口腔鱗狀細胞癌穩(wěn)定過表達蛋白酶體激活因子PA28γ細胞株的構(gòu)建

辛川 王冏珂 李敬 曾昕

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院黏膜病科，成都 610041

頭頸部癌癥是第六大最常見的癌癥類型，其中90%是鱗狀細胞癌[1]?？谇击[狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是最常見的頭頸部鱗狀細胞癌，估計全世界每年有35萬例新發(fā)病者和17萬人因此死亡[2]。其中男性發(fā)病率比女性高得多[3]。盡管近年在診斷和治療方面取得了進展，但疾病復(fù)發(fā)仍然很常見，5年生存率不超過50%[4]。

PA28γ（又稱REGγ、11Sγ、PSME3）最早在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并且命名為Ki抗原，之后的研究[5]表明其屬于PA28家族，是一種與非泛素化和非ATP依賴的降解蛋白質(zhì)密切相關(guān)的蛋白酶體激活因子。已發(fā)現(xiàn)PA28γ在甲狀腺、結(jié)腸、肝臟、肺、卵巢、腎細胞癌和胃癌等多種不同類型的癌癥中均有過表達[6-8]。課題組前期采用差異蛋白組學(xué)分析，篩選出52種蛋白在OSCC組織中的表達水平與正常組織有顯著差異，其中一種蛋白是PA28家族蛋白，其生物功能和相互作用網(wǎng)絡(luò)分析表明該家族蛋白PA28γ可能在癌變中起重要作用[6,9]。并應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測了3個獨立隊列共368例OSCC組織中PA28γ的表達水平，發(fā)現(xiàn)其中179個OSCC組織的PA28γ高表達，且PA28γ高表達與較低的總存活率密切相關(guān)，隨后TCGA數(shù)據(jù)庫印證了該結(jié)果[9]。因此，本研究建立了PA28γ穩(wěn)定過表達OSCC細胞株，并鑒定其過表達PA28γ的效率，為深入研究PA28γ對口腔癌發(fā)生發(fā)展過程的影響及探究其分子機制提供準備。

1 材料和方法

1.1 細胞株、質(zhì)粒、菌株及主要試劑

人OSCC細胞系HSC-3細胞、293T細胞、感受態(tài)大腸埃希菌Trans5α菌株（四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點實驗室），慢病毒質(zhì)粒pLOV.CMV.cherry.2A.EF1a.PuroR購自上海紐恩生物科技有限公司，Taq酶和dNTP、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DL2000 DNA Marker（Takara公司，日本），內(nèi)切酶（NEB公司，美國），小抽試劑盒（Promega公司，美國），1 kp DNA ladder Marker（Fermentas公司，加拿大），引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成，陽性克隆測序由華大基因（深圳華大基因股份有限公司）完成。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司，日本）。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quan titative polymerase chain reaction，qPCR）核酸擴增檢測系統(tǒng)試劑盒（Applied Biosystems公司，美國）。

1.2 PA28γ過表達慢病毒載體的構(gòu)建

1.2.1 引物設(shè)計合成及目的基因片段的獲得 擴增PA28γ基因序列的引物，正向：5'-AACCCCGGTCCGATGGCTAGCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGGCCTCGCTGAAGGTGG-3'，反向：5'-AGGGCGGCCGCTCAGTCTAGATCAGTACAGAGTCTCTGCATTG-3'。抽提HSC-3細胞的基因組DNA，以之為模板，利用上述引物和聚合酶鏈反應(yīng)（poly merase chain reaction，PCR）擴增PA28γ，以限制性內(nèi)切酶NheⅠ與xbaⅠ酶切并回收目的基因片段。

1.2.2 載體的構(gòu)建與鑒定 用限制性內(nèi)切酶Nhe Ⅰ與xba Ⅰ在37 ℃條件下酶切載體pLOV.CMV.cherry.2A.EF1a.PuroR 2 h后切膠回收獲得線性化表達載體，可表達櫻桃紅色PA28γ蛋白，然后將上述獲得的目的基因片段連接入線性化表達載體，反應(yīng)條件：線性化載體DNA和酶切純化的PCR產(chǎn)物各5 μL（40 ng·μL-1），順序于37 ℃ 孵育15 min，50 ℃孵育15 min。將連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞，涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基的平板上孵育過夜，挑取陽性單克隆菌落，先進行菌落的PCR鑒定，然后再對陽性的克隆進行測序和比對分析，比對正確的即為構(gòu)建成功的質(zhì)粒。

1.2.3 慢病毒包裝與濃縮 以lipofectamine 2000試劑介導(dǎo)的瞬時感染方法轉(zhuǎn)染293T細胞，8 h后去除培養(yǎng)基，以2 mL PBS洗滌殘余的感染混和物，然后加入含血清的新鮮細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集并離心濃縮細胞上清液。

1.2.4 病毒滴度測定與感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值的測定 病毒滴度測定與MOI值的測定參考本課題組之前的方法[10]。

