基于整體柱的糖基化蛋白質(zhì)分離富集方法的研究進(jìn)展

溫雪　鄭海嬌　張揚(yáng)　賈瓊

摘 要 蛋白質(zhì)糖基化作為一種重要的翻譯后修飾，不僅可以反映機(jī)體的健康狀況，還可以充當(dāng)藥物治療的靶點(diǎn)。因此，闡明蛋白質(zhì)糖基化的修飾規(guī)律對(duì)疾病的診斷和治療具有重要意義。然而，生物樣品中糖基化蛋白質(zhì)相對(duì)豐度低，復(fù)雜程度高，動(dòng)態(tài)范圍寬，適宜的樣品前處理步驟必不可少。近年來，整體柱因具備分離快速、靈敏、高效、生物兼容性好等優(yōu)點(diǎn)，在糖基化蛋白質(zhì)分離富集領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注。本文對(duì)近年來基于整體柱的糖基化蛋白質(zhì)分離富集方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述，并對(duì)其未來發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞 整體柱; 糖基化蛋白質(zhì); 樣品前處理; 分離; 富集; 評(píng)述

1 引 言

蛋白質(zhì)糖基化是指不同類型的糖基在特定糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下共價(jià)連接到蛋白質(zhì)上的過程，其作為一種重要的后修飾廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。糖基化蛋白質(zhì)常作為胞質(zhì)外的結(jié)構(gòu)組分起到連接、支撐等作用，并廣泛參與到細(xì)胞的識(shí)別、粘附及遷移等過程，調(diào)控細(xì)胞的增殖與分化[1～3]。異常的蛋白質(zhì)糖基化可擾亂人體穩(wěn)態(tài)，引起癌癥、免疫失調(diào)等疾病 ＼[4，5]。根據(jù)糖苷鍵的類型可將蛋白質(zhì)糖基化分為四類：（1）O-糖苷鍵型，以蘇氨酸、絲氨酸、羥賴氨酸和羥脯氨酸中的羥基為連接點(diǎn)形成; （2）N-糖苷鍵型，以天冬酰胺的酰胺基、N-末端氨基酸的α-氨基和賴氨酸（Lysine， Lys）或精氨酸的ω-氨基為連接點(diǎn)形成; （3）脂糖苷鍵型，以天冬氨酸或谷氨酸的游離羧基為連接點(diǎn)形成; （4）S-糖苷鍵型，以半胱氨酸的巰基為連接點(diǎn)形成。

糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對(duì)于臨床疾病的監(jiān)測(cè)以及藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)具有重要意義[6，7]。相較于凝膠電泳法、液相色譜法等傳統(tǒng)鑒定技術(shù)，具有高效、靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)的生物質(zhì)譜技術(shù)近年成為糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的主要方法[8，9]。然而，由于蛋白質(zhì)糖基化的不均一性及大量非糖肽的干擾[10]，使得通過上述技術(shù)直接對(duì)糖蛋白及糖肽進(jìn)行檢測(cè)鑒定難度很大。因此，通過合適的樣品前處理技術(shù)分離富集得到足夠量的糖蛋白或糖肽是對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)鑒定的基本前提。目前，常見的糖蛋白及糖肽的分離富集方法主要包括[11]凝集素親和富集法[12～15]、硼酸親和富集法[16～19]、肼化學(xué)富集法[20～22]、親水相互作用色譜法（Hydrophilic interaction chromatography， HILIC）[23～28]等。

整體柱（Monolithic column）因具有傳質(zhì)速度快、生物相容性好及孔隙結(jié)構(gòu)可調(diào)節(jié)等特點(diǎn)，在糖蛋白及糖肽分離中得到了越來越多的關(guān)注[29]。整體柱又稱為連續(xù)床，是一種在石英毛細(xì)管、聚醚醚酮管、不銹鋼管或芯片中， 通過有機(jī)或無機(jī)聚合方法， 經(jīng)原位聚合得到的整體、連續(xù)的柱材料[30]。目前，基于整體柱材料的分析分離方法已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、環(huán)境科學(xué)、藥學(xué)和食品科學(xué)等領(lǐng)域[31～35]。

