lmo2672基因缺失對LM在不同環(huán)境下生物被膜形成的影響

李 杰，孟慶玲，喬 軍，伍曄暉，王熙鳳，王立霞，才學鵬

(1.石河子大學 動物科技學院，新疆石河子 832003；2.中國農業(yè)科學院 蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046)

單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)是一種重要的食源性人獸共患病原菌，人類通過食用被LM污染的食物發(fā)生感染，引起孕婦流產，幼兒或免疫能力低下者感染腦膜炎，胃腸炎等嚴重疾病[1-2]。LM具有強大的環(huán)境適應能力，能耐受高溫、酸、堿、滲透壓、乙醇和氧化應激等各種脅迫環(huán)境[3]。

生物被膜(Biofilm,BF)是細菌通過分泌的多糖、蛋白質等代謝產物粘附于生物或非生物表面形成的膜樣結構[4-5]?，F有的研究發(fā)現，BF可增強細菌的耐藥性和環(huán)境應激抵抗能力，從而影響細菌的毒力[6]?，F有的研究發(fā)現，agr群體感應系統(tǒng)參與LM BF的調控[7]，agr基因座由4個基因組成，其中agrB負責膜蛋白的表達，它與Sps共同作用可將agrD表達的肽段轉化為成熟的自誘導肽(AIP)；agrC和agrA形成一個轉導信號的雙組分系統(tǒng)，當細胞外AIP濃度達到一定閾值時，通過群體感應激活agrC-agrA系統(tǒng)，被激活的系統(tǒng)調節(jié)BF形成相關基因的表達[8-10]。有研究證實，agr位點基因突變降低了LM粘附于非生物表面形成BF的能力[11-12]，BF陰性菌株agr基因座表達水平顯著低于BF陽性菌株[10]。

細菌BF形成與其AraC家族轉錄調控因子密切相關。AraC家族轉錄調控因子在許多菌中已被報道參與細菌BF的形成[13-14]，然而在LM菌中尚未見報道。因此，本研究利用同源重組技術構建LM-△lmo2672缺失株，分析比較LM EGD-e親本株和LM-△lmo2672缺失株在不同溫度、滲透壓、膽酸鹽、H2O2等環(huán)境中BF生成量的差異，利用qRT-PCR檢測BF相關基因(agrA，agrB，agrC，agrD)的轉錄水平，探討lmo2672基因在LM BF形成中的作用，為進一步了解LM AraC家族在調控BF的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

LM EGD-e菌株由德國伍茲堡大學W.Goebel教授惠贈；pKSV7由石河子大學動物科技學院微生物實驗室保存；pMD19-T載體，T4連接酶，限制性酶切酶KpnⅠ，PstⅠ，DL 5000 DNA marker，DL 2000 DNA marker購自TaKaRa公司；基因組DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒及質粒小提試劑盒購自TIANGEN生化技術有限公司；氯霉素，膽汁酸鹽購自Sigma公司；BHI培養(yǎng)基青島海博生物科技有限公司，氯化鈉購自天津盛奧生物試劑公司。

1.2 引 物

根據NCBI中LM EGD-e的基因序列(登錄號：AL591824.1)，利用Primer 5.0軟件設計LM缺失株構建過程中所涉及的引物及BF相關基因的qRT-PCR引物，其中R1和R4 5′端分別添加KpnⅠ、PstⅠ酶切位點及保護性堿基(斜體下劃線部分)(表1)。

表1 本研究中所用引物Table 1 List of primer sequences used in this study

1.3 LM-△ lmo2672缺失株的構建

1.3.1 重組穿梭質粒pKSV7-△lmo2672的構建 按照細菌基因組DNA提取試劑盒步驟提取LM EGD-e菌株的基因組DNA，用R1/R2和R3/R4兩對引物分別擴增出目的片段的上、下游同源臂。以上、下游同源臂為模板，通過SOE-PCR技術融合上下游同源臂，獲得缺失目的基因的融合片段，將融合片段和pKSV7同時提質粒，經KpnⅠ和PstⅠ雙酶切后用T4連接酶過夜連接，構建重組穿梭質粒pKSV7-△lmo2672。

