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    交鏈格孢菌EST-SSR信息分析與分子標(biāo)記通用性評(píng)價(jià)

    2020-02-07 12:05:26丁換云魏迎鳳陳小飛
    關(guān)鍵詞:鏈格孢菌基元

    丁換云,魏迎鳳,陳小飛

    (塔里木大學(xué) 植物科學(xué)學(xué)院,新疆阿拉爾 843300)

    鏈格孢屬真菌是一類(lèi)極為常見(jiàn)的真菌,在自然界中分布較廣,對(duì)生態(tài)環(huán)境和基質(zhì)的適應(yīng)性強(qiáng),既是重要的植物病原菌又是人和動(dòng)物的條件致病菌,同時(shí)又是非常有應(yīng)用潛力的生物資源。目前已發(fā)現(xiàn)的鏈格孢菌有近500種,并且每年都有很多新種被陸續(xù)報(bào)道,只有對(duì)其進(jìn)行正確分類(lèi),才能更好地對(duì)其進(jìn)行研究和利用[1]。鏈格孢屬真菌種內(nèi)形態(tài)變異性較大,并且不同生物學(xué)性狀和不同地理分布的菌株致病力差異也很大[2]。因此,開(kāi)發(fā)出可用于鏈格孢菌分類(lèi)鑒定和遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記,具有十分重要的理論和實(shí)踐意義。

    近年來(lái),已有多種分子標(biāo)記應(yīng)用于鏈格孢菌遺傳多樣性研究。姚亮亮[3]運(yùn)用RAPD和AFLP技術(shù)研究黑龍江省鏈格孢屬真菌遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)真菌RAPD組群與寄主植物和分離地區(qū)之間沒(méi)有相關(guān)性,而AFLP組群與寄主植物之間有一定相關(guān)性,但與分離地區(qū)之間沒(méi)有相關(guān)性。祖艷青[4]運(yùn)用ISSR和RAPD標(biāo)記技術(shù)研究河南省煙草赤星病菌及內(nèi)生鏈格孢菌的遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)兩種標(biāo)記均能檢測(cè)出煙草赤星病菌及相關(guān)鏈格孢菌株的遺傳多樣性。Paul等[5]運(yùn)用RAPD技術(shù)對(duì)來(lái)自加利福利亞導(dǎo)致番茄壞死的69個(gè)A.alternata菌株進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)可以將菌株劃分為兩個(gè)RAPD組群,且各組群與地理來(lái)源沒(méi)有關(guān)聯(lián)。

    A.alternata的近緣種A.tenuissima也是一種對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害較大的植物病原真菌,常引起多種植物病害[6-8]。黎妍妍等[9]對(duì)A.tenuissima等4種鏈格孢屬真菌進(jìn)行生物學(xué)特性研究,發(fā)現(xiàn)4種鏈格孢菌存在著致病性差異。朱海霞等[10]研究A.tenuissima對(duì)闊葉雜草的致病性,發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)豬秧秧、藜致病效果突出。然而至今,國(guó)內(nèi)外依然未見(jiàn)有關(guān)鏈格孢菌EST-SSR方面的研究 報(bào)道。

    本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法,從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的A.alternataEST序列中篩選SSR,分析其在A.alternata轉(zhuǎn)錄組中的分布特點(diǎn),在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)A.alternataEST-SSR引物,分析其在近緣種A.tenuissima中的有效性、多態(tài)性和通用性,以期為深入開(kāi)展鏈格孢菌分類(lèi)學(xué)、比較基因組學(xué)以及功能基因組研究提供科學(xué)的依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    供試菌株:細(xì)極鏈格孢A.tenuissima分離于新疆維吾爾自治區(qū)不同地區(qū)不同寄主,共38株。其中從梨黑斑病樣本分離到5菌株,包括阿拉爾市2株,民豐縣1株,尉犁縣1株,洛浦縣1株;從蘋(píng)果褐斑病樣本中分離到12菌株,其中疏勒縣3株,葉城縣3株,皮山縣2株,阿拉爾2株,阿克陶縣2株;從沙棗黑斑病樣本分離到13株,其中烏魯木齊5株,庫(kù)爾勒3株,民豐縣3株,阿拉爾三棵樹(shù)村1株,第一師五團(tuán)1株;從杏黑斑病樣本上分離到4株,其中阿拉爾3株,策勒縣1株;從新和縣核桃鏈格孢葉斑病樣本分離到4株。

    馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g,定容至1 L。

    試劑及儀器:Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(真菌)、2×SanTaqPCR Mix、Sterilized ddH2O、DNA Marker D、Ready-to-use、6×loadingbuffer、15% ficoll、Agarose B,購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;Mastercycler pro梯度PCR儀、熒光和化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng),購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;DYY-12型電泳儀,購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1A.alternataEST-SSR信息分析 從NCBI的EST數(shù)據(jù)庫(kù)下載A.alternata的EST序列,運(yùn)用軟件Phred (http://www.phrap.org/consed/consed.html#howToGet)除去長(zhǎng)度小于100 bp的序列,運(yùn)用軟件Phrap(http://www.phrap.org/consed/consed.html#howToGet)除去載體序列及重復(fù)序列,然后拼接得到較高質(zhì)量的EST序列,最后運(yùn)用SSRHunter 1.3軟件結(jié)合人工查找,對(duì)A.alternata的EST序列中的SSR位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為:含二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基,并且重復(fù)基元長(zhǎng)度大于等于12 bp(二堿基重復(fù)次數(shù)≥6次、三堿基重復(fù)次數(shù)≥4次、四堿基重復(fù)次數(shù)≥3次、五堿基重復(fù)次數(shù)≥3次、六堿基重復(fù)次數(shù)≥3次)。對(duì)檢測(cè)出的SSR頻率與長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[11]。