2 整體柱概述

2.1 整體柱的分類

依據(jù)內(nèi)部填充物質(zhì)種類，整體柱主要分為無機(jī)硅膠整體柱、有機(jī)聚合物整體柱、無機(jī)-有機(jī)雜化整體柱三大類。無機(jī)硅膠整體柱主要采用溶膠-凝膠法合成，所合成的整體柱機(jī)械性能良好、孔隙率高、比表面積大，但制備過程較復(fù)雜、柱體易開裂且需要包覆，除此之外，還存在材料適用pH值范圍窄、柱效低等問題[36，37]。有機(jī)聚合物整體柱是由不同比例的單體、交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑通過光引發(fā)或熱引發(fā)聚合而成的一種擁有連續(xù)多孔結(jié)構(gòu)的整體材料，具有制備簡單、適用pH值范圍寬、生物相容性好、單體種類繁多、易于修飾等優(yōu)點(diǎn)[38，39]，同時(shí)也存在機(jī)械穩(wěn)定性較差、易溶脹等缺點(diǎn)。無機(jī)-有機(jī)雜化整體柱則綜合二者部分優(yōu)點(diǎn)，擁有較高的表面積、較大的機(jī)械強(qiáng)度、較好的熱穩(wěn)定性[40]，其制備方法主要包括溶膠-凝膠法[41]、“一鍋法”[42]、基于含硅試劑的聚合反應(yīng)法[43]等。

2.2 整體柱的改性

為了提高整體柱對(duì)糖蛋白及糖肽的吸附選擇性，研究者采取不同手段對(duì)整體柱進(jìn)行了改性，主要包括簡單摻雜法[44]、共同聚合法[45]和聚合后修飾法[46]。近年來，針對(duì)蛋白質(zhì)糖基化研究的整體柱改性材料主要分為以下幾類。

2.2.1 采用納米無機(jī)材料改性 納米無機(jī)材料具有比表面積大、機(jī)械穩(wěn)定性強(qiáng)、量子和表面效應(yīng)等獨(dú)特的性質(zhì)。將其作為整體柱改性材料，可改善整體柱材料的表面化學(xué)性質(zhì)，制備出比表面積更大、機(jī)械性能更強(qiáng)的整體柱; 同時(shí)對(duì)糖蛋白及糖肽也有一定的親和作用。該類改性材料主要包括碳納米材料、金屬與金屬氧化物納米材料和硅納米材料等。

作為一種碳納米材料，氧化石墨烯（Graphite oxide， GO）是石墨烯（Graphene， GN）的氧化物，除了具有與GN類似的超高比表面積、較強(qiáng)的穩(wěn)定性外，還含有豐富的羥基、羧基、環(huán)氧基等含氧官能團(tuán)，比GN親水性更好，更適用于糖蛋白及糖肽的分離富集[47]。Li研究組[48]將硼酸修飾后的GO加入到含有甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯的低聚物混合液中，在不銹鋼管中合成了硼酸化GO摻雜的整體柱。GO的引入不僅使材料的BET表面積從6.3 m2/g擴(kuò)大到169.4 m2/g，而且提供了豐富的硼酸基團(tuán)結(jié)合位點(diǎn)，提高了糖蛋白的富集效率（圖1）。

金納米粒子（Gold nanoparticles， AuNPs）具有高的比表面積、良好的穩(wěn)定性及生物相容性，可通過與巰基、氨基等基團(tuán)的作用為材料后續(xù)的功能化修飾提供連接點(diǎn)[49]。Wu等[50]將4-巰基苯硼酸和2-巰基乙胺鍵合到AuNPs修飾的聚（甲基丙烯酸縮水甘油酯-聚乙二醇二丙烯酸酯）整體柱上，成功捕獲了混合蛋白樣品中的糖蛋白組分。

金屬氧化物表面具有較多的活性基團(tuán)，不僅易與整體柱結(jié)合，還能夠提供糖蛋白及糖肽的吸附位點(diǎn)。Yang等[51]首次報(bào)道了一種SiO2/TiO2雜化的硼酸親和整體柱，與傳統(tǒng)的硼酸親和整體柱相比，該整體柱可在中性條件下成功捕獲含有順式二羥基結(jié)構(gòu)的小分子和糖蛋白。在鈦原子強(qiáng)吸電子作用的影響下，該雜化整體柱具備超強(qiáng)的親水性，克服了疏水作用對(duì)富集過程的影響，可在無有機(jī)溶劑的情況下富集抗體類物質(zhì)。

