半乳糖基月桂酸單甘酯對短小芽孢桿菌的 抑制機(jī)理

許苗苗，訾玉祥，陸兆新，呂鳳霞，張 充，別小妹，趙海珍

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）是導(dǎo)致食物腐敗和食源性疾病爆發(fā)的原因之一[1-3]。Song Jianghua等[4]首次報(bào)道甜瓜的細(xì)菌性腐爛與短小芽孢桿菌密切相關(guān)。到目前為止，已從眾多產(chǎn)品中分離得到短小芽孢桿菌，如：堿性發(fā)酵的Ntoba Mbodi[5]、乳膠乳[6]、奶粉和可可粉[7]、商業(yè)駱駝奶[8]、馬鈴薯[9]等。除此之外，短小芽孢桿菌還可引起蔬菜的軟腐病[10]；有的菌株甚至還可產(chǎn)生具有致病性的pumilacidin，有患者因食用未加熱的大米而產(chǎn)生急性中毒癥狀，經(jīng)檢測該大米中含有大量的短小芽孢桿菌（105CFU/g）[11]。因而，尋找一種新型的抗菌劑來控制短小芽孢桿菌的污染和感染是至關(guān)重要的。

近年來，具有廣譜抗菌性、高效性、安全性和穩(wěn)定性的天然食品添加劑受到越來越多的關(guān)注。且研究發(fā)現(xiàn)生物表面活性劑有較好的抑菌活性，特別是糖脂類生物表面活性劑，如鼠李糖脂[12]、脂肪酸糖脂[13-14]和槐糖脂[15]都表現(xiàn)出抗菌活性。

甘油糖脂是糖脂的一種，由一個(gè)或多個(gè)糖殘基通過糖基鍵連接到含有甘油殘基的脂質(zhì)部分[16]，是藍(lán)細(xì)菌和植物葉綠體的類囊體膜的常見成分[17]。糖脂的主要類型是單半乳糖二酰基甘油（monogalactosyl diacylglycerol，MGDG）、二半乳糖基二?；视停╠igalactosyl diacylglycerol，DGDG）和磺酸基二?；视停╯ulfonic acid diacylglycerol，SQDG）[18]。 這些糖脂中的每一種都具有不同的生物活性，例如抗真菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎和抗菌特性[19-20]。Cateni等[21]合成了具有中長脂肪酸酰基鏈的單半乳糖基甘油二酯，并檢測了它們對革蘭氏陽性、革蘭氏陰性細(xì)菌和真菌的抑菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有1,2-二取代和辛酰鏈結(jié)構(gòu)的糖酯生物活性是最好的。Martins等[22]從Carpobrotus edulis中分離出一種單半乳糖二?；视?，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌COLOXA和金黃色葡萄球菌HPV107具有良好的抗菌活性。El Baroty等[23]研究了5 種海藻中糖脂的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)所有藻類的糖脂均具有中等的抗菌活性。其中，由于Taonia atomaria中含有大量的生育三烯酸，故其糖脂對所有測試微生物均表現(xiàn)出較高的抑制活性。Pongmuangmul等[24]發(fā)現(xiàn)來自Clinacanthus nutans的MGDG和DGDG顯示出抗單純皰疹病毒活性，半抑制濃度為36～43 μg/mL。Ahamed等[25]發(fā)現(xiàn)來自O(shè)scillatoria acuminataNTAPC05的棕櫚酰（MGDG-棕櫚酰）單半乳糖二酰基甘油顯示出對3 種超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extendedspectrumβ-lactamases，ESBL）產(chǎn)生細(xì)菌（大腸桿菌U655、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌B929和腸桿菌B938）的殺菌活性，最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為100 μg/mL。