    1.2.2A.alternataEST-SSR引物設(shè)計(jì) 采用Primer Premier 5.0 軟件,根據(jù)EST序列中SSR兩端保守序列設(shè)計(jì)A.alternataEST-SSR引物,所選擇的EST-SSR序列兩端分別距離5′和3′端應(yīng)不少于20 bp。引物設(shè)計(jì)時(shí)主要參數(shù)為:引物長(zhǎng)度18~25 bp,GC含量40%~60%,退火溫度(Tm值)為50~65 ℃,PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度應(yīng)為100~500 bp,引物應(yīng)盡量避免二級(jí)結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)配的出現(xiàn)。每條引物的評(píng)分均高于85分。引物設(shè)計(jì)好后由生工生物工程(上海)有限公司 合成。

    1.2.3A.alternataDNA提取與引物檢測(cè) 將保存的A.alternata菌種接種至PDA培養(yǎng)基上,置于27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待氣生菌絲生長(zhǎng)至快滿皿時(shí),將菌絲刮下置入滅菌的研缽,烘干后備用。采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(真菌)提取DNA。

    PCR擴(kuò)增體系為25 μL反應(yīng)體系,包括2× SanTaqPCR Mix 12.5 μL、Sterilized ddH2O 10 μL、DNA模板0.5 μL、上下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,50~65 ℃(隨引物而設(shè)置)退火30 s,72 ℃延伸40 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物先用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),有擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染顯色法檢測(cè)產(chǎn)物條帶的多態(tài)性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 A.alternata EST-SSR的組成及分布特征

    2018年12月28日,從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索出A.alternataEST序列共727條,經(jīng)去冗除雜最后拼接得到298條Unigenes,包括84條Contigs和214條Singletons。運(yùn)用軟件檢測(cè)出SSR位點(diǎn)共34個(gè),位點(diǎn)數(shù)占全部EST序列4.68%,占到Unigenes 11.41%,表明SSR在A.alternata中含量十分豐富。在298條Unigenes中,含有SSR位點(diǎn)的Unigenes 有26條,占全部Unigenes的8.72%;其中只含1個(gè)SSR位點(diǎn)的有21條,占80.77%,出現(xiàn)2個(gè)SSR位點(diǎn)的有4條,占 15.38%,含5個(gè)SSR位點(diǎn)的只有1條,占 3.85%。

    在A.alternataEST-SSR中,二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)基元類(lèi)型分別為3、7、8、2、2種,分別占總類(lèi)型的13.64%、31.82%、36.36%、 9.09%、9.09%,核苷酸重復(fù)基元類(lèi)型共有22種,其中四核苷酸基元類(lèi)型最多,而五、六核苷酸基元類(lèi)型最少。檢測(cè)到SSR總數(shù)量為34個(gè),其中二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)基元的SSR數(shù)量分別為10、9、11、2、2個(gè),分別占總SSR的29.41%、 26.47%、32.35%、5.88%、5.88%。在所有核苷酸基元類(lèi)型中,二核苷酸基元類(lèi)型(GA/TC)n出現(xiàn)頻率最高,為2.35%(表1)。

    表1 A.alternata EST中重復(fù)基元及其比例Table 1 The motifs and their percentages in A.alternata ESTs

    2.2 EST-SSR引物通用性檢測(cè)

    根據(jù)拼接整理好的298條Unigenes序列,共設(shè)計(jì)13對(duì)EST-SSR引物(表2),然后對(duì)來(lái)自新疆不同地區(qū)不同寄主的38個(gè)A.tenuissima進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明除4對(duì)引物(con36、con59、con66、sin18)未產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物外,其他9對(duì)引物均擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小一致的條帶,有效擴(kuò)增效率為69.23%。而在9對(duì)引物中除4對(duì)引物(con14、sin34、sin104、sin168)只能擴(kuò)增出單一條帶,其余5對(duì)(con78、con80、sin94、sin109、sin153)均能擴(kuò)增出多態(tài)性條帶(圖1,圖2),擴(kuò)增多態(tài)率為55.56%,說(shuō)明這5對(duì)引物在近緣種中具有通用性。

    表2 設(shè)計(jì)合成的13對(duì)EST-SSR引物Table 2 Thirteen pairs of EST-SSR primers were designed and synthesized

