β3Gn-T8對胃癌AGS細(xì)胞增殖能力的影響*

劉振華，沈 力，吳士良△

(1蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院病理教研室， 江蘇 蘇州 215009； 2蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 江蘇 蘇州 215123)

胃癌是常見的消化道系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率率較高。人β1,3-N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶8(β-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 8，β3Gn-T8)是利用TBLASTN信息途徑，以信息探針β3GalT1在NCBI的EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源篩選，從人肺cDNA文庫中克隆到的一種新的糖基轉(zhuǎn)移酶基因[1],該基因在結(jié)腸癌和肝癌高表達(dá)而且能夠促進(jìn)結(jié)腸癌和肝癌侵襲轉(zhuǎn)移[2-3]，但關(guān)于該基因?qū)ξ赴┥飳W(xué)行為影響的研究較少。本研究探討β3Gn-T8對胃癌AGS細(xì)胞增殖的影響，為尋找胃癌的生物治療靶標(biāo)提供線索。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃腺癌細(xì)胞株AGS由中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。β3Gn-T8表達(dá)載體pEGFP-C1-β3Gn-T8由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存?？功?Gn-T8多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備。引物設(shè)計(jì)采用Genetyx軟件，并經(jīng)GenBank BLAST同源檢索后由上海英駿公司合成。β3Gn-T8的正向引物序列為5′-CCCTGACTTCGCCTCCTAC-3′，反向引物序列為5′-GGTCTTTGAGCGTC-TGGTTGA-3′;內(nèi)參照β-actin的正向引物序列為5′-CCTCTATGCCAACCACAGTGC-3′，反向引物序列為5′-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3′。10只SPF雌性 BALB/c裸小鼠[許可證號(hào)為SCXK(蘇)2007-0005)]購自蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自Invirogen；MTT和DMSO購自Sigma。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株AGS培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清的Ham’s F12培養(yǎng)基中，置37 ℃、 5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d傳代1次。細(xì)胞貼壁生長，至70%～80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA液消化傳代。

2.2pEGFP-C1和 pEGFP-C1-β3Gn-T8轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞 在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前天將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)皿(35 mm)，轉(zhuǎn)染當(dāng)天，更換1 mL新鮮的無血清培養(yǎng)基，逐滴加入100 μL脂質(zhì)體/DNA混合物于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，邊加邊輕搖培養(yǎng)板。37 ℃孵育6 h，6 h后更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入2 mL含10%小牛血清的新鮮生長培養(yǎng)基。

2.3RT-PCR檢測β3Gn-T8的mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染β3Gn-T8 表達(dá)載體后，分別在24 h、48 h和72 h收集細(xì)胞?？俁NA提取采用TRIzol一步法。RT操作如下：加入RNA模板4 μL、隨機(jī)引物2 μL、0.1%DEPC水9 μL，在70 ℃反應(yīng)5 min后，迅速降至4 ℃，再加入5×MMLV緩沖液8 μL、25 mmol/L dNTP 1 μL、RNAsin 0.5 μL、MMLV 1 μL、0.1% DEPC水14.5 μL，經(jīng)過37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min反應(yīng)后，迅速降至4 ℃。以所獲cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系如下：10×buffer 2.5 μL、MgCl21.5 μL、 dNTP 1 μL、GAPDH上下游引物各 1 μL、RT生成的cDNA 1 μL、Taq酶0.5 μL、加ddH2O補(bǔ)至反應(yīng)體積25 μL。94 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃變性30 s、55 ℃退火45 s 、72 ℃延伸75 s，循環(huán)25次，72 ℃后延伸7 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物10 μL和上樣緩沖液2 μL混合上樣，與DL2000 DNA marker一起在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳分離后，溴乙啶染色10 min，圖像分析儀(UVP)拍照并分析結(jié)果。圖像分析使用BandScan 4.0軟件，分析目的條帶總灰度，并使用內(nèi)參照校準(zhǔn)。

2.4Western blot法檢測蛋白的表達(dá) 蛋白樣品制備及定量后， SDS-PAGE分離，時(shí)間3 h～4 h，起始電壓80 V，樣品進(jìn)入分離膠后轉(zhuǎn)為130 V，電泳至溴酚蘭剛跑出即終止。剝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)好的PVDF膜有蛋白的一面標(biāo)記，1×麗春紅染液染色5 min～10 min，封閉液室溫下封閉1 h，將 I 抗用含0.05% Tween-20 的TBS稀釋至適當(dāng)濃度，室溫下孵育1 h～2 h。同上法準(zhǔn)備 II 抗稀釋液，室溫下孵育1 h～2 h后用TBST洗膜6次，每次5 min?；瘜W(xué)發(fā)光、顯影、定影，將膠片進(jìn)行透射掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。使用BandScan 4.0分析條帶總灰度，并使用內(nèi)參照校準(zhǔn)。

