云南怒江草果的微波無溶劑萃取及其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-TOF-MS分析

吳桂蘋，谷風(fēng)林*，朱科學(xué)，李云瑩,2，李昌應(yīng),2，房一明

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，海南 萬寧 571533；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明 650201)

草果(Amomumtsao-koCrevost et Lemarie)為姜科、豆蔻屬多年生常綠草本植物，是亞熱帶山區(qū)常綠闊葉林下生長的一種重要經(jīng)濟(jì)作物，主要分布在我國云南、廣西和貴州三省部分地區(qū)，以及越南、老撾北部的部分地區(qū)。其中，云南省草果種植面積和產(chǎn)量均占全國的90%以上，至今已有300多年的栽培歷史，種植總面積達(dá)11.98×104hm2，其中怒江州草果的種植面積達(dá)5.44×104hm2，草果已發(fā)展成怒江州的特色經(jīng)濟(jì)作物之一[1]。草果藥食同源，不僅是烹飪佐料的上品，而且在中藥中有廣泛的用途，干果可作為中藥材，燥濕溫中，治療脘腹脹痛，痞滿嘔吐，瘧疾寒熱，瘟疫發(fā)熱之疾[2]。隨著香辛調(diào)味料的深入研究和加工新技術(shù)的運(yùn)用，調(diào)味料產(chǎn)品形態(tài)更豐富[3]、風(fēng)味更穩(wěn)定[4]、用途更廣泛[5]，但有關(guān)草果的研究報(bào)道相對(duì)較少。國內(nèi)外有部分學(xué)者研究報(bào)道了草果中揮發(fā)油的化學(xué)成分[6，7]，已初步確定了草果中的揮發(fā)性成分主要是萜烯類物質(zhì)，比較了產(chǎn)區(qū)差異[8-10]，并初步評(píng)價(jià)了其抗氧化、抗菌等活性[11-13]，水蒸氣蒸餾法常用于草果揮發(fā)油的萃取[14]，但萃取時(shí)間長，因此，借助微波輔助萃取等方法可極大縮短萃取時(shí)間[15-17]。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)多使用氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行定性鑒定，但很多風(fēng)味化合物存在同分異構(gòu)體，很難將其區(qū)分開來，飛行時(shí)間-質(zhì)譜儀具有高靈敏度，能快速、高通量分析專一的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息[18]，目前尚未見GC-TOF-MS在草果揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)方面的研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)利用微波無溶劑萃取儀萃取云南怒江州草果的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，并用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)其進(jìn)行定性分析，為草果揮發(fā)性成分的開發(fā)和利用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草果：由云南怒江州農(nóng)業(yè)局提供； 正己烷(分析純)：西隴化工股份有限公司。

NEOS-GR微波無溶劑萃取儀 意大利Milestone公司；Agilent 7890B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司；Pegasus 4D GC-TOF-MS 美國LECO公司；QE-300 g高速萬能粉碎機(jī) 浙江屹立工貿(mào)有限公司；HDM-100電熱套 常州國華電器有限公司；AL104電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 草果樣品的揮發(fā)油提取和含量測定

將干燥的草果全果樣品用粉碎機(jī)粉碎過篩，分別收集粒度大于20目(標(biāo)記為A)、20～40目(標(biāo)記為B)以及小于40目(標(biāo)記為C)的草果粉于密封袋內(nèi)，待測。采用微波無溶劑萃取儀提取不同粉碎粒度的草果粉，參考Xue Feng等的方法略有修改，即將100 g草果粉，加入500 mL去離子水，微波功率600 W，提取60 min，讀取并收集揮發(fā)油，分別標(biāo)記為WBA、WBB和WBC，密封保存待測。

同時(shí)采用水蒸氣蒸餾法提取作為對(duì)照，參考谷風(fēng)林等的方法略有修改，即準(zhǔn)確稱取40.00 g 粒度大于20目(標(biāo)記為A)、20～40目(標(biāo)記為B)和小于40目(標(biāo)記為C)3種不同粉碎粒徑的草果粉樣品，加入500 mL去離子水，連接揮發(fā)油收集器皿，進(jìn)行水蒸氣蒸餾4 h，利用低溫循環(huán)泵冷凝，收集揮發(fā)油，分別標(biāo)記為SZQA、SZQB和SZQC，用無水硫酸鈉除去水分，保存待測。

