)，不同劑量的輻照產(chǎn)生不同的能量，由此導(dǎo)致蛋白產(chǎn)生不同程度的變性、聚集，使水分含量降低。

2.3 輻照對(duì)葵花籽蛋白水解度的影響

用蛋白酶水解蛋白是獲得活性多肽的主要途徑，水解度是衡量蛋白水解情況的重要指標(biāo)[25]。本研究采用堿性蛋白酶水解葵花籽蛋白，分析不同輻照劑量對(duì)葵花籽蛋白水解度的影響，其水解度如圖5所示。隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，未輻照和輻照后的葵花籽蛋白的水解度均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。同一水解時(shí)間，0～5.0 kGy葵花籽蛋白的水解度無(wú)顯著差異（P＞0.05），而輻照強(qiáng)度7.5～10.0 kGy組葵花籽蛋白的水解度顯著高于0～5.0 kGy處理組（P＜0.05）。水解180 min時(shí)，未經(jīng)電子束輻照的葵花籽蛋白的水解度為19.33%，7.5 kGy輻照處理使葵花籽蛋白的水解度增加到了24.67%，說(shuō)明高于7.5 kGy劑量的電子束輻照可促進(jìn)葵花籽蛋白的水解。本研究結(jié)果與Jin Yan[14]、Bak[26]、Karthika[27]等的結(jié)果一致，即電子束輻照可以增強(qiáng)蛋清蛋白、稻秸、木質(zhì)纖維素的水解。可能是由于輻照產(chǎn)生的自由基破壞了底物的結(jié)構(gòu)，使多肽鏈斷裂，增加了酶與底物的接觸面積，促進(jìn)了酶解反應(yīng)的進(jìn)行[28]。結(jié)合掃描電子顯微鏡、LF-NMR結(jié)果，7.5 kGy劑量的電子束輻照破壞了葵花籽蛋白粉的表面結(jié)構(gòu)完整性，增強(qiáng)了其水解特性。

圖 5 經(jīng)不同輻照劑量處理的葵花籽蛋白的水解度Fig. 5 Hydrolysis degree of sunflower seed protein irradiated by different doses of EBI

2.4 不同輻照劑量的葵花籽蛋白肽的粒徑分析結(jié)果

圖 6 經(jīng)不同輻照劑量處理的葵花籽蛋白肽的粒徑Fig. 6 Particle sizes of sunflower seed peptide irradiated by different doses of EBI

將不同劑量輻照后的葵花籽蛋白粉進(jìn)行酶解后，采用激光粒度儀測(cè)定葵花籽蛋白肽粒徑大小。由圖6可知，與未經(jīng)輻照處理的樣品相比，當(dāng)輻照劑量小于5 kGy時(shí)，經(jīng)過(guò)輻照處理的葵花籽蛋白肽的粒徑?jīng)]有發(fā)生顯著性變化（P＞0.05），輻照劑量由5.0 kGy增加至7.5 kGy時(shí)，葵花籽蛋白肽的粒徑顯著降低（P＜0.05），由（490.4±20.8）nm降低至（263.3±39.2）nm。本研究結(jié)果與葵花籽蛋白的水解度變化趨勢(shì)一致，輻照劑量達(dá)到7.5 kGy時(shí)，葵花籽蛋白的水解度最高，產(chǎn)生的蛋白肽粒徑最小，10.0 kGy處理組粒徑與7.5 kGy處理組粒徑差異不顯著（P＞0.05）；說(shuō)明高于7.5 kGy劑量的輻照處理促進(jìn)葵花籽蛋白的酶解反應(yīng)，使其水解產(chǎn)生粒度更小的肽。同樣地，Morales等[29]也發(fā)現(xiàn)輻照會(huì)引起粒度分布的變化。Lee等[30]報(bào)道過(guò)輻照會(huì)使蛋白構(gòu)象產(chǎn)生不可逆的變化，包括斷裂、聚集或交聯(lián)。結(jié)合掃描電子顯微鏡結(jié)果，說(shuō)明電子束輻照可能造成蛋白斷裂，經(jīng)酶解后產(chǎn)生粒度更小的肽。

3 結(jié) 論

本研究采用電子束輻照技術(shù)對(duì)葵花籽蛋白進(jìn)行非熱加工處理，發(fā)現(xiàn)輻照會(huì)改變葵花籽蛋白微觀結(jié)構(gòu)，破壞其表面結(jié)構(gòu)完整性，造成穿孔和破碎，而且輻照劑量越大，破壞程度越高。經(jīng)2.5 kGy輻照后葵花籽蛋白粉表面出現(xiàn)很多孔隙，開(kāi)始變得凹凸不平，但仍然保持完整的顆粒結(jié)構(gòu)；當(dāng)輻照強(qiáng)度達(dá)到7.5 kGy時(shí)，樣品表面完整性遭到破壞，邊界不明顯，呈破碎狀。然而，輻照劑量達(dá)到7.5 kGy以上時(shí)，葵花籽蛋白的水解度增加，促進(jìn)其水解產(chǎn)生粒度更小的葵花籽蛋白肽，說(shuō)明電子束輻照提高了葵花籽蛋白的水解特性。本研究結(jié)果為電子束輻照在改善蛋白質(zhì)性能方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。