2.2.2 采用離子液體改性 離子液體是一種由陰、陽離子組成的熔點(diǎn)低于100℃的有機(jī)熔融鹽[52]。離子液體可通過親水、疏水、離子交換、氫鍵等作用與分析物結(jié)合，同時(shí)還具有粘度可調(diào)、熱穩(wěn)定性高、溶解性強(qiáng)、蒸氣壓小等特點(diǎn)。Liu等[52]制備了一種新型二維整體材料，可實(shí)現(xiàn)糖蛋白的在線富集與分離。其中，硼酸功能化的石墨烯整體材料為富集段，聚（胍鹽離子液體-甲基丙烯酸-N，N-亞甲基雙丙烯酰胺）整體材料為分離段。該新型二維整體材料被作為毛細(xì)管電色譜的固定相，成功實(shí)現(xiàn)了5種糖蛋白（雞卵清白蛋白（Ovalbumin， OVA）、辣根過氧化酶（Horseradish peroxidase， HRP）、轉(zhuǎn)鐵蛋白、核糖核酸酶A、甲胎蛋白）的在線富集與分離。硼酸功能化的石墨烯整體柱與聚胍鹽離子液體整體柱的相互配合使得分離效率大大提高。

2.2.3 采用大環(huán)化合物改性 大環(huán)化合物主要包括冠醚、環(huán)糊精（Cyclodextrin， CD）、杯芳烴及葫蘆脲等，其表面存在豐富的化學(xué)基團(tuán)，有利于進(jìn)一步的修飾，且這類化合物還具有獨(dú)特的主客體相互作用。因此，研究者將這類物質(zhì)與整體柱結(jié)合，以期獲得兼具大環(huán)和整體柱多種優(yōu)勢(shì)的材料。大環(huán)化合物修飾的整體柱的制備難點(diǎn)主要在于對(duì)大環(huán)化合物進(jìn)行功能化修飾，以改善其自身的一些限制，以及將大環(huán)化合物簡便結(jié)合到整體柱上。本研究組結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)手段，在環(huán)糊精改性整體柱富集糖蛋白及糖肽方面進(jìn)行了一系列研究[53～57]，主要包括：基于HILIC機(jī)理的糖基化β-CD（Glycoβ-CD）修飾的聚（甲基丙烯酸羥乙酯-季戊四醇三丙烯酸酯-Glycoβ-CD）整體柱及β-CD分子管修飾的聚（甲基丙烯酸羥乙酯-季戊四醇三丙烯酸酯-谷氨酸-β-CD分子管）整體柱、基于花生凝集素（Peanut agglutinin， PNA）親和機(jī)理的聚（甲基丙烯酸羥乙酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯-PNA-β-CD）整體柱、基于Lys親和機(jī)理的聚（甲基丙烯酸甲酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸羥乙酯-Lys-β-CD-生物素）整體柱、基于pH敏感響應(yīng)機(jī)理的聚（甲基丙烯酸縮水甘油酯-季戊四醇三丙烯酸酯-β-CD囊泡）整體柱。其中，本研究組[57]首次將巰基功能化的pH響應(yīng)型β-CD自組裝囊泡修飾到聚（甲基丙烯酸縮水甘油酯-季戊四醇三丙烯酸酯）整體柱上，得到pH敏感響應(yīng)型的整體柱（圖 2），并將其成功應(yīng)用于心臟疾病標(biāo)記物——肌紅蛋白的研究，該方法的檢出限低至0.1 fmol（S/N > 3），日內(nèi)與日間精密度分別為2.3%和3.5%。在隨后的實(shí)際樣品分析中，成功從人血液樣品中鑒定出166個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和對(duì)應(yīng)的130種糖蛋白。

3 整體柱在糖基化蛋白質(zhì)分離富集中的應(yīng)用

整體柱不僅具備快速分離、靈敏高效等優(yōu)點(diǎn)，而且其內(nèi)部豐富的功能基團(tuán)與糖蛋白或糖肽之間存在親水、靜電、氫鍵、偶極-偶極等多種作用。因此，整體柱作為糖蛋白和糖肽的分離材料已逐漸得到應(yīng)用（表1）。目前，依據(jù)富集機(jī)理的不同，用于糖蛋白或糖肽分離富集的整體柱主要分為以下