1.3.2 LM-△lmo2672缺失株的構建與鑒定 將pKSV7-△lmo2672在2.5 kV，5.0 ms條件下電轉至LM感受態(tài)中，用R1/R4引物鑒定陽性克隆，并將陽性菌在氯霉素和42 ℃雙重抗性下連續(xù)傳代進行同源重組，用旁外側引物R5/R6引物檢測確定獲得缺失株；將缺失株在無氯霉素抗性， 37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)20代并檢測其遺傳穩(wěn)定性。

1.4 lmo2672基因缺失對LM在不同環(huán)境中BF形成能力的影響

利用微孔板法制備BF。將過夜培養(yǎng)的LM EGD-e和LM-△lmo2672分別離心收集菌體，用新鮮的BHI培養(yǎng)基調整OD600至0.2，分別吸取200 μL菌液加入96孔微孔板，放置于不同溫度(4 ℃，30 ℃和37 ℃)；用含5% NaCl、8% NaCl、0.3%膽酸鹽、5 mmol/L H2O2的BHI培養(yǎng)基調整OD600至0.2，放置于37 ℃培養(yǎng)到指定時間后，棄去培養(yǎng)基并用無菌水洗滌微孔板3次，充分洗凈孔內浮游菌體，室溫干燥以去除微孔板中液體；加入結晶紫染色，用酶標儀測定OD570nm以代表BF生成量。每個樣品設置5個重復。

1.5 lmo2672缺失對LM BF相關基因轉錄水平的影響

參考Rieu等[11]設計的BF相關基因qRT-PCR引物。將待測菌液用新鮮的BHI培養(yǎng)基接種于六孔板中，分別放置于4 ℃，30 ℃；或用含5% NaCl、8% NaCl、0.3%膽酸鹽、5 mmol/L H2O2的BHI培養(yǎng)基接種于六孔板中，在37 ℃培養(yǎng)24 h，收集BF狀態(tài)下的細菌進行總RNA提取，并根據反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，利用NanoDrop 2000分光光度計測定cDNA質量濃度，以統(tǒng)一質量濃度的cDNA為模板，以管家基因rpoB和16S rRNA作為內參，在LightCycler 480儀器上進行qRT-PCR，結果根據2-△△CT的方法計算4對BF相關基因(agrA，agrB，agrC，agrD)的相對轉錄水平。

1.6 數據統(tǒng)計

所有試驗均重復3次，采用GraphPad Prism 5.0進行組間差異顯著性分析，數據采用“平均值±標準誤”表示。P<0.05(*)被認為差異顯著，P<0.01(**)被認為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 重組穿梭質粒pKSV7-△ lmo2672構建及鑒定

分別擴增目的基因上、下游同源臂，可擴增出638 bp和698 bp的條帶，經SOE-PCR后，得到 1 336 bp的融合片段，條帶大小與預期結果相符(圖1)；將融合片段與pKSV7載體連接，雙酶切后條帶大小與理論相符，表明已成功構建重組穿梭質粒pKSV7-△lmo2672(圖2)。

M.DNA maker(DL2000);1-3.上下游臂融合片段 Fusion segments of upstream and downstream regions; 4.陰性對照 Negative control

圖1lmo2672基因上下游臂SOE-PCR擴增
Fig.1 Amplification oflmo2672gene by SOE-PCR

M.DNA maker(DL2000 Plus); 1.pKSV7-Δlmo2672雙酶切產物 Products of the pKSV7-Δlmo2672by double enzyme digestion; 2.pKSV7-△lmo2672質粒 Recombinant plasmid pKSV7-Δlmo2672; 3.pKSV7空質粒 Empty plasmid pKSV7

