黑洋蔥多酚成分提取及抗氧化研究

周寧，寧月寶

(內(nèi)蒙古科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

洋蔥的營養(yǎng)價(jià)值極其豐富，含有豐富的人體所需的維生素及微量元素，還含有各種氨基酸。但是洋蔥有辛辣氣味，而且大量食用會對人的胃腸造成不適。黑洋蔥是將新鮮紫皮洋蔥放置在恒溫恒濕發(fā)酵箱中，經(jīng)過一定溫度調(diào)控后，發(fā)酵1個(gè)月后制成的一種黑洋蔥食品[1]。黑洋蔥去除了洋蔥的刺激性氣味，并且提高了其抗氧化能力。在抗癌、抗氧化、抗血栓及抗動脈硬化等老年性退行性疾病方面扮演著重要角色。

植物多酚具有調(diào)節(jié)免疫力、減少脂肪氧化、清除氧自由基、預(yù)防心腦血管疾病、抗氧化[2,3]、防輻射、防癌和延緩機(jī)體衰老等多種生理功能，開發(fā)天然來源的多酚并將其應(yīng)用到食品中已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。我們將洋蔥發(fā)酵成黑洋蔥，使用先進(jìn)萃取技術(shù)提取其有效活性成分，通過一系列試驗(yàn)，驗(yàn)證黑洋蔥有效成分的抗氧化功能，為黑洋蔥作為保健品及藥品提供了理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料

黑洋蔥粉末(黑洋蔥粉碎，過60目篩)、紫皮洋蔥：購于包頭昆都侖區(qū)阿爾丁大街和平村農(nóng)貿(mào)市場，洗凈切塊，在鼓風(fēng)干燥箱中50 ℃下烘干，過60目篩制成洋蔥粉備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

福林-酚試劑：上海荔達(dá)生物科技有限公司；DPPH：Sigma公司；無水乙醇、無水碳酸鈉、沒食子酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、水楊酸、亞硫酸鐵、雙氧水(均為國產(chǎn)分析純)：包頭廣元化工公司。

1.3 主要儀器

主要儀器見表1。

表1 主要儀器Table 1 The main instruments

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取多酚成分

用參考文獻(xiàn)[4]的方法稍作修改，使用微波功率600 W、微波溫度60 ℃，準(zhǔn)確稱取2 g黑洋蔥干粉，以體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇溶液作為提取劑，在料液比為1∶30(g/mL)下微波輔助提取2 min。提取液以4000 r/min離心10 min, 取上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),濃縮后得濃縮液，濃縮液在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 測定多酚含量

測定多酚含量的方法：用沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品作對照，采用Folin-Ciocalteu(FC)法測定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

參考文獻(xiàn)[4]的方法，以沒食子酸質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 提取率的計(jì)算

用移液槍準(zhǔn)確吸取黑洋蔥提取液1.0 mL，放置于10 mL比色管中，在760 nm波長處測定其吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中多酚含量。

式中：C為由線性回歸方程計(jì)算出樣品中多酚的質(zhì)量濃度mg/mL；V為洋蔥提取液的體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為洋蔥投料量，g。

2.5 抗氧化能力的測定

2.5.1 黑洋蔥、紫皮洋蔥多酚成分對DPPH自由基的清除力

實(shí)驗(yàn)參照參考文獻(xiàn)[5-7]的方法稍作修改，準(zhǔn)確稱取DPPH自由基標(biāo)準(zhǔn)品2 mg，用無水乙醇定容至50 mL。將黑洋蔥多酚提取液、紫皮洋蔥多酚提取液分別配制成不同濃度的溶液，作為待測樣品溶液。在10 mL試管中分別依次加入：1.0 mL蒸餾水和3.0 mL 0.04 mmol/L的DPPH溶液，1.0 mL待測樣品溶液和3.0 mL 0.04 mmol/L的DPPH溶液，1.0 mL待測樣品溶液和3.0 mL無水乙醇，遮光混勻，待反應(yīng)穩(wěn)定后，以無水乙醇為參比，在517 nm處測吸光值；分別記為Ac、Ai和Aj。按下式計(jì)算DPPH·清除率。