據(jù)了解，目前缺乏有關(guān)糖基甘油酯介導(dǎo)的抑制短小芽孢桿菌生物活性及作用機(jī)制的報(bào)道。在之前的研究中，合成了一系列3-O-β-D-吡喃半乳糖基-sn-甘油，并對其抗菌活性進(jìn)行了初步探索。研究發(fā)現(xiàn)，3-O-β-D-吡 喃半乳糖基-sn-甘油的單月桂酸酯（1-O-月桂基-3-Oβ-D-吡喃半乳糖基-sn-甘油和6’-O-月桂基-3-O-β-D-吡喃半乳糖-sn-甘油的混合物）顯示出良好的抗菌活性[26]。本實(shí)驗(yàn)旨在評價(jià)半乳糖基月桂酸單甘酯（monogalactosyl monolaurate，MGML）對短小芽孢桿菌的抗菌活性，并研究其作用機(jī)制。通過生長抑制曲線、細(xì)胞膜的通透性及完整性、DNA和蛋白的變化等指標(biāo)來評價(jià)MGML對短小芽孢桿菌的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

短小芽孢桿菌（B. pumilus）ATCC7061，保存于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室。將斜面培養(yǎng)的菌株挑取1～2 環(huán)接種至NB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)12 h，以2%的接種量接種至新鮮的營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至12 h，以獲取細(xì)菌懸液。NB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏3 g/L、氯化鈉5 g/L，pH（7.2f 0.2），121 ℃滅菌20 min。

MGML是1-O-月桂基-3-O-β-D-吡喃半乳糖基-sn-甘油和6’-O-月桂基-3-O-β-D-吡喃半乳糖-sn-甘油的混合物（物質(zhì)的量比為1∶1），在實(shí)驗(yàn)室中合成及純化（純 度≥98%）；MGML工作溶液在甲醇中制備。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、K＋和Ca2＋濃度測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外-可見分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 MIC的測定

通過肉湯微量稀釋法[27]測定MGML對短小芽孢桿菌的MIC。將100 μL新鮮NB培養(yǎng)基與系列稀釋的不同質(zhì)量濃度的MGML在96 孔板中混合均勻，然后加入100 μL細(xì)菌懸浮液（OD600nm＝0.5），使MGML的終質(zhì)量濃度分別為5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、 0.039 mg/mL。以相同體積甲醇（體積分?jǐn)?shù)小于1%）作為對照。將96 孔板放置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用酶標(biāo)儀測定600 nm波長處的吸光度。MIC定義為在培養(yǎng)后未觀察到可見生長的MGML的最低質(zhì)量濃度。

1.3.2 MGML對短小芽孢桿菌生長曲線的影響

根據(jù)Wu Yanping等[28]的方法略作修改測定MGML對短小芽孢桿菌生長曲線的影響。取培養(yǎng)至對數(shù)期的短小芽孢桿菌（2 mL）和不同質(zhì)量濃度的MGML溶液，加入到100 mL新鮮的NB培養(yǎng)基中，使MGML的終質(zhì)量濃度為156.5 μg/mL和0.313 μg/mL（即0.5 MIC和1 MIC）。以相同體積的甲醇（體積分?jǐn)?shù)小于1%）作為對照。置于37 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h取樣，測定OD600nm。通過時(shí)間與OD600nm的關(guān)系來繪制生長曲線。

1.3.3 MGML對細(xì)胞膜滲透性的影響

為了確定MGML對短小芽孢桿菌細(xì)胞膜滲透性的影響，測定了細(xì)胞外K＋和Ca2＋的濃度。向培養(yǎng)至對數(shù)期的短小芽孢桿菌（1h 107CFU/mL）加入MGML（0、156.5 μg/mL和313.0 μg/mL即0、0.5 MIC和1.0 MIC），37 ℃、180 r/min培養(yǎng)，分別于0、30、60、120、180 min取樣。以相同體積的甲醇作對照。將取出的樣品于4 ℃、5 000 r/min離心5 min，收集上清液，用相應(yīng)的試劑盒測定K＋和Ca2＋的濃度。

1.3.4 MGML對細(xì)胞膜完整性的影響

根據(jù)Zhao Lei等[29]方法進(jìn)行一些修改，通過測定細(xì)胞上清液中細(xì)胞成分含量的變化來評估細(xì)胞膜的完整性。將培養(yǎng)至對數(shù)期的短小芽孢桿菌在4 ℃、5 000 r/min離心5 min，收集菌體并用無菌生理鹽水洗滌3 次，離心后重懸于無菌生理鹽水中。將細(xì)菌懸浮液與不同質(zhì)量濃度的MGML溶液（156.5 μg/mL和313.0 μg/mL，即0.5 MIC和1.0 MIC）混合，并在37 ℃下孵育。以相同體積的甲醇作對照。分別于0、1、2、4、6、8、10、12、14 h后取樣，取樣后于4 ℃、5 000 r/min離心5 min，得到上清液，經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾。過膜后通過測定OD260nm和OD280nm的變化來確定細(xì)胞內(nèi)核苷酸和蛋白質(zhì)的泄漏。