草果樣品中的揮發(fā)油含量根據(jù)收集到揮發(fā)油的體積除以草果粉的質(zhì)量計(jì)算，以mL/100 g表示。

1.2.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析鑒定

將微波無溶劑萃取和水蒸氣蒸餾萃取所得的草果揮發(fā)油，分別用正己烷稀釋300倍，經(jīng)無水硫酸鈉脫除水分后，用0.45 μm孔徑尼龍膜過濾于氣相色譜專用小瓶中，用于GC-TOF-MS分析。

1.2.2.1 GC分析條件

色譜柱為DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣：氦氣，流速：1.0 mL/min；升溫程序：50 ℃保持0.2 min，以4 ℃/min的速率升至90 ℃，以2 ℃/min的速率升至160 ℃，以20 ℃/min的速率升至220 ℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣量：1.0 μL，不分流，溶劑延遲360 s。

1.2.2.2 TOF-MS分析條件

EI離子源，電離能量：70 eV，離子源溫度：200 ℃；傳輸線溫度：250 ℃，質(zhì)量數(shù)掃描范圍：35～450 m/z，采集速率：10 spec/s，溶劑延遲300 s。

通過NIST 14譜庫檢索數(shù)據(jù)，采用峰面積歸一化法計(jì)算各化合物的相對(duì)百分比含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用Excel和儀器自帶軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 粉碎粒度對(duì)草果揮發(fā)油含量的影響

圖1 不同粉碎粒徑的草果粉揮發(fā)油含量Fig.1 Volatile oil content of Amomum tsao-ko powder with different grinding particle size

由圖1可知，草果樣品C(粉碎粒徑小于40目)的揮發(fā)油含量最高，達(dá)到3.521 mL/100 g，而樣品A(粉碎粒徑大于20目)的揮發(fā)油含量最低。這說明草果的粉碎粒度對(duì)其揮發(fā)性油含量的萃取量有較大影響，草果粉碎粒度越細(xì)，揮發(fā)油的萃取量越高。由此可知，草果樣品粉碎得越細(xì)，其揮發(fā)油越容易被提取出來。與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法相比，微波無溶劑萃取法萃取量相對(duì)較低，大于20目的草果粉揮發(fā)油提取量是水蒸氣蒸餾法的94.46%，但小于40目的草果粉揮發(fā)油提取量是水蒸氣蒸餾法的60.83%，粉碎粒度越細(xì)，兩種萃取方法所得揮發(fā)油含量差異越大，這可能與微波無溶劑萃取法的萃取時(shí)間短有關(guān)，其萃取工藝仍需要進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2 草果中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析

草果樣品揮發(fā)油的GC-TOF-MS總離子流圖見圖2和圖3，經(jīng)軟件自動(dòng)進(jìn)行解卷積和譜庫匹配后，并進(jìn)行手動(dòng)刪除色譜柱流失化合物后，分析出匹配度大于750的化合物共97種，其中采用微波無溶劑萃取法提取揮發(fā)油中的風(fēng)味化合物種類和數(shù)量略高于傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成見表1。

圖2 微波無溶劑萃取草果揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-TOF-MS總離子流圖Fig.2 The TIC of microwave solvent-free extraction of volatile flavor substances from Amomum tsao-ko by GC-TOF-MS

圖3 傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾提取草果揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-TOF-MS總離子流圖Fig.3 The TIC of volatile flavor substances extracted by traditional steam distillation method from Amomum tsao-ko by GC-TOF-MS

表1 草果粉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成Table 1 Composition of volatile flavor substances in Amomum tsao-ko powder

續(xù) 表

續(xù) 表

注：ND表示未檢出。

根據(jù)草果中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量，將相對(duì)含量大于10%以上的作為主要風(fēng)味物質(zhì)，相對(duì)含量介于1%～10%的化合物作為次要風(fēng)味物質(zhì)，相對(duì)含量介于0.1%～1%的化合物作為微量風(fēng)味物質(zhì)，相對(duì)含量小于0.1%的化合物作為痕量風(fēng)味物質(zhì)。經(jīng)比較分析，主要風(fēng)味物質(zhì)有4種化合物，分別是桉樹醇、(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛和2-甲基-3-苯基丙醛，見圖5；次要風(fēng)味物質(zhì)包含14種化合物，見圖6；微量風(fēng)味化合物有30種，痕量風(fēng)味化合物有49種。

