柚皮素通過調(diào)控AMPK/Nrf2/HO-1信號通路減輕糖尿病小鼠心肌損傷*

李 燕，馮 健△，謝發(fā)江，鄧 莉，李亞菲，游麗萍

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1心內(nèi)科，2風(fēng)濕免疫科， 四川 瀘州 646000)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種常見、多發(fā)的慢性疾病，近年來，其發(fā)病率逐漸上升，糖尿病可致多種并發(fā)癥，其中以心血管并發(fā)癥危害最嚴(yán)重[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)作為糖尿病的獨(dú)立心臟并發(fā)癥，是造成糖尿病患者死亡的主要原因之一。長期高糖刺激可引起心肌細(xì)胞肥大、凋亡、纖維化，致心肌細(xì)胞損傷，使心臟的收縮與舒張功能受損，最終形成心力衰竭[2-3]。DCM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，國內(nèi)外許多研究表明氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)在DCM發(fā)病過程中占據(jù)重要地位，DM代謝紊亂可使心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)產(chǎn)生過多的過氧化物產(chǎn)物，致使心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)增加，ROS可通過激活核因子 κB(nuclear factor κB，NF-кB)啟動腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL-6)和IL-10等炎癥因子及抗炎因子的轉(zhuǎn)錄，促使心肌細(xì)胞發(fā)生炎癥損傷，ROS也可以激活心肌細(xì)胞凋亡通路的caspase-3和Bax，介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，正常的心肌細(xì)胞死亡后可使心肌成纖維細(xì)胞增生，形成心肌纖維化，最后導(dǎo)致DCM心臟結(jié)構(gòu)及功能異常[4-7]。

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)是機(jī)體內(nèi)抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，生理情況下Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，keap1)形成復(fù)合物，抑制其活性，當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時，一系列蛋白激酶發(fā)生磷酸化導(dǎo)致Nrf2與Keap1解耦聯(lián)并轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核內(nèi)，與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response elements，AREs)結(jié)合，啟動AREs調(diào)控的抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[8-11]。研究表明，Nrf2可以被腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)激活[12-14]，Nrf2被激活后可啟動下游的谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)、還原性谷胱甘肽(reduced glutathione hormone，GSH)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthethase，γ-GCS)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)、NAD(P)H：醌氧化還原酶[NAD(P)H：quinone oxidoreductase 1，NQO1]、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)等抗氧化基因的表達(dá)，發(fā)揮其抗氧化反應(yīng)的作用，快速有效地清除體內(nèi)產(chǎn)生的過多的ROS，從而減輕DCM心肌損傷[8-11]。

柚皮素(naringenin，NAR)是一種天然黃酮類化合物，大量研究表明，NAR具有調(diào)節(jié)代謝、抗炎、抗氧化和抗纖維化等作用[15-17]。目前已經(jīng)有研究表明NAR可以改善DCM，其機(jī)制可能與改善胰島素抵抗，減輕炎癥、纖維化及凋亡有關(guān)，但AMPK/Nrf2/HO-1信號通路及氧化應(yīng)激與NAR抗DCM心肌細(xì)胞損傷的相關(guān)性尚未見文獻(xiàn)報道，故我們擬以AMPK/Nrf2/HO-1信號通路為切入點(diǎn)，通過STZ誘導(dǎo)1型糖尿病小鼠模型并給予NAR干預(yù)，觀察AMPK/Nrf2/HO-1信號通路蛋白水平變化，心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥、凋亡反應(yīng)及心肌纖維化，探討NAR對糖尿病小鼠心肌的保護(hù)作用及機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動物、試劑與藥品

1.1動物 SPF級健康6～8周齡雄性C57BL/6小鼠50只，體重(20.8±0.5) g，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司。飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)恒溫動物實驗室，溫度(23±2 ℃)，實驗期間進(jìn)食普通飼料，自由飲水，每日12 h光照維持晝夜循環(huán)，飼養(yǎng)環(huán)境符合實驗動物環(huán)境設(shè)施要求。