1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察

向培養(yǎng)至對數(shù)期（1h 107CFU/mL）的短小芽孢桿菌（B. pumilus）菌懸液中加入不同濃度的半乳糖基月桂酸單甘酯，使其終濃度為0.5、1.0 MIC，37 ℃、180 r/min分別培養(yǎng)2 h取樣，4 ℃、2 500 r/min離心10 min，用磷酸鹽緩沖液洗3 次，棄上清液，用體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液4 ℃過夜固定。以相同體積的甲醇作對照。用磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，依次用50%、70%、90%和100%乙醇進(jìn)行梯度脫水，每次脫水時(shí)間為5～10 min。脫水結(jié)束后，用乙醇-叔丁醇溶液（1∶1，V/V）置換20 min，最后用體積分?jǐn)?shù)100%叔丁醇置換2 次，每次20 min。置換后將樣品進(jìn)行冷凍干燥處理，干燥后的樣品進(jìn)行離子濺射儀噴鍍后，掃描電子顯微鏡觀察、拍照。

1.3.6 MGML對細(xì)菌基因組的影響

收集對數(shù)期的短小芽孢桿菌并用新鮮的NB培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞懸液（OD600nm＝0.5）。向菌懸液中加入不同質(zhì)量濃度的MGML（156.5、313.0、939.0 μg/mL，即0.5、1.0 MIC和3.0 MIC），置于37 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，以相同體積的甲醇作對照。分別于0、30、60、180 min取樣，按細(xì)菌基因組提取試劑盒的說明提取細(xì)菌DNA。在室溫下進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳（125 V、30 min），電泳結(jié)束溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色20 min，用凝膠成像儀觀察。

1.3.7 DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)

在Gao Yan等[30]的紫外光譜法和熒光光譜法的基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整，研究MGML與DNA的相互作用。

1.3.8 紫外光譜檢測

收集對數(shù)期的短小芽孢桿菌用于DNA提取。檢測提取的DNA，得到A260nm/A280nm＞1.8，符合實(shí)驗(yàn)要求。調(diào)整DNA質(zhì)量濃度（30 ng/mL）后，將不同質(zhì)量濃度的MGML（0、93.9、156.5、313.0、626.0、939.0 μg/mL，即0、0.3、0.5、1.0、2.0 MIC和3.0 MIC）加入到DNA溶液中，于37 ℃反應(yīng)30 min，檢測混合物在200～400 nm間的紫外吸收光譜。

1.3.9 熒光光譜檢測

通過熒光光譜法測定EB和DNA反應(yīng)的最佳比例。固定EB的質(zhì)量濃度為50 ng/μL，將不同質(zhì)量濃度的DNA（44、84、94、104、114 ng/μL）與EB溶液混合，置于37 ℃反應(yīng)30 min，使用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光信號。設(shè)置激發(fā)波長為535 nm，掃描范圍為550～800 nm。

向EB-DNA復(fù)合體系中加入不同質(zhì)量濃度的MGML（0、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0 MIC），置于37 ℃反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后在激發(fā)波長535 nm、掃描范圍550～800 nm條件下測定熒光光譜。

1.3.10 蛋白電泳檢測

將Zhang Yu等[31]方法加以修改，測定短小芽孢桿菌可溶性菌體蛋白條帶和分子質(zhì)量的變化。即在不同質(zhì)量濃度的MGML（156.5、313.0、939.0 μg/mL，即0.5、1.0、3.0 MIC）處理下，將對數(shù)期的短小芽孢桿菌在37 ℃、180 r/min分別培養(yǎng)30、60、120 min。以相同體積的甲醇作為對照。取樣后，于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，棄去上清液，磷酸鹽緩沖液清洗3 次。將菌體沉淀重懸于無菌蒸餾水中，加入20 μL蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱5 min。冷卻至室溫后，8 000 r/min離心10 min，取15 μL上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色，脫色完成后進(jìn)行拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均做3 次生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)表示為平均 值±標(biāo)準(zhǔn)差，SAS 8.0程序用于統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MGML對短小芽孢桿菌的MIC