圖4 草果揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量Fig.4 The relative content of volatile flavor substances in Amomum tsao-ko

對(duì)不同草果揮發(fā)油樣品的風(fēng)味物質(zhì)種類以及主要風(fēng)味物質(zhì)和次要風(fēng)味物質(zhì)含量作圖，由圖4和表1可知，草果中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要由醛類、醇類以及少量的烯類和芳香族類化合物組成，其相對(duì)面積百分含量達(dá)到98.58%。其中，醛類化合物含量最高，達(dá)到68.67%，醇類化合物含量最高，達(dá)到26.58%。醛類化合物中相對(duì)含量較高的化合物是(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛以及2-甲基-3苯基丙醛，最高含量分別為25.85%、16.16%、17.94%，醇類化合物中相對(duì)較高的是桉樹醇，最高含量為18.61%，比谷風(fēng)林等研究報(bào)道的高，這不僅與原料的處理方法有關(guān)，而且與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測儀器條件等密切相關(guān)，大多數(shù)采用GC-MS檢測，鑒定出的草果揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量在39種左右，目前，尚未見TOF-MS在草果揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析檢測方面的研究報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的不同萃取方法及草果原料的粉碎粒度進(jìn)行比較分析。

對(duì)草果中的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析比較，見圖5，發(fā)現(xiàn)這些化合物的含量受草果原料的粉碎粒度、不同萃取方法的影響而存在較大差異。

圖5 草果主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量Fig.5 The relative content of main volatile flavor substances in Amomum tsao-ko

由圖5可知，桉樹醇用水蒸氣蒸餾法萃取的量相對(duì)較高，在粉碎粒徑小于40目時(shí)相對(duì)含量最高，但其并不隨著粉碎粒徑的減小而增加。(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛和2-甲基-3-苯基丙醛2種化合物采用微波無溶劑萃取法提取的量相對(duì)水蒸氣蒸餾法高，在粉碎粒徑介于20～40目時(shí)相對(duì)含量最高，而(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛與(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛是同分異構(gòu)體，但在草果粉碎粒徑介于20～40目時(shí)水蒸氣蒸餾萃取的量最高，這可能與揮發(fā)性風(fēng)味化合物的性質(zhì)有關(guān)，(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛有強(qiáng)烈的檸檬香氣，易揮發(fā)。

對(duì)草果中次要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量進(jìn)行分析比較，見圖6。

圖6 草果中次要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量Fig.6 The relative content of secondary volatile flavor substances in Amomum tsao-ko

注：1為α-蒎烯，2為β-蒎烯，3為α-水芹烯，4為檸檬烯，5為鄰-異丙基苯，6為正辛醛，7為(E)-2-辛烯醛,8為(E)-2-癸烯醛,9為α-松油醇，10為香葉醇，11為(E)-2-十二烯醛,12為4-茚滿甲醛，13為α-甲基肉桂醛，14為橙花叔醇。

由圖6可知，化合物(E)-2-癸烯醛在次要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中含量最高，且其采用微波無溶劑萃取的量高于水蒸氣蒸餾法，在微波無溶劑萃取時(shí)，隨著草果粉碎粒度的增加，萃取所得的相對(duì)含量呈緩慢增加趨勢。α-松油醇、香葉醇、4-茚滿甲醛、α-甲基肉桂醛和橙花叔醇5種次要風(fēng)味化合物在微波無溶劑萃取中的量亦高于水蒸氣蒸餾法，其中，α-甲基肉桂醛和橙花叔醇2種化合物隨著草果粉碎粒徑的增加相對(duì)含量呈緩慢下降趨勢。α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、檸檬烯、鄰-異丙基苯5種化合物用水蒸氣蒸餾法萃取所得的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于微波無溶劑萃取，說明這5種化合物相對(duì)比較穩(wěn)定，適合用水蒸氣蒸餾法萃取。粉碎粒徑和萃取方法對(duì)正辛醛的量影響較小，(E)-2-辛烯醛在萃取方法上差異不大，但粉碎粒徑對(duì)其萃取量有較大影響，但不呈現(xiàn)規(guī)律，這可能與該化合物的性質(zhì)有關(guān)。