1.2藥品與試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自Sigma；NAR購自思域化工科技有限公司；抗AMPKα、p-AMPKα、cleaved caspase-3和Nrf2抗體購自CST；抗GAPDH、HO-1和NQO1抗體購自Abcam；抗IL-10抗體和TUNEL試劑盒購自上海斯信生物科技有限公司；抗IL-6抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；SOD測試盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測試盒和BAC蛋白濃度測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；ROS檢測熒光探針DHE購自南京凱基生物公司；HRP標(biāo)記兔抗山羊II抗、HRP標(biāo)記山羊抗兔II抗、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠II和HRP標(biāo)記山羊抗大鼠II抗均購自ASPEN。

2 實驗方法

2.1分組、糖尿病小鼠模型建立 實驗動物分為正常(normal，N)組和模型組，健康雄性C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后，對模型組小鼠禁食12 h，采用腹腔注射1%鏈脲佐菌素80 mg·kg-1·d-1(pH為4.5，4 ℃，現(xiàn)配現(xiàn)用)，N組予以腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液，連續(xù)5 d，2周后測小鼠尾靜脈血糖>16.7 mmol/L視為糖尿病小鼠模型建立成功，成模后，將模型組的小鼠隨機(jī)分為糖尿病(diabetes mellitus,D)組、低劑量NAR干預(yù)組(D+L-NAR組)、中等劑量NAR干預(yù)組(D+M-NAR組)和高劑量NAR干預(yù)組(D+H-NAR組)。

2.2給藥方法 糖尿病小鼠成模后開始給藥，對D+L-NAR組、D+M-NAR組和D+H-NAR組的小鼠分別給予25 mg/kg、50 mg/kg和75 mg/kg NAR灌胃，N組與D組的小鼠給予與D+M-NAR組等體積的生理鹽水灌胃，每日1次，共6周。

2.3體重、血糖的測定和心臟取材 觀察各個時期小鼠情況，每周測1次體重及血糖，實驗結(jié)束后，予以腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，分離出心臟并將心臟組織分為心尖部及心底部兩部分，將心尖組織用4%多聚甲醛固定并制作成厚4 μm的石蠟切片，心底部組織凍存于-80 ℃冰箱，用于Western blot及生化檢測。

2.4心臟組織病理學(xué)觀察 將各組的石蠟切片脫蠟至水，分別行HE及Masson染色，脫水封片，用于光鏡下觀察拍照。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)，CVF(%)=膠原面積/視野總面積×100%。

2.5免疫組化觀察IL-6及IL-10在心肌組織中的水平 將切片脫蠟至水，用PBS洗3次,每次5 min，EDTA緩沖液中微波修復(fù)，中火至沸后斷電，間隔10 min低火至沸，冷卻后，PBS洗3次，每次5 min，于3%過氧化氫溶液中室溫下避光孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min，甩干后用5% BSA封閉20 min，去除BSA液，加入稀釋后的 I 抗IL-6(1∶100)、IL-10(1 ∶100)覆蓋組織，4 ℃過夜，PBS洗3次，每次5 min，去除PBS液，加入 II 抗37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片。圖片用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析并計算每例樣本的平均吸光度(mean absorbance，MA)值。

2.6TUNEL熒光染色觀察心肌細(xì)胞凋亡情況 選取各組石蠟切片充分脫蠟水化，加蛋白酶K工作液覆蓋組織37 ℃孵育15 min，于PBS液中在脫色搖床上晃動洗3次，每次5 min，隨后滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育10 min，于PBS液中在脫色搖床上晃動洗3次，每次5 min，取TUNEL試劑盒內(nèi)適量試劑1(TdT)和試劑2(dUTP)按1 ∶ 9混合覆蓋組織，放在37 ℃水浴鍋內(nèi)孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min，滴加適量DAPI染液到切片上，室溫避光孵育5 min，PBS洗3次，每次5 min，滴加抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

在產(chǎn)能持續(xù)擴(kuò)大、市場與技術(shù)日趨成熟、國家政策支持等因素的綜合作用下，1990-2010年，我國磷肥產(chǎn)量年均遞增6.6%，在2001年至2010年這10年間，我國高濃度磷復(fù)肥產(chǎn)量從年產(chǎn)300萬噸躍增到年產(chǎn)1300萬噸。2005年，我國磷肥產(chǎn)量首次躍居世界第一位；2006年，國產(chǎn)磷肥實現(xiàn)自給自足。從2007年起，我國一舉成為世界磷肥出口第一大國。

