miR-153通過(guò)靶向SORBS2促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞損傷*

吳瑞霞，黃 糧，白玉鵬，劉曉剛，胡立群

(武漢市第四醫(yī)院心血管內(nèi)科， 湖北 武漢 430000)

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)為18～25個(gè)核苷酸之間的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA分子，是一類參與細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子[1]。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致心肌炎性損傷的主要因素。之前很多研究已經(jīng)證明miR-153在腫瘤中具有抗腫瘤作用[2]。然而，miR-153是否參與脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷過(guò)程及機(jī)制仍有待闡明。Sorbin和SH3結(jié)構(gòu)域包含蛋白2(Sorbin and SH3 domain-containing protein 2，SORBS2)基因位于4p35.1，在心肌的Z帶表達(dá)，為一種銜接蛋白[3-4]。本研究擬以LPS誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)其中miR-153和SORBS2的表達(dá)，觀察抑制miR-153、過(guò)表達(dá)或抑制SORBS2對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞活力、炎癥因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)及凋亡的影響，揭示其機(jī)制與靶向SORBS2有關(guān)，將為心臟疾病的治療提供參考。

材 料 和 方 法

1 材料

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT和胰蛋白酶均購(gòu)自Sellect；LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa；PVDF膜購(gòu)自Roche；TNF-α檢測(cè)試劑盒、IL-6檢測(cè)試劑盒、SDS-PAGE 試劑盒、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)試劑盒購(gòu)自北京寶賽生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1心肌H9C2細(xì)胞損傷模型的建立及分組 用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)胚胎大鼠心肌H9C2細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。參考劉峰等[5]的實(shí)驗(yàn)選用500 μg/L LPS與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞共處理48 h，標(biāo)記為L(zhǎng)PS組。用等劑量的PBS與H9C2細(xì)胞共培養(yǎng)48 h，標(biāo)記為PBS組。運(yùn)用脂質(zhì)體將anti-miR-Con、anti-miR-153、pcDNA、pcDNA-SORBS2、anti-miR-153+si-Con和anti-miR-153+si-SORBS2轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后，在進(jìn)行LPS誘導(dǎo)處理48 h，分別標(biāo)記為anti-miR-Con組、anti-miR-153組、pcDNA組、pcDNA-SORBS2組、anti-miR-153+si-Con組和anti-miR-153+si-SORBS2組。

2.2RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H9C2細(xì)胞中miR-153和SORBS2 mRNA的表達(dá) TRIzol法提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞樣本總RNA,并用Nano-Drop 2000微量分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量。DNaseⅠ消化RNA中可能污染的DNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方式，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，合成模板鏈cDNA。按照反應(yīng)體系進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)分析Ct值，計(jì)算定量結(jié)果，以2-ΔΔCt法測(cè)定miR-124-3p的相對(duì)表達(dá)水平。每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。miR-124-3p的上游引物序列為5′-GCGGCGGTAAGGCACGCGGTG-3′,下游引物序列為5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′;內(nèi)參照U6的上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;SORBS2的上游引物序列為5′-AAATCACCATGCCCTCTACAAG-3′,下游引物序列為5′-CCCACTTTTATCACCATCGCAA-3′;內(nèi)參照GAPDH的上游引物序列為5′-GTCAGCCGCATCTTCTTTTG-3′,下游引物序列為5′-GCGCCCCAATACGACCAAATC-3′。

2.3Western blot檢測(cè)H9C2細(xì)胞中SORBS2的蛋白表達(dá) 取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞，RIPA裂解后用BCA進(jìn)行定量，變性離心后取上清進(jìn)行蛋白上樣。按照Western blot實(shí)驗(yàn)常規(guī)操作流程進(jìn)行電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-顯影曝光。ImageJ分析目的條帶的灰度值，以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)。

2.4ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H9C2細(xì)胞中TNF-α和IL-6的含量 按TNF-α檢測(cè)試劑盒和IL-6檢測(cè)試劑盒要求進(jìn)行TNF-α和IL-6的檢測(cè)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9C2細(xì)胞的凋亡 將2.1各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用 500 μL 的binding buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL的annexin V-FITC避光反應(yīng)20 min后再加入5 μL的PI避光反應(yīng)20 min，用300目銅篩過(guò)濾，最后在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀結(jié)束檢測(cè)。細(xì)胞的凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

2.6雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)H9C2細(xì)胞中miR-153與SORBS2的結(jié)合力 取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞，按照雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，以psiCHECK2-SORBS2-3’UTR WT和psiCHECK2-SORBS2-3’UTR MUT的表達(dá)為對(duì)照，觀察miR-153對(duì)SORBS2表達(dá)的影響。