    1-2.LALAR; 3.LMF; 4.LWL; 5.LLPX; 6-8.PSLX; 9-11.PYCX; 12-13.PPS; 14-15.PALAR; 16-17.PAKT; M.Maker; 19-23.SWLMQ; 24-26.SKRL; 27-29.SMF;30.SSKS; 31.SWT; 32-34.HXH; 35-37.XALAR; 38.XCL

    圖1 引物con78在38個(gè)細(xì)極鏈格孢菌中的擴(kuò)增結(jié)果
    Fig.1 Amplification result of 38A.tenuissimaEST-SSR markers by primers of con78

    1-2.LALAR; 3.LMF; 4.LWL; 5.LLPX; 6-8.PSLX; 9-11.PYCX; 12-13.PPS; 14-15.PALAR; 16-17.PAKT; M.Maker; 19-23.SWLMQ; 24-26.SKRL; 27-29.SMF;30.SSKS; 31.SWT; 32-34.HXH; 35-37.XALAR; 38.XCL

    圖2 引物sin94在38個(gè)細(xì)極鏈格孢菌中的擴(kuò)增結(jié)果
    Fig.2 Amplification result of 38A.tenuissimaEST-SSR markers by primers of sin94

    3 結(jié)論與討論

    本研究對(duì)727條A.alternataEST進(jìn)行篩選除冗和拼接,得到298個(gè)片段,共發(fā)掘出34個(gè)SSR位點(diǎn),平均5.343 kb含有1個(gè)SSR位點(diǎn)。而在其他真菌中,香菇的EST序列平均每 25.942 kb含有1個(gè)SSR位點(diǎn)[12],大豆疫霉菌的EST序列平均每8.9 kb含有1個(gè)SSR位點(diǎn)[13],這表明交鏈格孢菌中SSR出現(xiàn)頻率較高,SSR含量豐富。本研究共檢測(cè)出22種重復(fù)基元類(lèi)型,其中出現(xiàn)頻率最高的是(GA/TC)n基元類(lèi)型,以四核苷酸基元種類(lèi)最多,而五、六核苷酸基元種類(lèi) 較少。

    隨著植物病原菌基因組研究的發(fā)展,很多植物病原菌的EST已被開(kāi)發(fā),從EST數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘SSR分子標(biāo)記,為植物病原菌SSR標(biāo)記的發(fā)展提供了一條便利途徑。SSR一般含有2~5個(gè)等位位點(diǎn),在植物病原菌研究中不僅用于種群遺傳多樣性、近緣種的比較及系譜研究[14-15],而且還可以用于不同寄主分離物之間的比較[16-17]。在種內(nèi)檢測(cè)多態(tài)性水平上,EST-SSR標(biāo)記檢測(cè)水平要低于其他一些從非編碼區(qū)分離的標(biāo)記,然而EST-SSR標(biāo)記檢測(cè)的是基因組表達(dá)部分的變異,是真正與性狀連鎖的標(biāo)記,這將可能對(duì)決定重要表型性狀的等位基因進(jìn)行直接鑒定。另外,EST-SSR分子標(biāo)記一般具有很好的通用性,一旦開(kāi)發(fā)便可以在近緣種(屬)中進(jìn)行應(yīng)用[18]。一般情況下,同屬不同種植物間EST-SSR引物擴(kuò)增成功率為50%~100%[19]。不同種真菌間的擴(kuò)增成功率為 34%[20]。Kumar等[21]研究發(fā)現(xiàn)70%的尖鐮孢菌EST-SSR引物能在潮濕鐮孢菌中通用;Dracatos等[22]研究黑麥冠銹菌EST-SSR引物對(duì)6種真菌的通用性,發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的成功率達(dá)到 22%~53%。由于真菌EST數(shù)據(jù)庫(kù)資源有限,很多學(xué)者便以真菌近緣種的EST數(shù)據(jù)資源,開(kāi)發(fā)可用于真菌本身分類(lèi)鑒定與遺傳多樣性的分子標(biāo)記。如許韜等[23]從大麥白粉菌EST數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)發(fā)小麥白粉菌的SSR分子標(biāo)記,效果比較理想。李新鳳等[24]開(kāi)發(fā)尖鐮孢菌EST-SSR分子標(biāo)記,并在近緣鐮孢菌種中進(jìn)行通用性檢測(cè),結(jié)果表明基于尖鐮孢EST序列開(kāi)發(fā)鐮孢菌通用SSR標(biāo)記是可行的。

    本研究利用A.alternataEST數(shù)據(jù)庫(kù),開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)13對(duì)SSR引物中,通用性檢測(cè)表明共有9對(duì)引物能夠在A.tenuissima種內(nèi)有效擴(kuò)增,而具有多態(tài)性引物就有5對(duì),這表明在不同A.tenuissima菌株間存在著遺傳分化,同時(shí)也說(shuō)明基于A.alternata開(kāi)發(fā)的EST-SSR引物,完全適用于研究A.tenuissima的遺傳多樣性。因此A.alternataEST-SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā),為該菌近緣種A.tenuissima的鑒別、遺傳變異等研究提供重要的標(biāo)記資源,為進(jìn)一步研究A.tenuissima的群體遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、分子流行學(xué)打下堅(jiān)實(shí) 基礎(chǔ)。

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