式中：Ai為1.0 mL蒸餾水和3.0 mL DPPH溶液的吸光度；Aj為1.0 mL樣品溶液和3.0 mL DPPH溶液的吸光度；Ac為3.0 mL無水乙醇和1.0 mL樣品溶液的吸光度。

2.5.2 黑洋蔥、紫皮洋蔥多酚成分的總還原力

實(shí)驗(yàn)參照參考文獻(xiàn)[8]的方法稍作修改，將黑洋蔥多酚提取液、紫皮洋蔥多酚提取液分別配制成不同濃度的溶液，作為待測樣品溶液。準(zhǔn)確移取1.0 mL溶液于試管中，分別加入2.5 mL 磷酸緩沖液(0.2 mol/L pH 6.6)和1%的2.5 mL鐵氰化鉀溶液，混合物在50 ℃水浴中恒溫20 min，然后快速冷卻，再加入10% 的2.5 mL三氯乙酸溶液，以3000 r/min 離心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL 蒸餾水、0.1%的0.5 mL三氯化鐵溶液，充分搖勻，靜置10 min 后在700 nm 波長下測其吸光度值。取50%乙醇，1.0 mL為空白對照液同以上操作參比調(diào)零，用吸光度值表示總還原能力的大小。

2.5.3 黑洋蔥、紫皮洋蔥多酚成分對羥基自由基的清除作用

實(shí)驗(yàn)參照參考文獻(xiàn)[9,10]的方法稍作修改，將黑洋蔥多酚提取液、紫皮洋蔥多酚提取液分別配制成不同濃度的溶液，作為待測樣品溶液。依次加入2 mL 3 mmol/L FeSO4、2 mL 3 mmol/L水楊酸和2 mL樣品到10 mL 的離心管中，最后加入2 mL 3 mmol/L H2O2啟動反應(yīng)，混合均勻后，37 ℃反應(yīng)1 h。在510 nm處測吸光度(A1)，考慮到樣品本身的吸光值，用2 mL蒸餾水代替H2O2，測定510 nm處的吸光度(A2)，對照組用2 mL蒸餾水代替樣品，測定510 nm 處的吸光度(A0)。

式中：A0為不加樣品溶液的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度；A2為樣品溶液本底吸光度。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

按實(shí)驗(yàn)方法繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。計(jì)算得線性回歸方程為：y=116.20x+0.0272，R2=0.9928。式中：y為吸光度，x為沒食子酸質(zhì)量濃度，(mg/mL)。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of gallic acid

由圖1可知，在0.001～0.005 mg/mL范圍內(nèi)沒食子酸質(zhì)量濃度與其吸光度呈良好的線性關(guān)系。

3.2 黑洋蔥、紫皮洋蔥提取液多酚含量

按照2.4的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明黑洋蔥多酚平均含量為25.76 mg/g，紫皮洋蔥中多酚平均含量為19.93 mg/g。

3.3 黑洋蔥、紫皮洋蔥多酚成分對DPPH自由基的清除力

DPPH方法是基于氫原子轉(zhuǎn)移的抗氧化評價(jià)方法[11]。DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，溶于乙醇后呈現(xiàn)紫色，在 517 nm 處具有最大吸收峰。多酚可還原DPPH自由基，將其顏色變淺?？寡趸瘎┣宄鼶PPH自由基的能力可根據(jù)吸光度的變化檢測，進(jìn)而對其抗氧化活性進(jìn)行評價(jià)。按2.5.2的實(shí)驗(yàn)方法，測得不同濃度黑洋蔥多酚、紫皮洋蔥多酚對DPPH自由基的清除能力，見圖2。進(jìn)行顯著性差異分析,結(jié)果證明黑洋蔥與紫皮洋蔥多酚成分的DPPH自由基清除力結(jié)果P<0.01，有顯著性差異，說明紫皮洋蔥經(jīng)發(fā)酵成為黑洋蔥后DPPH自由基清除能力增強(qiáng)。

圖2 黑洋蔥和紫皮洋蔥對DPPH自由基清除率的對比Fig.2 Comparison of DPPH free radical scavenging rates between black onion and purple onion