2.5MTT法測定細(xì)胞活力 將細(xì)胞分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組:未處理對照(control)組、pEGFP-C1組和pEGFP-C1-β3Gn-T8組。將每組細(xì)胞接種于96孔板，消化細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞數(shù)，使每孔細(xì)胞數(shù)為4 000個(gè)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。分別于細(xì)胞處理24 h、48 h、72 h和96 h棄去上清，加入培養(yǎng)基180 μL，每孔再加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸出培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測儀上于570 nm 波長處讀取標(biāo)本的吸光度(A)值，各組的吸光度與對照組的吸光度比值為細(xì)胞活力。

2.6臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù) 將處于對數(shù)生長期的未轉(zhuǎn)染組、pEGFP-C1組和 pEGFP-C1-β3Gn-T8組AGS細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于 6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱過夜，24 h后，用胰酶消化細(xì)胞，采用臺(tái)盼藍(lán)染色，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將各組細(xì)胞接種于96孔板，消化細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞數(shù)，使每孔細(xì)胞數(shù)為4 000個(gè)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔；細(xì)胞處理48 h后，調(diào)整待測細(xì)胞的濃度為5×108～1×109個(gè)/L；取1 mL細(xì)胞，1 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清；加入1 mL冷PBS，輕輕振蕩使細(xì)胞懸浮，1 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清；將細(xì)胞重懸于200 μL binding buffer；加入10 μL annexin V-FITC和10 μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min；加入300 μL binding buffer，立即上機(jī)檢測。

2.8裸鼠飼養(yǎng)及體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測 4周～5周齡，體重20～24 g的雌性BALB/c裸小鼠10只于無特定病原體(SPF)環(huán)境飼養(yǎng)。將動(dòng)物隨機(jī)分2組，每組5只。分別接種細(xì)胞懸液，對照組為未處理AGS細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-β3Gn-T8的AGS細(xì)胞。用碘伏消毒受種裸鼠右側(cè)頸部，用1 mL注射器吸取0.2 mL細(xì)胞懸液(含有細(xì)胞數(shù)>2×106個(gè))接種于皮下，觀察瘤塊成形。每4 d 游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積1 次，28 d 頸椎脫位處死裸鼠，完整剝離瘤體，計(jì)算體積，瘤體積=1/2ab2(a為長徑，b為短徑)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染正義載體后β3Gn-T8的mRNA表達(dá)變化

轉(zhuǎn)染β3Gn-T8 正義載體pEGFP-C1-β3Gn-T8后，在24 h、48 h和72 h分別檢測β3Gn-T8的mRNA表達(dá)水平。在24 h開始出現(xiàn)β3Gn-T8的mRNA表達(dá)的升高，在48 h和72 h仍持續(xù)高表達(dá)。與對照組比較，在24 h、48 h和72 h點(diǎn)，β3Gn-T8的 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)，見圖1。

Figure 1. The mRNA expression of β3Gn-T8 in the AGS cells after transfection with pEGFP-C1-β3Gn-T8. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.
圖1 轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-β3Gn-T8后AGS細(xì)胞β3Gn-T8的mRNA表達(dá)變化

2 轉(zhuǎn)染正義載體后β3Gn-T8蛋白表達(dá)的變化

轉(zhuǎn)染β3Gn-T8 正義載體后，在48 h和72 h，β3Gn-T8蛋白的表達(dá)較對照組顯著升高(P<0.01)，見圖2。

Figure 2. The protein expression of β3Gn-T8 in the AGS cells after transfection with pEGFP-C1-β3Gn-T8. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.
圖2 轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-β3Gn-T8后AGS細(xì)胞β3Gn-T8蛋白表達(dá)的變化

3 β3Gn-T8對AGS細(xì)胞增殖的影響

與對照組相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-β3Gn-T8后，24 h、48 h、72 h和96 h AGS細(xì)胞的活力明顯增加(P<0.05或P<0.01)。各時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)以相對A值(相對于16 h的比值)繪制生長曲線，見圖3。

Figure 3. MTT assay was used to detect the changes in cell viability at different time points (24 h, 48 h, 72 h and 96 h). Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.
圖3 采用MTT實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)點(diǎn)檢測細(xì)胞活力的變化

用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算活細(xì)胞數(shù)目的實(shí)驗(yàn)中，與對照組比較，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-β3Gn-T8組存活細(xì)胞數(shù)量增多(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The viable cells counted by the method of trypan blue exclusion. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.
圖4 臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)