圖2 pKSV7-△lmo2672雙酶切鑒定
Fig.2 Identification of pKSV7-△lmo2672by double enzyme

2.2 LM-△ lmo2672缺失株的篩選及遺傳穩(wěn)定性的鑒定

利用R5/R6引物篩選能擴增出大小為 1 502 bp條帶的重組菌株，獲得LM-△lmo2672缺失株(圖3)；在37 ℃、無氯霉素抗性的培養(yǎng)基中繼續(xù)傳20代，R5/R6引物檢測均可擴增出 1 502 bp單一片段(圖4)，表明LM-△lmo2672具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

M.DNA maker(DL2000); 1.陽性對照 Positive control； 2-4.LM-△lmo2672重組菌旁外側引物檢測結果 PCR products of the recombinant LM-△lmo2672; 5.陰性對照 Negative control

圖3 旁外側引物對LM-△lmo2672重組菌的鑒定
Fig.3 Identification of LM-△lmo2672by PCR

2.3 lmo2672缺失對LM在不同環(huán)境中BF生成能力的影響

在37 ℃時，兩株菌所形成的BF沒有顯著差異(P>0.05)；但在4 ℃和30 ℃，LM-△lmo2672BF生成量均顯著低于LM EGD-e(P<0.05)(圖5-A)；在5%和8% NaCl中，與LM EGD-e相比，LM-△lmo2672BF生成量顯著減少(P<0.05)(圖5-B)；在5 mmol/L H2O2和 0.3%膽酸鹽中，LM-△lmo2672BF生成量減少，顯著低于LM EGD-e(P<0.05)(圖5-C)，表明lmo2672缺失能降低LM在不同環(huán)境中BF的形成量。

M.DNA maker(DL2000);1-2.陽性對照 Positive control;3.陰性對照 Negative control

圖4 LM-△lmo2672缺失株遺傳穩(wěn)定性鑒定
Fig.4 Genetic stability analysis of recombinantstrain of LM-△lmo2672

2.4 lmo2672缺失對LM在不同階段BF形成能力的影響

在培養(yǎng)24 h時，LM-△lmo2672所形成的BF交聯(lián)程度弱于LM EGD-e，但差異不顯著(P>0.05)；在48 h時，LM-△lmo2672生物被膜著色厚度以及形成量極顯著低于LM EGD-e(P<0.01)(圖6)，表明lmo2672基因參與LM BF的形成。

2.5 lmo2672缺失對LM BF相關基因轉錄水平的影響

在4 ℃和30 ℃，LM-△lmo2672中4個與BF形成相關基因的表達量均顯著低于LM EGD-e(P<0.05)(圖7-A、圖7-B)；在高滲透壓環(huán)境中，LM-△lmo2672agrA和agrB基因表達量顯著低于LM EGD-e(P<0.05)(圖7-C、圖7-D)，且隨著滲透壓的升高，LM-△lmo2672BF相關基因的表達量發(fā)生降低；在氧化環(huán)境中，agrC基因表達量顯著低于LM EGD-e(P<0.05)(圖7-E)；在膽酸鹽環(huán)境中，LM-△lmo2672BF形成相關基因的表達量均極顯著低于LM EGD-e(P<0.01)(圖7-F)，表明lmo2672缺失后BF形成相關基因的表達受到抑制。

圖5 LM EGD-e和LM-△ lmo2672在不同脅迫環(huán)境中的BF形成Fig.5 Biofilm formation by LM EGD-e and LM-△ lmo2672 under various conditions

3 討 論

LM是一種重要的食源性致病菌，由于其對各種環(huán)境壓力的強耐受性和BF形成的能力使其在加工設備表面上殘留并形成BF，因此在動物源性食品生產和加工中極易被污染[15-16]，給動物性食品安全造成較大威脅[17-18]?，F有研究認為，AraC家族轉錄調控因子介導細菌BF相關基因的轉錄調控[13-14]，在許多細菌BF形成過程中發(fā)揮重要的調控，然而關于LM中AraC家族轉錄調控因子lmo2672是否影響LM BF形成目前尚不清楚。