1.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選

接種于6孔培養(yǎng)板，每個孔內(nèi)接種2×105個目的細胞，鋪板時細胞的融合率為50%，每孔培養(yǎng)基體積為2 mL；進行病毒感染時細胞的融合度為70%。取出凍存在-150 ℃的病毒，從培養(yǎng)箱中拿出細胞，吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，換新鮮培養(yǎng)基。根據(jù)以確定的MOI值的1/4，計算所需病毒液體積，準確加入相應(yīng)培養(yǎng)皿。在培養(yǎng)基中加入10 μL的聚凝胺（ploybrene，終濃度為5 μg·mL-1）來提高病毒的感染效率。混勻后孵育過夜。用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。藥物篩選濃度的確定方法：目標細胞鋪板于24孔板，嘌呤霉素濃度梯度（0、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5 μg·mL-1）加入孔板，觀察細胞死亡情況，3～4 d時細胞全部死亡的孔，相應(yīng)的藥物濃度即為篩穩(wěn)轉(zhuǎn)株所需濃度。此時，可開始加藥篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。對照組同時加藥。根據(jù)細胞狀態(tài)每2～3 d換液。直到出現(xiàn)抗性克隆為止。挑取至少5個抗性克隆擴大培養(yǎng)，并鑒定目的基因蛋白表達。對照設(shè)置為空載體。

提取細胞的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以PA28γ引物擴增PA28γ目的基因，所得產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，得到500 bp目的條帶。將質(zhì)粒送與深圳華大基因股份有限公司進行測序鑒定，結(jié)果顯示目的基因序列正確。

1.4 PCR檢測

在10 cm培養(yǎng)皿中收獲PA28γ穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，離心去除培養(yǎng)液加入1 mL Trizol，室溫 5 min， 吹打細胞使之充分裂解。加入CHCl3（按 0.2 mL CHCl3/1.0 mL Trizol的比例加入），劇烈振蕩，室溫放置10 min。4 ℃、12 000 g 離心 15 min，取上層水相轉(zhuǎn)移至另一新的EP管中。加入異丙醇混勻，室溫靜置 5～10 min。4 ℃、12 000 g離心10 min，棄上清，75%乙醇重懸RNA沉淀。4 ℃、7 500 g離心 5 min，棄上清，管壁上的液滴用槍頭吸出，然后室溫放置10 min以使殘留的液體揮發(fā)干凈（可以看到RNA由白色變?yōu)榘胪该鳎?。加?0～30 μL RNA酶free水溶解RNA，立即使用或-80 ℃保存。按Takara試劑盒說明書進行RNA逆轉(zhuǎn)錄操作，按TaqMan?fast Adanced Master Mix試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)體系。將混合好的PCR反應(yīng)液加入96孔板中，封膜、離心并上機。

1.5 Western blot檢測

收獲HSC-3穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，離心去除培養(yǎng)液，加入細胞裂解液裂解后提取蛋白并測濃度，取 50 μg蛋白與5×Loading buffer混合煮沸5 min，進行凝膠電泳，結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)印的方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜上，用含5%的牛奶封閉1 h，加入1 000×稀釋的PA28γ抗體室溫孵育過夜，TBST 洗滌15 min×3次，加入5 000×稀釋的標記的山羊抗兔IgG室溫孵育1 h，TBST洗滌15 min×3次，用DAB顯色試劑盒顯色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 19.0軟件進行分析，組間比較用Student-t檢驗，P＜0.05為組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建PA28γ慢病毒載體

通過PCR反應(yīng)擴增目的基因PSME3（表達PA28γ蛋白的基因）片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后在500～750 bp處可見明亮的目的條帶（圖1左）。對固體LB培養(yǎng)板上的陽性單克隆菌落進行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后于1 400 bp處可見明亮的單一條帶，載體大小與預(yù)期長度一致（圖1右）。

2.2 鑒定PA28γ慢病毒載體序列正確及成功獲得慢病毒包裝液

將篩選出來的陽性重組克隆菌落挑于液體LB培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進行測序分析，并與PA28γ基因片段或其反向互補序列比對，可見完全匹配，未見堿基缺失或突變等異常（圖2）。

2.3 成功建立穩(wěn)定過表達PA28γ的HSC-3細胞系

HSC-3是OSCC細胞之一，其生長迅速、細胞侵襲遷移能力強，可以在小鼠體內(nèi)成瘤，適合進行研究各類OSCC功能，因此選用HSC-3構(gòu)建PA28γ過表達細胞系。在融合度為30%～40%的HSC-3細胞中加入病毒液共培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)基更換為含2 μg·mL-1嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基。加入篩選培養(yǎng)基24 h后鏡下觀察，空白對照組細胞死亡90%，空載對照組和實驗組細胞死亡10%。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，空白對照組細胞完全死亡，轉(zhuǎn)入病毒的空載對照組和實驗組細胞不再死亡。因此認為，本研究中病毒轉(zhuǎn)染和篩選效率＞80%，可篩選到目的細胞。挑取至少5個抗性克隆，擴大培養(yǎng)并鑒定目的基因和蛋白表達，對照設(shè)置為空載體。