3.1 基于肼化學(xué)富集法的整體柱

該方法首先將糖鏈上的鄰二醇氧化成醛基，然后與整體柱材料上的肼基發(fā)生共價(jià)反應(yīng)形成腙，再洗去非糖肽，隨后通過一定的方法將糖肽中的肽段部分釋放，與糖鏈分離，實(shí)現(xiàn)糖蛋白或糖肽的分離富集（圖3）。該方法的優(yōu)點(diǎn)為非特異性吸附少，富集后糖肽含量高于90%[58，59]。Bai等[60]用3-巰基丙烷-1，2-二醇修飾的多面體低聚乙烯基倍半硅氧烷，與二硫蘇糖醇通過巰烯點(diǎn)擊聚合反應(yīng)合成大孔的親水有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱，而后將肼基引入整體柱，并運(yùn)用肼化學(xué)法富集糖蛋白。然而，由于這類方法反應(yīng)繁瑣復(fù)雜且不易調(diào)控，富集后因?yàn)樘擎湶糠值娜笔Ф荒苡糜陔墓羌艿难芯?，限制了該方法的使用?/p>

3.2 基于硼酸親和作用的整體柱

硼酸親和法富集糖蛋白或糖肽的原理為： 硼酸分子與糖鏈上的順式二羥基結(jié)構(gòu)在堿性條件下形成五、六元環(huán)酯，該環(huán)酯結(jié)構(gòu)在酸性條件下發(fā)生水解。通過調(diào)控此可逆反應(yīng)，可達(dá)到分離富集糖蛋白或糖肽的目的[61]。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于硼酸分子與順式二羥基之間通過共價(jià)鍵連接，較為穩(wěn)固，可經(jīng)受強(qiáng)力洗脫，從而有利于削弱非特異性吸附; 且該方法具有可逆性，可通過調(diào)節(jié)pH值實(shí)現(xiàn)對(duì)糖蛋白或糖肽的吸附與解吸。此外，在富集過程中，該方法不破壞糖基結(jié)構(gòu)，有利于后續(xù)對(duì)糖基結(jié)構(gòu)的研究[50]。Liu研究組[62]采用原位自由基引發(fā)聚合機(jī)理，以4-乙烯基苯基硼酸為單體、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，制備了硼酸親和整體柱，用于對(duì)糖蛋白的特異性識(shí)別。在堿性條件下，糖蛋白與4-乙烯基苯基硼酸之間因存在親和作用而被保留，非糖蛋白被洗脫; 切換到酸性條件下，則可將糖蛋白洗脫下來。

傳統(tǒng)的硼酸親和整體柱富集糖蛋白，其堿性工作環(huán)境易使糖蛋白水解，結(jié)合力較差，特異性不強(qiáng)[63]。為了防止糖蛋白在堿性條件下被水解，調(diào)節(jié)硼酸基團(tuán)作用時(shí)的pH值至中性或弱酸性非常必要。為此，研究者將多種新型硼酸分子應(yīng)用于糖蛋白的分離富集，主要包括改進(jìn)Wulff 型苯硼酸、苯環(huán)上連有吸電子基的取代苯硼酸等[64]。其中，改進(jìn)Wulff 型苯硼酸因具有較好的親水性及在中性環(huán)境下對(duì)含順式二羥基的化合物有良好的富集效果而被廣泛利用。Liu研究組[65]合成了一種3-羧基-2-羥甲基苯硼酸修飾的聚（甲基丙烯酸縮水甘油酯-N，N-亞甲基雙丙烯酰胺）硼酸親和整體柱。在pH低至5時(shí)，腺苷仍然能夠完全保留于整體柱上。隨后，該研究組[66]利用3-羧基-2-羥甲基苯硼酸制備出結(jié)構(gòu)均勻的整體柱，結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)，從HRP胰蛋白酶消化液中鑒定出22種糖肽。而后又從人唾液中成功檢測(cè)出6種完整的糖蛋白。此外，該研究組[64]還設(shè)計(jì)合成了含2，3-二氟-3-甲?；脚鹚岬恼w柱，用于人尿液中核苷的富集，并考察了間隔臂的長度對(duì)硼酸親和整體柱富集效率的影響。