3.4 黑洋蔥、紫皮洋蔥多酚成分的總還原力

多酚類抗氧化物質(zhì)有送出電子的還原能力，F(xiàn)e3+的還原反應(yīng)通常用來表征物質(zhì)的還原能力。本實(shí)驗(yàn)采用鐵離子還原法對多酚成分的還原能力進(jìn)行研究。多酚提取物擁有越強(qiáng)的還原能力,越多的鐵離子被還原得到亞鐵離子,生成越多的藍(lán)色普魯士藍(lán)。進(jìn)而測得在波長700 nm下的吸光度,就可得多酚提取物的還原能力[12]。取黑洋蔥多酚提取液、紫皮洋蔥多酚提取液分別配制成不同濃度的溶液然后測定總還原力，測定結(jié)果見圖3，利用SPSS軟件對黑洋蔥、紫皮洋蔥多酚成分總還原力進(jìn)行測定,結(jié)果結(jié)果證明黑洋蔥與紫皮洋蔥多酚成分總還原力結(jié)果P<0.05，有差異，說明黑洋蔥及紫皮洋蔥均具有較強(qiáng)的總還原力，并隨著濃度的增加，總還原力隨之增加，并且黑洋蔥總還原力大于紫皮洋蔥。

圖3 黑洋蔥和紫皮洋蔥多酚成分的總還原力對比Fig.3 Comparison of total reducing capacity of polyphenols from black onion and purple onion

3.5 黑洋蔥、紫皮洋蔥多酚成分對羥基自由基的清除作用

細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸脂質(zhì)可因?yàn)镠2O2引發(fā)細(xì)胞膜損壞、過氧化反應(yīng);還能促使DNA鏈斷裂,誘發(fā)細(xì)胞衰亡,從而使細(xì)胞損傷,多種病理機(jī)制都有參與[13]。且H2O2具有強(qiáng)氧化性,所以多酚擁有越強(qiáng)的H2O2清除力,則說明多酚抗氧化性越強(qiáng)。取黑洋蔥多酚提取液，將紫皮洋蔥多酚提取液分別配制成不同濃度的溶液，然后測定對羥基自由基的清除作用，測定結(jié)果見圖4。

圖4 黑洋蔥和紫皮洋蔥對羥基自由基清除作用的對比Fig.4 Comparison of scavenging effect of black onion and purple onion on hydroxyl radicals

由圖4可知，黑洋蔥和紫皮洋蔥均具有較強(qiáng)的羥基自由基的清除作用，并隨著樣品濃度的增加，對羥基自由基的清除率隨之增加。而且黑洋蔥多酚的總還原力強(qiáng)于紫皮洋蔥。利用SPSS軟件對黑洋蔥、紫皮洋蔥多酚成分總還原力進(jìn)行測定，結(jié)果證明黑洋蔥與紫皮洋蔥多酚對羥基自由基的清除作用結(jié)果，有顯著性差異(P<0.01)，說明紫皮洋蔥經(jīng)過發(fā)酵后成為黑洋蔥后對羥基自由基的清除作用增強(qiáng)。

4 結(jié)論

黑洋蔥中多酚含量為25.76 mg/g，證明黑洋蔥中多酚含量較高。通過使用紫外分光光度計(jì)測定紫皮洋蔥多酚及黑洋蔥多酚對DPPH自由基的清除率和羥自由基的清除率，發(fā)現(xiàn)黑洋蔥及紫皮洋蔥多酚都具有良好的體外抗氧化活性，表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除自由基的能力。而且黑洋蔥多酚的抗氧化能力大于紫皮洋蔥多酚的抗氧化能力。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，黑洋蔥多酚及紫皮洋蔥多酚對自由基的清除率隨溶液濃度的增大而升高，黑洋蔥多酚及紫皮洋蔥多酚的總還原能力實(shí)驗(yàn)證明二者對鐵離子具有良好的還原能力，將 Fe3+還原成Fe2+，反應(yīng)液的顏色進(jìn)而改變，而且相同濃度下黑洋蔥多酚的總還原力大于紫皮洋蔥多酚的總還原力。經(jīng)過3種抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，將紫皮洋蔥發(fā)酵成為黑洋蔥，在抗氧化方面有極大提高，同時(shí)改善了紫皮洋蔥的刺激性氣味。研究了其在抗衰老、抗氧化以及與衰老相關(guān)疾病治療中的應(yīng)用。因此，洋蔥加工成黑洋蔥的抗氧化活性值得關(guān)注與研發(fā)。