圖1 PA28γ過表達載體的構(gòu)建Fig 1 Construction of PA28γ overexpression vector

圖2 PA28γ慢病毒載體的鑒定Fig 2 Identification of PA28γ overexpression vectors

2.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中PA28γ蛋白顯著高表達

采用鏡下熒光觀察可見穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中櫻桃紅色熒光（圖3）。qPCR和Western blot結(jié)果（圖4）顯示：與空白對照組相比，穩(wěn)定過表達PA28γ的HSC-3細胞系中PA28γ表達量顯著增加，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），以上結(jié)果提示PA28γ穩(wěn)定 過表達細胞株構(gòu)建成功。

圖3 PA28γ過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染HSC-3細胞后紅色陽光蛋白檢測 × 100Fig 3 Red florescence protein detection of PA28γ overexpression HSC-3 cells × 100

圖4 PA28γ過表達HSC-3細胞后PA28γ蛋白（上）和mRNA（下）的表達水平Fig 4 Protein(top) and mRNA(down) expression level in PA28γ overexpression HSC-3 cells

3 討論

近年來，有文獻[7]表明PA28γ作為一種癌基因在人類各種癌癥中起著重要的作用。PA28γ可參與多種信號通路來影響癌癥發(fā)展，如腎癌患者PA28γ升高，與預(yù)后不良有關(guān)。敲除腎細胞癌PA28γ基因后，可使ck1ε不被降解，從而激活Hippo信號通路[7]。PA28γ是皮膚腫瘤發(fā)生的癌基因，TPA通過激活MAPK/p38信號通路誘導(dǎo)PA28γ過表達[8]。PA28γ通過增強與mdm2-p53的相互作用，促進抑癌基因p53的泛素化和降解來達到抗凋亡作用[11]。

另外PA28γ還可以和20S蛋白酶體特異結(jié)合成PA28γ-20S，其在細胞生長過程中起著非常重要的作用。最近的研究[9]表明PA28γ在調(diào)節(jié)細胞周期和細胞增殖中起著重要作用。PA28γ還與腫瘤的發(fā)展和病毒的感染相關(guān)。敲除PA28γ可導(dǎo)致小鼠體型縮小和細胞特異性有絲分裂缺陷[12]。抑制PA28γ具有增強能量饑餓對腫瘤殺傷的作用[13]。PA28γ和PA200在男性生育中起著不可或缺的作用[14]。PA28γ可促進MDM2介導(dǎo)的p53降解，而突變型p53（p53-r248q）可以上調(diào)子宮內(nèi)膜癌中PA28γ的表達[15]。PA28γ可抑制病毒復(fù)制，并且維持病毒潛伏期[15]。研究表明，PA28γ在抑制細胞凋亡，促進細胞周期進程[1]，DNA損傷修復(fù)[16]等方面有重要作用。

作為11s蛋白酶體激活劑家族的一員，最初PA28γ被認為是通過激活20S蛋白酶體來促進未折疊蛋白質(zhì)和模型肽底物的降解[7]。后有學(xué)者[17]報道PA28γ可降解完整蛋白SRC-3?，F(xiàn)已鑒定與細胞周期、凋亡和腫瘤進展相關(guān)的PA28γ靶蛋白包括p21、p16、p19、p53及MDM2[18]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)PA28γ在OSCC進程中起到重要作用，參與對OSCC細胞遷移、侵襲和血管形成能力的調(diào)控。促進口腔癌向更具侵襲性的方向發(fā)展，并且對OSCC的死亡風(fēng)險有很好的預(yù)測作用[9]。

PA28γ蛋白在細胞內(nèi)含量較低，現(xiàn)市面上缺乏高效價的蛋白抗體，而且口腔癌細胞因過角化導(dǎo)致外源載體質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)染效率較低，成為研究PA28γ在OSCC細胞中功能的瓶頸。為了更深入的研究PA28γ功能及作用機制，急需構(gòu)建PA28γ穩(wěn)定過表達細胞株。由于HSC-3生長迅速、細胞侵襲遷移能力強、可在小鼠體內(nèi)成瘤，適合進行研究各類OSCC功能，因此本研究選用HSC-3構(gòu)建PA28γ過表達細胞系。本研究通過分子克隆得到PA28γ基因，并將其成功克隆至pLOV.CMV.cherry.2A.EF1a.PuroR空載體。通過慢病毒包裝系統(tǒng)制備了攜有PA28γ基因的病毒，然后將其感染HSC-3細胞，通過嘌呤霉素篩選成功獲得表達PA28γ的HSC-3穩(wěn)轉(zhuǎn)株。為研究OSCC中PA28γ的作用途徑及靶點提供了細胞系。PA28γ蛋白三級結(jié)構(gòu)尚不清楚，其復(fù)雜多樣的生物學(xué)功能尚待進一步探究，未來可通過構(gòu)建PA28γ轉(zhuǎn)基因鼠及OSCC轉(zhuǎn)移模型，進一步研究其未知功能。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。