草果中微量風(fēng)味化合物和痕量風(fēng)味化合物多達(dá)79種，在數(shù)量上遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于主要和次要風(fēng)味化合物，但其相對(duì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于主要和次要風(fēng)味化合物，僅占總風(fēng)味化合物的6.76%～8.77%。這些微量風(fēng)味化合物的相對(duì)含量在萃取方法上存在較大差異，特別是酸類化合物，如辛酸、壬酸、正己酸，在微波無溶劑萃取中的相對(duì)含量是水蒸氣蒸餾法的2～4倍，而且在同一種萃取方法中，酸類化合物隨著原料粉碎粒度的增加相對(duì)含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，月桂烯、羅勒烯、檜烯等微量烯類化合物采用水蒸氣蒸餾萃取的相對(duì)含量是微波無溶劑萃取法的2～10倍，且隨著原料粉碎的增加相對(duì)含量呈現(xiàn)先降低后緩慢增加的趨勢。

3 結(jié)論

采用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)云南怒江草果的揮發(fā)油進(jìn)行分析鑒定，共鑒定出97種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國內(nèi)外的研究報(bào)道,相對(duì)含量低于1%以下的微量風(fēng)味化合物和痕量風(fēng)味化合物多達(dá)79種，在數(shù)量上遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于主要和次要風(fēng)味化合物，但其相對(duì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于主要和次要風(fēng)味化合物，僅占總風(fēng)味化合物的6.76%～8.77%。云南怒江州草果揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要由桉樹醇、(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛和2-甲基-3-苯基丙醛以及少量的(E)-2-癸烯醛、α-松油醇、α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、檸檬烯、鄰-異丙基苯、正辛醛、(E)-2-辛烯醛、香葉醇、 (E)-2-十二烯醛、4-茚滿甲醛、α-甲基肉桂醛、橙花叔醇18種化合物組成，其相對(duì)含量占總風(fēng)味化合物的91.23%～93.24%。采用微波無溶劑萃取法萃取草果揮發(fā)油與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法相比，微波功率為500 W，萃取時(shí)間為60 min即可萃取出94.46%的揮發(fā)油，具有時(shí)間快、效率高等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)GC-TOF-MS分析鑒定，(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、2-甲基-3-苯基丙醛、α-松油醇、香葉醇、4-茚滿甲醛、α-甲基肉桂醛和橙花叔醇等部分風(fēng)味化合物適合用微波無溶劑萃取，桉樹醇、α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、檸檬烯、鄰-異丙基苯、月桂烯、羅勒烯、檜烯等化合物適合用水蒸氣蒸餾萃取。萃取前草果粉碎粒度對(duì)其萃取所得揮發(fā)油中的風(fēng)味物質(zhì)組成及相對(duì)含量有較大影響，粉碎越細(xì)，揮發(fā)油的萃取量越高，水蒸氣蒸餾萃取的量可達(dá)到3.521 mL/100 g，遠(yuǎn)高于谷風(fēng)林等(1.3～2.7 mL/100 g)、Li W等(1.82 mL/100 g)的研究報(bào)道，這可能與原料及原料的粉碎粒度有關(guān)。丁艷霞等研究報(bào)道了微波輔助提取、超聲波輔助萃取和水蒸氣蒸餾萃取3種方法萃取草果精油的差異，雖然微波輔助萃取(4.50%)、超聲波輔助萃取(3.82%)的草果精油高于水蒸氣蒸餾法(2.75%)，但其使用正己烷作為溶劑，而且水蒸氣蒸餾萃取時(shí)間長達(dá)7.5 h，本實(shí)驗(yàn)中采用微波無溶劑萃取和水蒸氣蒸餾萃取兩種萃取方法所得揮發(fā)油含量差異大，這可能與微波無溶劑萃取法萃取時(shí)間短有關(guān)，其萃取工藝仍需要進(jìn)一步優(yōu)化，桉樹醇的相對(duì)含量隨粉碎粒度的增加而逐漸增加，(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、2-甲基-3-苯基丙醛和(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛在粉碎粒度介于20～40目之間的相對(duì)含量最高。