4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

與對照組相比，pEGFP-C1-β3GnT8組細(xì)胞的凋亡率無明顯變化，見圖5。

Figure 5. Flow cytometry was used to detect the apoptotic rate of AGS cells. Mean±SD.n=3.
圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測AGS細(xì)胞凋亡率

5 移植瘤成瘤時(shí)間、體積和重量的變化

對照組在接種后4～5 d 出現(xiàn)肉眼可見的瘤體；pEGFP-c1-β3Gn-T8組在接種瘤細(xì)胞后3～4 d長出肉眼可見的瘤體。實(shí)驗(yàn)終止后，對移植瘤的最終體積和最終重量進(jìn)行比較，pEGFP-C1-β3Gn-T8組的體積和重量均大于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 裸鼠成瘤情況Table 1. Tumor formation in nude mice (Mean±SD. n=5)

*P<0.05vscontrol group.

6 移植瘤生長曲線

以各組移植瘤的體積均值為縱座標(biāo)，觀察天數(shù)為橫座標(biāo)，繪制生長曲線圖。比較各組曲線斜率的差異，結(jié)果顯示pEGFP-C1-β3Gn-T8組生長曲線斜率明顯大于對照組(P<0.05)，提示pEGFP-C1β3Gn-T8組腫瘤的生長速度較對照組快，見圖6。

Figure 6. Growth curve of transplanted tumor. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.
圖6 移植瘤生長曲線

討 論

糖基轉(zhuǎn)移酶可以直接改變細(xì)胞表面糖基化復(fù)合體受體和細(xì)胞黏附分子的糖鏈，從而促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞的生長。前期研究發(fā)現(xiàn)，β3Gn-T8可促進(jìn)喉癌Hep-2細(xì)胞[4]、白血病HL-60細(xì)胞[5]和膠質(zhì)瘤細(xì)胞[6]的增殖。胃癌組織中β3Gn-T8表達(dá)增加[7]，與胃癌侵襲能力相關(guān)。本文通過上調(diào)該基因的表達(dá)研究了其對胃癌細(xì)胞的增殖及裸鼠移植瘤的形成的影響。

pEGFP-C1是一種具有熒光蛋白的真核表達(dá)載體，能夠穩(wěn)定高表達(dá)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中插入的外源片段。脂質(zhì)體是一種應(yīng)用廣泛的非病毒載體，是由雙層結(jié)構(gòu)組成的封閉囊泡，具有良好的生物相容性。它通過內(nèi)吞作用將DNA引入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染率高，重復(fù)性好，包裝容量大，能保護(hù)DNA不被核酸酶降解。本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA，在mRNA和蛋白水平成功上調(diào)AGS細(xì)胞β3Gn-T8的表達(dá)。

增殖異常是腫瘤細(xì)胞的重要特征之一。MTT比色法檢測AGS細(xì)胞的活力，pEGFP-C1-β3Gn-T8組明顯高于對照組，活細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示pEGFP-C1-β3Gn-T8組顯著高于對照組，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示β3Gn-T8能促進(jìn)AGS細(xì)胞增殖。有報(bào)道干擾β3Gn-T8的表達(dá)導(dǎo)致白血病細(xì)胞K562細(xì)胞周期在G1/S期停滯[8]。用流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-β3Gn-T8組與對照組的細(xì)胞凋亡率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，說明胃癌細(xì)胞的加速生長不是由于細(xì)胞凋亡的增加，而是生長速率的增加。

裸鼠致瘤性是檢測細(xì)胞惡性特性的方法之一[9]。將pEGFP-C1-β3Gn-T8和對照組2組胃癌細(xì)胞接種于裸鼠皮膚下，成瘤率為100%，pEGFP-C1-β3Gn-T8組成瘤時(shí)間明顯短于對照組，移植瘤最終體積和重量均顯著大于對照組。比較各組的生長曲線，pEGFP-C1-β3Gn-T8組的斜率明顯高于對照組。上述結(jié)果表明，上調(diào)β3Gn-T8可以促進(jìn)移植瘤的生長。

有研究報(bào)道[10]，胃癌組織β3Gn-T8表達(dá)增加，且與胃癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性有關(guān)。β3Gn-T8在肝癌的表達(dá)增加，且通過改變CD-147蛋白表面的糖鏈結(jié)構(gòu)，影響肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移[3]。垂體腫瘤β3Gn-T8表達(dá)增加，且與惡性度正相關(guān)[11]。在130例白血病骨髓樣本中，β3Gn-T8和催化產(chǎn)物多聚乳糖胺鏈表達(dá)增加[12]。上述結(jié)果與本文結(jié)果相似，提示β3Gn-T8對腫瘤的惡性生物學(xué)行為有重要影響，是潛在的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，β3Gn-T8對胃癌AGS細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用，促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞的裸鼠移植瘤的成瘤作用。