2.7DHE染色測定心肌組織中ROS的生成 取各組冰凍組織用冰凍切片機(jī)切片，用DMSO溶解備用的DHE配制成濃度為5 mmol/L的溶液，并將溶液按照1 ∶1 000的比例稀釋后備用，將稀釋好的探針溶液滴加到組織切片中，37 ℃孵育30 min，PBS洗去多余探針溶液，用抗熒光淬滅劑封片，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.8MDA及SOD的檢測 用BCA法測定組織中蛋白的濃度，再根據(jù)試劑盒的操作方法測定，并根據(jù)公式計算出心臟組織中MDA的含量及SOD的活力。

2.9Western blot測定蛋白水平 取各組小鼠心臟凍存組織，剪碎組織并按體積比1 ∶10加入組織裂解液，冰浴30 min徹底勻漿，收集裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液為總蛋白溶液，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)所需樣本體積，按4∶1比例加入5×loding buffer，混勻后100 ℃沸水浴5 min使蛋白變性。配制分離膠和濃縮膠，按蛋白量40 μg上樣，進(jìn)行電泳分離并轉(zhuǎn)膜，經(jīng)5% BSA液封閉1 h后，加入 I 抗 [AMPKα(1∶2 000)、p-AMPKα(1∶2 000)、Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶1 000)、NQO1(1∶1 000)、cleaved caspase-3(1∶1 000)及GAPDH(1∶10 000)]，4 ℃條件下孵育過夜，TBST(pH=7.4)洗膜3次，每次5 min，加入稀釋的II抗(1∶10 000)中，室溫孵育30 min，TBST洗膜3次，每次5 min，ECL液顯色，掃描存檔并用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)方法，并進(jìn)行方差齊性檢驗，方差齊則采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NAR對糖尿病小鼠血糖及體重的影響

N組小鼠血糖值在注射檸檬酸緩沖液前后的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；D組小鼠血糖較成模前有明顯升高(P<0.05)；各個干預(yù)組小鼠血糖成模時明顯有升高(P<0.05)，干預(yù)后較成模時血糖降低(P<0.05)。與N組比較，成模時，D組血糖水平明顯升高(P<0.05)，干預(yù)后，與D組比較，干預(yù)組血糖有所下降(P<0.05)，但各個干預(yù)組之間血糖的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與N組比較，D組小鼠成模時，體重明顯下降(P<0.05)，與D組比較，各個干預(yù)組小鼠在NAR干預(yù)后，體重上升(P<0.05)，但各個干預(yù)組之間小鼠體重的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，說明NAR可使糖尿病小鼠的血糖降低，體重升高，見圖1。

2 NAR對糖尿病小鼠心臟組織病理學(xué)的影響

光鏡下觀察各組小鼠心肌細(xì)胞HE染色及Masson染色，Masson染色中，心肌纖維染成紅色，膠原纖維染成藍(lán)色。可見N組心肌細(xì)胞形態(tài)大小均勻、排列整齊，輪廓清晰，心肌纖維完整，未出現(xiàn)斷裂等，心肌纖維間可見少量染成藍(lán)色的膠原纖維；D組心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯變形，形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂、疏松，心肌纖維部分卷曲、斷裂，部分核固縮，且與N組比較，D組染成藍(lán)色的膠原纖維明顯增加，CVF增大(P<0.05)；與D組比較，干預(yù)組心肌細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，排列較整齊，心肌纖維卷曲、斷裂減輕，染成藍(lán)色的膠原纖維有所下降，CVF減小(P<0.05)；與D+L-NAR組比較，D+M-NAR及D+H-NAR組染成藍(lán)色的膠原纖維更少，CVF降低更明顯(P<0.05)，說明

Figure 1. The changes of blood glucose and body weight in the mice were detected. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsD group;sP<0.05vs0 week group;△P<0.05vs3 week group.
圖1 各組小鼠血糖及體重的變化