甘油糖脂，一種兩親性非離子糖脂，具有抗菌和表面活性劑的特性。對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、白色念珠菌和黑曲霉均表現(xiàn)出抗菌活性，MIC范圍為 60～80 μg/mL[23]；而且對產(chǎn)生ESBL的大腸桿菌U655、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌B929和腸炎菌腸桿菌也有很好的抑制作用，MIC為100 μg/mL[25]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，MGML對短小芽孢桿菌的MIC為313 μg/mL（0.718 mmol/L），高于早期報(bào)道的抑制其他微生物的MIC[23]，但低于鼠李糖脂對短小芽孢桿菌的MIC（大于1.6 mmol/L）[32]。

2.2 生長抑制曲線

圖 1 MGML對短小芽孢桿菌生長曲線的影響Fig. 1 Effect of MGML on cell growth of B. pumilus

由圖1可知，短小芽孢桿菌在2 h后開始進(jìn)入對數(shù)生長期，并在16 h到達(dá)穩(wěn)定期；當(dāng)培養(yǎng)基中加入0.5 MIC MGML時(shí)，細(xì)菌生長緩慢，延滯期延長，8 h后才開始進(jìn)入對數(shù)期，說明低質(zhì)量濃度的MGML可能干擾短小芽孢桿菌細(xì)胞的合成代謝；而當(dāng)MGML的質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 MIC時(shí)，培養(yǎng)基中未出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，無菌體生長，表明短小芽孢桿菌細(xì)胞的生長被完全抑制。該結(jié)果與鼠李糖脂對單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑制[33]相似。此外，還可觀察到MGML對短小芽孢桿菌的生長抑制作用呈現(xiàn)出質(zhì)量濃度-時(shí)間依賴性。

2.3 細(xì)胞膜的通透性

圖 2 短小芽孢桿菌細(xì)胞外K＋（A）和Ca2＋（B）濃度Fig. 2 Effect of MGML on extracellular K+ (A) and Ca2+ (B) concentrations from B. pumilus cells

通過測定細(xì)胞外K＋和Ca2＋的含量來判斷MGML對短小芽孢桿菌細(xì)胞膜的通透性是否有影響。由圖2可知，與對照組相比，經(jīng)MGML處理后，上清液中K＋和Ca2＋的濃度顯著增加（P＜0.05）。由圖2A可知，處理組中 K＋的釋放量隨MGML質(zhì)量濃度增加和作用時(shí)間的延長呈上升的趨勢；圖2B表示Ca2＋的釋放量隨作用時(shí)間變化的曲線，前30 min內(nèi)Ca2＋的釋放量顯著增加（P＜0.05），30～180 min變化相對平緩。由此可知，K＋和Ca2＋的釋放量均與MGML的質(zhì)量濃度和處理時(shí)間呈正相關(guān)，證明MGML增加了短小芽孢桿菌細(xì)胞膜的滲透性，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的K＋和Ca2＋外泄。

2.4 MGML對細(xì)胞膜完整性的影響

細(xì)胞膜是細(xì)菌的天然保護(hù)屏障。正常條件下，細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)和核苷酸（包括DNA和RNA）不能穿透膜。但當(dāng)細(xì)菌暴露于某些抗菌劑時(shí)，細(xì)胞膜的完整性將受到損害，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放到外部環(huán)境中，使其在260 nm和280 nm波長處的紫外吸收增加[29]。 因此，260 nm和280 nm波長處的紫外吸收可作為評估細(xì)胞膜完整性的指標(biāo)。圖3顯示了MGML存在和不存在情況下短小芽孢桿菌細(xì)菌上清液的紫外吸收，對照組的吸光強(qiáng)度基本無變化；用MGML處理后，260 nm和280 nm波長處的吸光強(qiáng)度明顯均明顯增加，且隨著MGML作用時(shí)間延長和質(zhì)量濃度的增加，吸光值增加越明顯，表明細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)（核酸和蛋白質(zhì)）釋放量增加，細(xì)胞膜破裂程度增加。結(jié)果與來自銅綠假單胞菌OBP1的鼠李糖脂對金黃色葡萄球菌（MTCC 3160）和肺炎克雷伯菌（MTCC 618）細(xì)胞膜損傷[34]的報(bào)道一致。表明MGML可能破壞短小芽孢桿菌細(xì)胞膜的完整性。