2.7MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 收集需要檢測(cè)的細(xì)胞，取105個(gè)每孔的密度分別加入96孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入MTT試劑再培養(yǎng)4 h，最后加入DMSO結(jié)晶紫染色。將酶標(biāo)儀設(shè)置為450 nm波長(zhǎng)，檢測(cè)細(xì)胞的吸光度(A)值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，每組數(shù)據(jù)代表3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)包括2個(gè)技術(shù)重復(fù)。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LPS對(duì)心肌H9C2細(xì)胞miR-153和SORBS2表達(dá)的影響

與PBS組相比，LPS組H9C2細(xì)胞中miR-153的表達(dá)顯著升高，SORBS2的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。這表明LPS刺激后心肌H9C2細(xì)胞miR-153的表達(dá)增加，伴隨SORBS2表達(dá)的下調(diào)。

Figure 1. The changes of miR-153 and SORBS2 expression in the H9C2 cells. A: the expression level of miR-153 was detected by RT-qPCR; B: the mRNA expression of SORBS2 was detected by RT-qPCR; C: the protein level of SORBS2 was detected by Westerm blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPBS group.
圖1 心肌細(xì)胞中miR-153和SORBS2表達(dá)的變化

2 敲減miR-153表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-6分泌的影響

與PBS組相比，LPS組H9C2細(xì)胞中TNF-α和IL-6的含量均顯著升高；與LPS+anti-miR-con組相比，LPS+anti-miR-153組H9C2細(xì)胞中TNF-α和IL-6的含量均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。這一結(jié)果提示miR-153可促進(jìn)LPS刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放。

Figure 2. The effect of miR-153 on the secretion of inflammatory factors TNF-α and IL-6 in the H9C2 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPBS group;#P<0.05vsLPS+anti-miR-Con group.
圖2 miR-153的表達(dá)對(duì)心肌H9C2細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-6分泌的影響

3 敲減miR-153的表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)心肌H9C2細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的影響

與PBS組相比，LPS組H9C2細(xì)胞中細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高;與LPS+anti-miR-Con組相比，LPS+anti-miR-153組細(xì)胞中細(xì)胞活力顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖3。這一結(jié)果提示miR-153可抑制LPS刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞活力，促進(jìn)凋亡。

Figure 3. The changes of the viability (A) and apoptosis (B) of the H9C2 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLPS group;#P<0.05vsLPS+anti-miR-Con group.
圖3 心肌H9C2細(xì)胞活力和凋亡的變化

4 miR-153靶向調(diào)控SORBS2

運(yùn)用miRcode數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到miR-153與SORBS2 3’UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖4A。雙螢光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-153組WT-SORBS2細(xì)胞中螢光素酶活性顯著降低，MUT-SORBS2細(xì)胞中螢光素酶活性不受影響，見(jiàn)圖4B。與miR-Con組相比，miR-153組細(xì)胞中SORBS2表達(dá)顯著降低; 與anti-miR-Con組相比，anti-miR-153組細(xì)胞中SORBS2表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖4C。上述結(jié)果提示，miR-153可靶向調(diào)控SORBS2。

Figure 4. miR-153 targeted the 3’UTR of SORBS2 mRNA to regulate its protein expression. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsmiR-Con group;#P<0.05vsanti-miR-Con group.
圖4 miR-153靶向H9C2細(xì)胞SORBS2 mRNA 3’UTR而調(diào)控其蛋白表達(dá)

5 過(guò)表達(dá)SORBS2抑制LPS誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞炎癥因子分泌和細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞活力

與LPS+pcDNA組相比，LPS+pcDNA-SORBS2組H9C2細(xì)胞中SORBS2的蛋白表達(dá)顯著升高，TNF-α和IL-6的含量均顯著降低，細(xì)胞活力顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5。這一結(jié)果提示SORBS2可抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放和細(xì)胞凋亡。

Figure 5. The effects of SORBS2 protein over-expression on the releases of TNF-α and IL-6, cell viability and apoptosis of H9C2 cells. A: the protein level of SORBS2 was detected by Western blot; B and C: the levels of TNF-α and IL-6 were detected by ELISA; D: the cell viability was detected by MTT assay; E: the apoptosis rate was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPBS group;#P<0.05vsLPS+pcDNA group.
圖5 心肌H9C2細(xì)胞SORBS2蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)TNF-α和IL-6釋放、細(xì)胞活力和凋亡的影響

6 敲減SORBS2的表達(dá)可部分抵消抑制miR-153對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞的保護(hù)作用

與 LPS+anti-miR-Con組相比，LPS+anti-miR-153組的H9C2細(xì)胞中SORBS2蛋白表達(dá)顯著升高，TNF-α和IL-6的含量均顯著降低，細(xì)胞活力顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低；與LPS+anti-miR-153+si-Con組相比，LPS+anti-miR-153+si-SORBS2組的H9C2細(xì)胞中SORBS2蛋白表達(dá)顯著降低，TNF-α和IL-6的含量均顯著升高，細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖6。上述結(jié)果提示，miR-153通過(guò)抑制SORBS2的表達(dá)，促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放和細(xì)胞凋亡。