研究者將聚合物等材料引入整體柱以擴(kuò)增硼酸配體的數(shù)目，提高了對(duì)糖蛋白及糖肽的親和力[61]。Liu研究組[67]將支化聚乙烯亞胺（Polyethyleneimine， PEI）修飾到聚（甲基丙烯酸縮水甘油酯-N，N-亞甲基雙丙烯酰胺）整體柱上，獲得的聚（甲基丙烯酸縮水甘油酯-N，N-亞甲基雙丙烯酰胺）整體柱對(duì)糖蛋白的結(jié)合常數(shù)可達(dá)10類型。

6～10/L。PEI的加入不僅擴(kuò)增了結(jié)合位點(diǎn)，還增加了整體柱的親水性。另外，研究者通過表面引發(fā)聚合反應(yīng)接枝聚合物鏈以達(dá)到相似的效果，反應(yīng)簡便快捷、可控性強(qiáng)[61]。如Dong等[68]采用兩步原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法合成了4-乙烯基苯硼酸鏈接枝的多孔聚合物整體柱，增加了硼酸分子的數(shù)目，有效地增強(qiáng)了對(duì)含兩個(gè)順式二羥基結(jié)構(gòu)的分子的親和力。此外，將硼酸親和法與分子印跡技術(shù)結(jié)合設(shè)計(jì)合成的硼酸印跡整體柱也可大幅提升對(duì)糖蛋白的親和力。該類整體柱擁有對(duì)模板分子超強(qiáng)的專一性，可將特定糖蛋白從復(fù)雜樣品中分離出來[63]。Lin等[69]通過多巴胺自聚機(jī)理設(shè)計(jì)合成了以HRP為模板的聚（4-乙烯基苯硼酸-季戊四醇三丙烯酸酯）整體柱，由于結(jié)合了硼酸親和原理和表面印跡技術(shù)，去除模板分子后整體柱內(nèi)部存在精準(zhǔn)和穩(wěn)定的識(shí)別位點(diǎn)，有利于增強(qiáng)模板分子與材料的結(jié)合能力，重現(xiàn)性良好， 使用壽命長。該分子印跡整體柱被成功應(yīng)用于復(fù)雜樣品中HRP的富集。

硼酸親和整體柱在分離富集糖蛋白時(shí)還需要高的特異性。除了增強(qiáng)硼酸分子對(duì)糖蛋白的親和力外，還要盡可能削弱不利于糖蛋白富集的二級(jí)作用。 Zhou等[70]合成了含有親水單體低聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯（Oligo（ethylene glycol） methyl ether methacrylate， OEG）的硼酸親和整體柱，即聚（3-丙烯酰胺基苯硼酸-OEG-乙二醇二甲基丙烯酸酯）整體柱。加入OEG后，該整體柱對(duì)HRP及OVA的回收率提高了30%，說明引入親水大分子單體有效提高了硼酸親和整體柱對(duì)糖蛋白的親和力。

3.3 基于親水相互作用的整體柱

親水相互作用色譜的概念在20世紀(jì)90年代由Alpert首次提出[71]。HILIC的固定相與正相色譜相似，均為極性固定相; 其流動(dòng)相又與反相色譜類似，主要由水與有機(jī)溶劑組成。HILIC具有較高的糖基化覆蓋率、優(yōu)良的重現(xiàn)性、良好的質(zhì)譜兼容性，是常見的糖肽分離富集方法[28]。

本研究組[53]利用巰烯點(diǎn)擊化學(xué)法制備了Glyco β-CD，再將Glyco β-CD鍵合到聚（甲基丙烯酸羥乙酯-季戊四醇三丙烯酸酯）整體柱中，隨后將該整體柱與質(zhì)譜聯(lián)用并富集檢測(cè)復(fù)雜樣品中的糖肽。Chen研究組[72]通過兩相接枝共聚法合成硫酸葡聚糖功能化丙烯酸多縮乙二醇雙酯整體柱，一步完成了整體柱的糖基化修飾，并研究了整體柱的HILIC機(jī)理。Ye等[73]在聚己內(nèi)酯（Polycaprolactone， PCL）存在下，通過自由基聚合制備了基于多面體低聚乙烯基硅倍半硅氧烷與烯丙基縮水甘油醚的整體柱，隨后用鹽酸溶液降解PCL，得到環(huán)氧功能化的分級(jí)多孔雜化整體柱。通過調(diào)節(jié)單體的摩爾比和PCL的含量，該整體柱的比表面積可達(dá) 636.7 m2/g。 而后將青霉胺修飾到整體柱上，并將所獲得的材料與質(zhì)譜聯(lián)用，用于N-糖蛋白的富集，從人血清中成功鑒定出385個(gè)N-糖肽和283個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。