圖 3 MGML作用后短小芽孢桿菌260 nm（A）和280 nm（B）波長處 紫外吸收物質(zhì)的變化Fig. 3 Effect of MGML on leakage of UV-absorbing substances at 260 nm (A) and 280 nm (B) of B. pumilus

2.5 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

圖 4 MGML處理2 h后短小芽孢桿菌的掃描電子顯微鏡圖Fig. 4 Scanning electron micrographs of B. pumilus treated by MGML

由圖4可知，對照組短小芽孢桿菌菌體呈完整狀態(tài)，細(xì)胞邊緣整齊、輪廓清晰，呈均勻的短桿狀，菌體表面可觀察到細(xì)小的顆粒狀物質(zhì)；經(jīng)MGML作用后，菌體形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)褶皺，向內(nèi)凹陷、輪廓變得模糊，菌體表面的顆粒狀物質(zhì)消失，這些顆粒狀物質(zhì)可能是菌體分泌的胞外多糖[35]，由于MGML的加入影響了細(xì)菌胞外多糖的合成或分泌；且隨質(zhì)量濃度的增加，菌體出現(xiàn)穿孔和斷裂現(xiàn)象，可使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄，最終可導(dǎo)致菌體死亡。此電子顯微鏡結(jié)果與前面離子和大分子物質(zhì)泄漏結(jié)果相一致，表明MGML作用于短小芽孢桿菌后可使其細(xì)胞膜的通透性改變。

2.6 MGML對短小芽孢桿菌基因組DNA合成的影響

圖 5 MGML處理后短小芽孢桿菌基因組DNA的葡聚糖凝膠電泳圖Fig. 5 Agarose gel electrophoresis of DNA from B. pumilus treated with different concentrations of MGML

通過葡聚糖凝膠電泳觀察MGML對短小芽孢桿菌基因組DNA合成的影響。如圖5所示，用MGML處理不同時(shí)間后短小芽孢桿菌的基因組未出現(xiàn)彌散狀態(tài)，表明MGML沒有讓基因組DNA產(chǎn)生斷裂現(xiàn)象[35]。作用時(shí)間為30 min時(shí)，基因組無明顯變化；但隨作用時(shí)間的延長，處理組的細(xì)菌DNA條帶強(qiáng)度變淡變窄，且隨著質(zhì)量濃度增加和時(shí)間的延長，效果越明顯。DNA條帶減弱的原因可能是MGML可以改變細(xì)胞膜的通透性使細(xì)胞內(nèi)的DNA釋放到細(xì)胞外，導(dǎo)致DNA含量降低，這與細(xì)胞成分釋放的結(jié)果一致（圖3）；還可能是MGML進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)影響DNA的合成[36]，從而導(dǎo)致DNA含量降低。

2.7 DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由于MGML具有透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的潛力，可能與DNA發(fā)生作用，因此通過紫外光譜和熒光光譜研究MGML與DNA之間的相互作用。

通常，小分子物質(zhì)與DNA的非共價(jià)相互作用涉及3 種結(jié)合模式：嵌入、溝槽結(jié)合和核酸分子表面上的長矩組裝[38]。紫外吸收光譜法是研究小分子物質(zhì)與核酸相互作用最方便有效的方法之一?；衔锝Y(jié)合DNA后，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的變化和空間構(gòu)型的改變可反映在光譜上。增色效應(yīng)與減色效應(yīng)是與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的光譜學(xué)特性[30,39]。因此，用紫外光譜法研究MGML與DNA的相互作用。圖6A顯示，當(dāng)DNA質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨著MGML質(zhì)量濃度的增加，其最大吸收峰豐度也隨之增強(qiáng)，出現(xiàn)了明顯的增色效應(yīng)，這可能與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的損傷有關(guān)[30]。表明MGML可能與DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)作用，影響其行使正常功能。