細菌BF的形成一般分為初始粘附、不可逆粘附、微菌落形成、成熟、播散期5個階段[19]。在非生物表面孵化的24 h之前是細菌形成BF粘附的重要時期，在48 h后被認為是BF形成的成熟期[10,20]。本研究發(fā)現，在37 ℃培養(yǎng)24 h時，LM-△lmo2672缺失株與LM EGD-e 親本株BF形成量差異不顯著；但在48 h時LM-△lmo2672生物被膜生成量以及BF著色程度顯著低于LM EGD-e，提示lmo2672可能在BF成熟期中發(fā)揮作用。

A.在24 h，48 h時LM BF OD570的測定 Biofilm of LM biofilm determined by OD570at 24 h and 48 h,respectively;B.在24 h，48 h時LM顯微鏡下BF結構 Formation of biofilm by LM at 24 h and 48 h,respectively.

圖6lmo2672基因缺失對LM在不同時間BF形成的影響
Fig.6 Effects oflmo2672gene deletion at different times on biofilm formation of LM

A-F.分別為4 ℃，30 ℃，5% NaCl，8% NaCl，5 mmol/L H2O2和0.3%膽酸鹽中BF相關基因轉錄水平檢測 Relative transcriptional levels of genes related to biofilm formation at 4 ℃,30 ℃,5% NaCl,8% NaCl,5 mmol/L H2O2and 0.3% bile salts,respectively

圖7 LM EGD-e和LM-△lmo2672在不同應激環(huán)境中BF相關基因相對轉錄水平的檢測
Fig.7 Relative transcriptional levels of genes related to biofilm formation under differentenvironmental stresses in LM EGD-e and LM-△lmo2672

BF形成受多種因素的影響，其中溫度對BF的形成影響較大[17,21]。Di Bonaventura等[17]分析44株LM分離株在不同溫度下BF形成情況，發(fā)現隨著溫度降低，LM形成的BF組織結構越稀疏；Chavant等[22]研究表明，LM在37 ℃時對聚四氟乙烯表面有定植能力，但在8 ℃時則沒有。本研究證實，在37 ℃更有利于LM形成BF，而在4 ℃和30 ℃時，LM-△lmo2672生物被膜生成量顯著低于LM EGD-e。qRT-PCR結果證實，隨著溫度的降低，LM-△lmo2672生物被膜相關基因的表達量逐漸下降，在4 ℃和37 ℃ 4個基因的表達量均顯著低于LM EGD-e，表明lmo2672基因缺失后導致LM在低溫下BF的形成能力降低，且BF相關基因的表達也受到抑制。

已有研究表明，AraC調控因子通過調控相關基因的表達影響表皮葡萄球菌、糞腸球菌等BF的形成[23-24]。本研究利用結晶紫染色法制備BF，比較LM EGD-e和LM-△lmo2672在高滲透壓、膽酸鹽、H2O2環(huán)境中BF生成量的差異，證實LM-△lmo2672BF形成量在不同應激環(huán)境下均顯著降低，進一步qRT-PCR發(fā)現，lmo2672基因缺失后，LM-△lmo2672agr系統(tǒng)基因表達量也出現降低，其中在膽汁酸鹽環(huán)境中4個BF相關基因的表達量顯著降低，在滲透壓中，agrA和agrB基因表達量顯著降低，在氧化環(huán)境中，agrC基因表達量顯著降低，提示lmo2672基因可能通過調控agr系統(tǒng)中相關基因的表達來降低LM BF的形成能力。

總之，本研究證實LM-△lmo2672缺失株在不同環(huán)境中BF形成量顯著降低，且BF相關基因的表達受到抑制，表明AraC家族轉錄調控蛋白lmo2672在LM BF形成過程中發(fā)揮重要作用，為揭示AraC家族調控因子在LM BF形成能力中的作用提供理論依據。