Figure 6. The effects ofSORBS2expression knock-down on the releases of TNF-α and IL-6, cell viability and apoptosis of H9C2 cells with inhibition of miR-153 expression. A: the protein level of SORBS2 was detected by Western blot; B and C: the levels of TNF-α and IL-6 were detected by ELISA; D: the cell viability was detected by MTT assay; E: the apoptosis rate was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLPS+anti-miR-Con group;#P<0.05vsLPS+anti-miR-153+si-Con group.
圖6 敲減心肌H9C2細(xì)胞中SORBS2表達(dá)對(duì)抑制miR-153產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)的影響

討 論

據(jù)報(bào)道，很多miRNA參與了多種心臟疾病的發(fā)展，有報(bào)道稱miRNA不僅控制心律失常的發(fā)生，而且還參與心肌細(xì)胞死亡的調(diào)控[6-8]。此前，miR-153已被證明可以抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[9-11]。盡管已經(jīng)在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)靶點(diǎn)，miR-153在心肌細(xì)胞中的作用機(jī)制仍有待充分闡明。Zou等[12]在心肌缺血再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，H2O2刺激下miR-153的表達(dá)明顯增加，并且內(nèi)源miR-153的抑制可減少細(xì)胞的凋亡，miR-153抑制氧化應(yīng)激過(guò)程中的自噬，并且Mcl-1小干擾RNA有效地消除了其自噬誘導(dǎo)和凋亡抑制的作用，闡明了miR-153通過(guò)細(xì)胞凋亡和自噬調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激過(guò)程中心肌細(xì)胞存活的新機(jī)制，其與靶向Mcl-1直接介導(dǎo)密切相關(guān)，提示miR-153在治療心血管疾病中的潛在臨床價(jià)值。本研究構(gòu)建了LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷模型，通過(guò)RT-qPCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-153的表達(dá)異常的升高，這與Zou研究的結(jié)果相一致；深入研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-153可下調(diào)炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，這是首次報(bào)道m(xù)iR-153對(duì)心肌細(xì)胞損傷的炎癥反應(yīng)和凋亡的影響，為miR-153在心肌損傷中的功能研究及機(jī)制探索奠定了基礎(chǔ)，推進(jìn)了miR-153在心血管疾病中潛在治療價(jià)值的進(jìn)一步深入研究。通過(guò)生物信息學(xué)分析和雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-153可靶向負(fù)調(diào)控SORBS2，這說(shuō)明miR-153的作用與調(diào)控下游基因SORBS2有關(guān)，揭示了靶向SORBS2為miR-153在心肌細(xì)胞中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之一。

SORBS2在機(jī)體多種組織中廣泛表達(dá)，尤其在心臟中表達(dá)最高，其參與細(xì)胞信號(hào)通路、細(xì)胞骨架[13]。趙穎等[14]運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)先天性心臟患者組織標(biāo)本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，SORBS2在心臟中的表達(dá)量異常升高，且其對(duì)先天性心臟病的影響不顯著，但是推測(cè)出SORBS2在心肌病變等心臟疾病中具有一定的作用。Kakimoto等[15]發(fā)現(xiàn)，SORBS2在心肌梗死患者組織中表現(xiàn)出異常降低。王惠等[16]通過(guò)腹腔注射LPS制造膿毒性心肌病小鼠模型，通過(guò)miRNAs芯片篩選發(fā)現(xiàn)，miR-21-3p表達(dá)異常升高，且與SORBS2存在內(nèi)源性靶向調(diào)控關(guān)系，共同發(fā)揮對(duì)小鼠心功能、自噬、線粒體及生存的調(diào)控，揭示了miR-21-3p通過(guò)靶向抑制SORBS2調(diào)控膿毒癥心肌病的發(fā)生發(fā)展。本研究檢測(cè)了LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中SORBS2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，SORBS2異常降低，這與趙穎、王惠的研究結(jié)果相呼應(yīng)，也是國(guó)內(nèi)外首次公開(kāi)報(bào)道SORBS2在體外炎性心肌細(xì)胞中的異常表達(dá)，為進(jìn)一步進(jìn)行SORBS2的體外功能研究奠定了基礎(chǔ)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SORBS2可下調(diào)炎性因子TNF-α和IL-6的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，這些研究結(jié)果說(shuō)明SORBS2參與炎癥心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、炎癥及凋亡過(guò)程，為研究SORBS2的作用機(jī)制提供參考依據(jù)，推測(cè)SORBS2具有心血管疾病治療的潛力。此研究還發(fā)現(xiàn)，抑制SORBS2可逆轉(zhuǎn)抑制miR-153對(duì)LPS誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞抗炎、抗凋亡及提高細(xì)胞活力的作用。

綜上所述，miR-153可加重心肌細(xì)胞的損傷，其機(jī)制與靶向SORBS2有關(guān)。本研究可能為心血管疾病的治療提供新靶點(diǎn)。