糖尿病小鼠心肌存在變性及纖維化，且NAR干預(yù)可呈劑量依賴性減輕心肌變性及纖維化，見圖2。

Figure 2. The images of cardiac tissues with HE staining and Masson staining in each group under light microscope (×400) and the CVF value in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsD group;sP<0.05vsD+L-NAR group.
圖2 光鏡下觀察各組小鼠心臟組織HE及Masson染色

3 NAR對糖尿病小鼠心臟組織中炎癥因子IL-6及抗炎因子IL-10水平的影響

心肌細(xì)胞中的IL-6及IL-10主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，陽性反應(yīng)IL-6及IL-10表達(dá)被染成棕色。與N組相比，D組IL-6的蛋白水平明顯增加，IL-10的蛋白水平明顯減低(P<0.05)；與D組相比，干預(yù)組IL-6的蛋白水平有所下降，且NAR的劑量越高，IL-6的蛋白水平下降越明顯(P<0.05)，而干預(yù)組IL-10的蛋白水平有所上升，且NAR劑量越大IL-10的蛋白水平上升越明顯(P<0.05)。由此可見，NAR可減輕心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，且呈劑量依賴性，見圖3。

Figure 3. The protein expression of IL-6 and IL-10 in the cardiac tissues of different groups under light microscope (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsD group;sP<0.05vsD+L-NAR group;xP<0.05vsD+M-NAR group.
圖3 各組小鼠心臟組織IL-6及IL-10蛋白表達(dá)的變化

4 NAR對糖尿病小鼠心臟組織凋亡情況的影響

用TUNEL染色觀察各組小鼠心臟組織的凋亡情況，N組內(nèi)，可以觀察到少量呈現(xiàn)綠色熒光的斷裂的DNA；與N組比較，D組內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光的斷裂的DNA明顯增多，凋亡率明顯增加(P<0.05)，與D組比較，干預(yù)組呈現(xiàn)綠色熒光的斷裂的DNA減少，凋亡率降低(P<0.05)，與D+L-NAR組比較，D+M-NAR及D+H-NAR組凋亡率進(jìn)一步降低(P<0.05)，且與D+M-NAR組比較，D+H-NAR組凋亡率降低更明顯(P<0.05)。由此可說明糖尿病小鼠存在心肌細(xì)胞凋亡，NAR干預(yù)可減輕心肌細(xì)胞凋亡，且NAR劑量越大，細(xì)胞凋亡減少越明顯，見圖4。

Figure 4. The images of TUNEL staining in the cardiac tissues of each group under fluorescence microscope (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsD group;sP<0.05vsD+L-NAR group;xP<0.05vsD+M-NAR group.
圖4 熒光顯微鏡下觀察各組小鼠心臟組織TUNEL染色

5 NAR對糖尿病小鼠心臟組織中ROS及MDA的含量和SOD活性的影響

通過熒光染色觀察各組小鼠心臟組織中ROS，熒光顯微鏡下，細(xì)胞核被DAPI染液染成藍(lán)色，細(xì)胞內(nèi)被活性氧熒光檢測探針標(biāo)記的DHE呈現(xiàn)為紅色，主要觀察陽性紅染結(jié)果。通過生化檢測試劑盒檢測各組小鼠心臟組織中MDA含量及SOD活性。N組內(nèi)可觀察到部分呈現(xiàn)紅色熒光，與N組相比較，D組的熒光明顯增多，活性氧的生成率明顯升高，且MDA含量明顯升高，SOD活性降低(P<0.05)；與D組相比較，D+L-NAR組活性氧生成率、MDA含量及SOD活性的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，D+M-NAR組及D+H-NAR組活性氧的生成率有所下降、MDA含量降低、SOD的活性有所升高，且D+H-NAR組變化更明顯(P<0.05)。由此，可知糖尿病小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化損傷，NAR可影響ROS的生成及SOD的活性，從而緩解糖尿病所致小鼠心肌細(xì)胞的氧化損傷，見圖5。