3.4 基于凝集素親和作用的整體柱

凝集素是一類來源于植物或動(dòng)物、可使細(xì)胞凝集或使含糖復(fù)合物沉淀的蛋白。凝集素可特異性識(shí)別一種或某幾種糖基，如刀豆凝集素（Concanavalin A， Con A）特異性結(jié)合甘露糖型[74，75]、PNA特異性結(jié)合半乳糖型[76]，橙黃網(wǎng)胞盤菌凝集素（Aleuria aurantia lectin， AAL）特異性結(jié)合巖藻糖型[77]。凝集素法富集糖蛋白是利用每一種凝集素特異性結(jié)合一種或幾種類型的糖基，將糖蛋白從樣品中分離出來。凝集素整體柱具有特異性強(qiáng)、富集過程不破壞糖基等優(yōu)點(diǎn)。

本研究組[55]利用PNA特異性結(jié)合半乳糖型糖基的機(jī)理制備了PNA改性的β-CD化合物，將該化合物鍵合到聚（甲基丙烯酸羥乙酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯）整體柱上，并制備成微萃取裝置與質(zhì)譜儀進(jìn)樣口連接，在線解吸檢測(cè)復(fù)雜樣品中的半乳糖糖基化肽段，檢出限低至0.5 fmol（圖4）。

凝集素法分離富集糖蛋白只能捕獲與凝集素表位相關(guān)的糖鏈結(jié)構(gòu)，限制了其在糖蛋白整體分析中的應(yīng)用。而采用多種不同凝集素聯(lián)合使用的策略可盡可能覆蓋更多的糖型。Rassi等[78]開發(fā)了一種由凝集素親和色譜組成的液相分離平臺(tái)，并通過液相色譜-二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)捕獲到的人血清中的糖蛋白進(jìn)行分析鑒定。該平臺(tái)由3個(gè)表面分別固定了Con A、小麥胚芽凝集素（Wheat germ agglutinin， WGA）和蓖麻凝集素-I（Ricinus communis agglutinin-I， RCA-I）的整體柱串聯(lián)組成。就捕獲蛋白的數(shù)量而言，最適宜的凝集素串聯(lián)順序是WGA→ Con A →RCA-I（記作WCR），該研究通過尋找乳腺癌患者與非乳腺癌患者血清中差異表達(dá)的糖蛋白，成功尋找到一組共23個(gè)候選生物標(biāo)志物。

3.5 基于抗原抗體免疫親和作用的整體柱

該類整體柱利用抗原抗體結(jié)合的專一性，通過使用具有特異性的單克隆抗體對(duì)相應(yīng)的糖蛋白進(jìn)行分離[79]。Gordan等[80]報(bào)道了一種固定單克隆抗人纖維蛋白原抗體的整體材料，在半高通量模式下快速純化人血漿中的纖維蛋白原（Fibrinogen， FIB）。該工作成功應(yīng)用于10例健康人的FIB免疫親和分離，隨后應(yīng)用超高效液相色譜對(duì)其進(jìn)行N-糖基化分析。該類方法雖然靈敏度高、特異性好，但是抗體價(jià)格高昂、穩(wěn)定性差，且操作較為復(fù)雜[79]。

3.6 基于賴氨酸親和作用的整體柱

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Abstract As a post-translational modification， protein glycosylation not only reflects on body health， but also serves as the target of drug treatment. Therefore， it is of great significance to study protein glycosylation for the diagnosis and treatment of diseases. However， many glycoproteins of biological importance exhibit relatively low abundance， high complexity， and wide dynamic range in biological samples. It is indispensable to explore highly efficient sample pretreatment methods. In recent years， monolithic columns have attracted extensive attention in the field of separation and enrichment of glycoproteins due to their advantages of rapid separation， high efficiency， and good biological compatibility. In this paper， recent progress of monolithic columns in the field of separation and enrichment of glycoproteins is surveyed， and the future development is briefed.

Keywords Monolithic column;? Glycoprotein;? Sample pretreatment; Separation;? Enrichment;? Review