miR-149對急性心肌梗死的調(diào)控作用研究

張 睿 劉宏揚 尹 鵬

心肌梗死(MI)是臨床上常見的一種心血管系統(tǒng)疾病，具有全球性、發(fā)病率高和死亡率高等特點，是指冠狀動脈出現(xiàn)急性堵塞，導(dǎo)致部分心肌缺血，從而引起缺血性壞死的疾病?；颊咭话惚憩F(xiàn)為嚴重心絞痛，常有胸部疼痛不適、煩躁、呼吸困難、頭暈、心跳加快或不規(guī)則、惡心、嘔吐等癥狀，并且含服硝酸甘油不可緩解。據(jù)統(tǒng)計，約一半的急性心肌梗死患者會出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥，從而導(dǎo)致患者死亡[1，2]。研究顯示，人體內(nèi)約有半數(shù)以上的基因受miRNA的直接或間接調(diào)控，miRNA的異常表達和很多疾病的發(fā)生及發(fā)展都有著密切聯(lián)系?，F(xiàn)階段，miRNA已廣泛應(yīng)用于心血管疾病領(lǐng)域，如細胞的分化、增殖、生長，以及凋亡等多個生理環(huán)節(jié)，對心血管疾病的各種生理、病理發(fā)生發(fā)展過程都有著很大影響，例如急性心肌梗死、心肌細胞纖維化和心肌肥大等[3～5]。本研究選取C57BL/6J雄性小鼠100只作為研究對象，從而探討miR-149在心肌梗死疾病過程中的調(diào)控作用和分子機制。

1.資料與方法

1.1 臨床資料 選取100只C57BL/6J雄性小鼠作為研究對象，并將其以隨機數(shù)字表法均分為5組：假手術(shù)組(Sham組)、心肌梗死組(MI組)、心肌梗死+陰性對照組(MI+NC組)、心肌梗死+過表達miR-149組(MI+過表達miR-149組)以及心肌梗死+敲減miR-149組(MI+敲減miR-149組)，每組有小鼠20只，小鼠均為8周齡，體重為18～20g。

1.2 方法

1.2.1 研究miR-149在心肌梗死小鼠中的表達：假手術(shù)組(Sham組)和心肌梗死組(MI組)小鼠造模后飼養(yǎng)4周，收集小鼠心尖的心肌組織，采用動物組織總RNA提取試劑盒提取心肌細胞總RNA[6，7]；收集小鼠血清，采用血清總RNA提取試劑盒提取小鼠血清總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)檢測目的基因(miR-149)的相對表達水平，以研究miR-149在心肌梗死小鼠心肌組織和血清中的表達。

1.2.2 研究miR-149對心肌梗死的調(diào)控作用：小鼠造模后飼養(yǎng)4周，采用超聲心動圖檢測各組小鼠左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室短軸短縮率(LVFS)和左室射血分數(shù)(LVEF)；應(yīng)用Masson染色和HE染色觀察心肌組織形態(tài)和病理學(xué)改變；應(yīng)用LDH試劑盒檢測各組血清中LDH的含量；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠血清樣本中肌鈣蛋白T(cTnT)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平，以研究miR-149對心肌梗死的調(diào)控作用。

1.2.3 研究miR-149對心肌細胞凋亡的調(diào)控作用：小鼠造模后飼養(yǎng)4周，應(yīng)用TUNEL染色檢測小鼠心肌細胞凋亡情況；應(yīng)用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)和western blot實驗檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bak、caspase-3、Bcl-2的表達情況，以研究miR-149對心肌細胞凋亡的調(diào)控作用。

1.2.4 研究miR-149調(diào)控心肌梗死的分子機制：小鼠造模后飼養(yǎng)4周，應(yīng)用western blot實驗檢測AMPK、Wnt通路、Notch通路等相關(guān)蛋白的表達情況，以研究miR-149調(diào)控心肌梗死的分子機制。

1.3 評價指標 按照上述研究方法，統(tǒng)計并比較5組小鼠相關(guān)指標的表達情況，從而探討miR-149在心肌梗死小鼠中的調(diào)控作用及其分子機制[8，9]。

2.結(jié)果

2.1 小鼠miR-149表達量的比較 通過上述方法，與Sham組相比，MI組和MI+NC組的miR-149的表達量均升高；MI+敲減miR-149組小鼠miR-149的表達量低于MI組和 MI+NC組，差異明顯且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 小鼠miR-149表達量的比較

2.2 小鼠體內(nèi)促凋亡相關(guān)基因蛋白表達的比較 通過上述方法，與Sham組相比，MI組和MI+NC組的Bak表達量上升，而Bcl-2、PI3K、p-ATK等的蛋白表達量下降(P<0.01)；MI+敲減miR-149組小鼠的Bax蛋白表達量相較于MI組和MI+NC組下降，而Bcl-2、PI3K、p-ATK等上升，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 小鼠體內(nèi)促凋亡相關(guān)基因蛋白表達的比較

3.討論

心肌梗死是一種常見的冠狀動脈疾病，近些年來我國急性心肌梗死的患病率和死亡率在逐年上升，已經(jīng)成為危害人們生命健康的重大疾病之一?，F(xiàn)階段，臨床上主要根據(jù)患者的臨床癥狀、心電圖以及心肌標志物(如Mb、cTnI、CK-MB)等進行診斷，但心肌標志物的檢測目前還存在局限性，因此尋找新的急性心肌梗死生物診斷標志物具有重要意義。microRNA是一類廣泛存在于真核生物中內(nèi)源性表達的小分子非編碼單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后可負向調(diào)節(jié)基因的表達水平，從而對疾病有一定的調(diào)控作用。據(jù)報道，在急性心肌梗死的進展過程中，患者均存在miRNA的異常表達譜，臨床上可將特異性表達的miRNA作為急性心肌梗死早期診斷的分子標記物。此外，miRNA還可影響心肌細胞的生物學(xué)功能，進而對急性心肌梗死的發(fā)生及發(fā)展過程造成影響。

在本研究中，與Sham組比較，MI組和MI+NC組小鼠的miR-149的表達量均有所升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而MI+敲減miR-149組小鼠的miR-149的表達量小于MI組和MI+NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與Sham組比較，MI組和MI+NC組小鼠的Bax蛋白表達量有所上升(P<0.01)，而Bcl-2、PI3K和p-AKT蛋白表達量下降(P<0.01)；與MI組和MI+NC組相比較，MI+敲減miR-149組小鼠的Bax蛋白表達量下降(P<0.01)，Bcl-2、PI3K、p-AKT蛋白表達量上升(P<0.01)；因此，我們可認為miR-149在心肌梗死小鼠的心肌組織中表達較高，降低其表達可抑制細胞凋亡，從而抑制心肌梗死的發(fā)生和發(fā)展。