Figure 5. The change of ROS production, MDA contents and SOD activity in the cardiac tissues of each group. The images of ROS fluorescence staining in the cardiac tissues under fluorescence microscope were showed (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsD group;sP<0.05vsD+L-NAR group;xP<0.05vsD+M-NAR group.
圖5 各組小鼠心臟組織中ROS和MDA含量及SOD活性的變化

6 NAR對糖尿病小鼠心臟組織中AMPKα、Nrf2、HO-1、NQO1和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

與N組相比，D組的p-AMPKα、Nrf2、HO-1和NQO1蛋白水平明顯降低，cleaved caspase-3的蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與D組相比，NAR各干預(yù)組的p-AMPKα、Nrf2、HO-1和NQO1蛋白水平均明顯升高，且呈NAR濃度依賴性(P<0.05)；與D組相比，NAR各干預(yù)組的cleaved caspase-3蛋白水平有所下降，且NAR劑量越大，cleaved caspase-3蛋白水平的下降越明顯(P<0.05)。見圖6。

Figure 6. The protein levels of p-AMPKα, Nrf2, HO-1, NQO1 and cleaved caspase-3 in different groups determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsD group;△P<0.05vsD+L-NAR group;▲P<0.05vsD+M-NAR group.
圖6 各組小鼠心臟組織中p-AMPKα、Nrf2、HO-1、NQO1和cleaved caspase-3蛋白水平的變化

討 論

DM是一種以高血糖、高血脂及胰島素抵抗為主要表現(xiàn)的代謝綜合征，早期病變較輕，發(fā)展到后期可累積體內(nèi)各個系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)作為常被累及的系統(tǒng)之一，有許多嚴(yán)重的并發(fā)癥。在發(fā)病過程中，糖尿病代謝紊亂、氧化反應(yīng)及炎癥反應(yīng)活化、細(xì)胞凋亡增加及心肌纖維化、導(dǎo)致DCM發(fā)生[4-7]，最終累及心臟收縮舒張功能，發(fā)展為心力衰竭，若能阻斷上述過程，則可能改善臨床癥狀。

近年來，對生物活性物質(zhì)提取物的研究越來越廣泛，如銀杏提取物可以改善1型糖尿病大鼠心肌間質(zhì)纖維化[18]，姜黃素對2型糖尿病大鼠心肌具有保護(hù)作用[19]，但具體機(jī)制尚在研究中。Priscilla等[17]通過體內(nèi)外實驗研究發(fā)現(xiàn)，NAR可抑制糖尿病大鼠α葡萄糖苷酶活性，延緩餐后腸道對葡萄糖的吸收，降低餐后血糖水平，延緩DM病程，提示NAR是一種有臨床應(yīng)用前景的藥物。本實驗結(jié)果顯示，DM小鼠經(jīng)NAR連續(xù)治療6周后，血糖有所下降、體重有所回升，且通過HE染色可見，與D組相比較，經(jīng)過NAR處理的心肌細(xì)胞排列整齊，波浪變及纖維萎縮、斷裂也明顯減輕，證明了NAR對DM小鼠心臟具有保護(hù)作用。

大量研究表明，NAR能改善DCM，目前認(rèn)為可能與以下機(jī)制有關(guān)：(1)上調(diào)代謝相關(guān)途徑如IRS-1/PI3K/AKT信號通路的活性，改善DM所致的胰島素抵抗[2,20]；(2)NAR可以通過上調(diào)PKC-β及P38活性來減輕1型糖尿病小鼠心肌細(xì)胞纖維化[21]；(3)下調(diào)NF-κB p65的表達(dá)，降低下游炎癥因子的表達(dá)，減輕心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)[22]。(4)抑制心肌細(xì)胞Bax 表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，減輕心肌細(xì)胞凋亡[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，D組小鼠的CVF明顯升高，心臟組織中cleaved caspase-3蛋白水平明顯上調(diào)，且分析TUNEL染色可發(fā)現(xiàn)凋亡率明顯增加，免疫組化染色可觀察到IL-6蛋白水平增加，IL-10蛋白水平減少，表明在DM小鼠心臟組織內(nèi)存在炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，明顯的心肌纖維化及細(xì)胞凋亡。用NAR連續(xù)干預(yù)6周后，可發(fā)現(xiàn)干預(yù)組的CVF明顯降低，cleaved caspase-3蛋白水平下調(diào)，IL-6表達(dá)下降，IL-10表達(dá)升高，說明NAR可減輕炎癥反應(yīng)、纖維化及細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)DM心肌組織、減輕DCM的心肌損害的作用，且有劑量依賴性。