EB競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)用于進(jìn)一步證明MGML與短小芽孢桿菌DNA之間的相互作用。由光譜學(xué)性質(zhì)可知，游離的EB和DNA在水性環(huán)境下熒光強(qiáng)度非常低，而當(dāng)EB與DNA結(jié)合后可使熒光強(qiáng)度明顯增大。因此，使用EB作為熒光探針研究DNA與MGML之間的相互作用。為確定DNA-EB的最佳比例，固定EB的質(zhì)量濃度為 50 ng/μL，改變DNA的質(zhì)量濃度（44、84、94、104、114 ng/μL）。圖6B顯示，隨著DNA質(zhì)量濃度的增加，體系的熒光強(qiáng)度逐漸增加，當(dāng)DNA質(zhì)量濃度不小于 94 ng/μL時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度不再變化，即當(dāng)DNA-EB質(zhì)量濃度比為1.88∶1時(shí)，系統(tǒng)達(dá)到飽和狀態(tài)。

固定DNA-EB的質(zhì)量濃度比為1.88∶1，向其中加入不同質(zhì)量濃度的MGML（圖6C）。可觀察到隨著MGML質(zhì)量濃度的增加發(fā)生了明顯的熒光猝滅現(xiàn)象，且質(zhì)量濃度越大，效果越明顯。據(jù)報(bào)道，EB與DNA結(jié)合是典型的插嵌模型，結(jié)合常數(shù)為2h 106L/mol[39]。因而用MGML取代EB是不可能的，所以，熒光猝滅可能是由于MGML與DNA-EB復(fù)合物的結(jié)合，并且溝槽結(jié)合可能是重要的結(jié)合模式[28]。

圖 6 MGML與DNA的相互作用Fig. 6 Interactions between MGML and DNA

2.8 SDS-PAGE分析結(jié)果

圖 7 用MGML處理和未處理的短小芽孢桿菌的細(xì)胞可溶性 蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖譜Fig. 7 SDS-PAGE profiles of cellular soluble proteins from B. pumilus treated and untreated with MGML

由圖7可知，經(jīng)MGML處理后的蛋白圖譜與對照組的蛋白圖譜明顯不同。對于小分子蛋白（小于14.4 kDa），隨著作用時(shí)間的延長和MGML質(zhì)量濃度的增加，蛋白條帶減弱甚至消失，這可能是由于細(xì)胞膜受損將小分子蛋白質(zhì)泄漏到外部環(huán)境中，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量降低，這與細(xì)胞成分釋放到無細(xì)胞上清液中蛋白質(zhì)含量變化結(jié)果一致（圖3）。相反，隨著作用時(shí)間延長和MGML質(zhì)量濃度的增加，大分子蛋白（25 kDa）的條帶變得更亮，可能與細(xì)胞膜受損有助于大分子蛋白的提取有關(guān)。比較處理組與對照組，當(dāng)其他大分子蛋白條帶灰度隨著作用時(shí)間延長和MGML質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)時(shí)，一條約25 kDa的蛋白條帶灰度減弱，表明MGML可能還會干擾或阻斷細(xì)菌某些蛋白質(zhì)的合成[29]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過MIC、細(xì)菌生長曲線、細(xì)胞膜完整性、掃描電子顯微鏡及菌體DNA和蛋白質(zhì)的變化，研究了MGML對短小芽孢桿菌的抑菌機(jī)理。結(jié)果表明，MGML的MIC為0.313 mg/mL，可對短小芽孢桿菌產(chǎn)生較明顯的抑制作用；各指標(biāo)測定結(jié)合掃描電子顯微鏡結(jié)果表明，MGML可使細(xì)胞膜的通透性增大，破壞細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄，影響菌體正常生長代謝，最終導(dǎo)致菌體死亡；DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，MGML可對菌體DNA產(chǎn)生影響，從而影響菌體分裂繁殖，抑制細(xì)菌的生長。

這些結(jié)果表明，MIC的MGML作為抗短小芽孢桿菌菌株的抗菌劑是有效的，MGML可以作為食品工業(yè)中一種潛在的生物食品防腐劑，為其向天然、安全的方向發(fā)展提供理論參考和研究思路。