生理情況下，機(jī)體存在氧化-抗氧化反應(yīng)機(jī)制，且維持著平衡。當(dāng)受到高糖環(huán)境刺激時，可發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生過多的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛及過多的ROS。有研究表明，NAR可以降低氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的ROS，清除氧自由基，發(fā)揮抗氧化作用[21,23]，但具體機(jī)制尚不明確。SOD作為機(jī)體重要的抗氧化物酶可以清除體內(nèi)過度釋放的自由基，減少對細(xì)胞的損傷。因此，MDA常被用于反映機(jī)體的氧化損傷，而 SOD反映抗氧化能力?；诖?，本實驗檢測了心臟組織中ROS 的生成和 MDA的含量及SOD 的活性，并發(fā)現(xiàn)D組小鼠的ROS的生成明顯升高，MDA含量明顯增多，SOD活性降低，說明在糖尿病小鼠體內(nèi)存在明顯的氧化損傷，用NAR連續(xù)干預(yù)6周后，可發(fā)現(xiàn)ROS的生成明顯降低，MDA也相應(yīng)的減少，SOD活性增高，說明NAR可通過增強(qiáng)抗氧化反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)DM心肌組織的作用。

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶, 是由催化亞基α和β及調(diào)節(jié)亞基γ形成的異源三聚體，當(dāng)α亞基上72位點(diǎn)的蘇氨酸磷酸化活化為p-AMPKα而調(diào)節(jié)下游信號分子發(fā)揮生物學(xué)活性，AMPK在體內(nèi)主要參與調(diào)節(jié)糖、脂及能量代謝，有研究表明AMPK活化可以抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)[24]。Nrf2是調(diào)控機(jī)體抗氧化因子轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵分子，Nrf2/HO-1信號通路在維持機(jī)體抗氧化反應(yīng)中起重要作用，且目前已有多項研究表明Nrf2可被AMPK激活[13-15]。目前有少量研究表明，NAR有激活A(yù)MPK的作用，如NAR可以使AMPK磷酸化而活化，進(jìn)而增加骨骼肌細(xì)胞對葡萄糖的攝取[25]；NAR也可通過上調(diào)AMPK/SIRT3信號通路的活性改善缺血再灌注心肌細(xì)胞線粒體的功能，從而發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[26]；NAR還可以通過激活A(yù)MPK而發(fā)揮預(yù)防動脈粥樣硬化的作用[27]。但是NAR是否可通過調(diào)控AMPK/Nrf2/HO-1信號通路減輕DCM心肌損傷，尚未見文章報道。通過本實驗研究可見，在D組小鼠心臟組織中檢測到p-AMPKα、Nrf2、HO-1及NQO1的蛋白水平明顯降低，說明在糖尿病小鼠體內(nèi)AMPK活化受到抑制，Nrf2/HO-1信號通路被抑制；但在NAR干預(yù)后，p-AMPKα、Nrf2、HO-1及NQO1的蛋白水平明顯上調(diào)，由此可說明糖尿病誘導(dǎo)的AMPK/Nrf2/HO-1信號通路抑制可以被NAR激活。

綜上所述，NAR減輕糖尿病小鼠心肌損傷機(jī)制之一可能是通過抑制細(xì)胞凋亡，減輕纖維化及炎癥反應(yīng)及清除產(chǎn)生過多的ROS而發(fā)揮作用。本實驗也對DCM發(fā)病過程中氧化應(yīng)激反應(yīng)及AMPK/Nrf2/HO-1信號通路之間是否存在關(guān)系做了初步探究，但在DCM中，NAR發(fā)揮抗氧化反應(yīng)是否是通過AMPK/Nrf2/HO-1信號通路調(diào)控的有待進(jìn)一步研究。